镇肝熄风汤载药脑脊液对MPP+诱导的PC12细胞c-Jun磷酸化的影响

帕金森病是一种典型的中枢神经退行性运动疾病, 多见于中老年人, 临床症状为:静置性振颤, 肌僵直, 动作迟缓等。帕金森有许多致病因素, 发病机制尚未完全研究清楚, 但基底神经节黑质致密部的多巴胺神经元死亡是其共同特征[1]。有研究认为, 凋亡可能在PD发病过程中起重要作用, 而JNK通路可能与PD发病密切相关。镇肝熄风汤出自医家张锡纯之《医学衷中参西录》, 具有平肝镇逆降冲的功效。研究表明其能促进低氧诱导因子-1α表达, 拮抗脑细胞缺氧, 保护脑组织[2]。本研究采用脑脊液药理实验方法, 观察传统经方镇肝熄风汤对MPP+诱导PC1 2细胞c-J un磷酸化的影响。

1 材料

1.1 动物及细胞株

SD雄性大鼠, 体重 (190~210g) , 购于北京维通利华实验动物技术有限公司。PC12细胞株购于中科院上海细胞库, 在DMEM高糖培养液 (pH7.0) 、37℃、5%CO2的孵育箱中培养。培养液含3.7%的碳酸氢钠、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10%胎牛血清和1%谷氨酰胺。

1.2 药品与试剂

镇肝熄风汤由怀牛膝30g、代赭石30g、龙骨30g、牡蛎30g、龟板30g、玄参15g、天冬15g、白芍30g、茵陈15g、川楝子10g、麦芽30g、甘草6g组成。中药水煎、过滤、浓缩后, 令每毫升含生药2g, 储存于4℃冰箱中备用。DMEM高糖培养基 (Gibco公司) ;胎牛血清 (hyclone公司) ;MPP+ (Sigma公司) ;蛋白提取试剂盒 (碧云天公司) ;BCA蛋白浓度测定试剂盒 (碧云天公司) ;p-c-jun兔抗鼠多克隆抗体、c-jun抗鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记IgG二抗 (Santa公司) 。

2 方法

2.1 镇肝熄风汤载药脑脊液 (CSF-ZGXF) 制备

SD雄性大鼠按含生药28g/kg给予镇肝熄风汤水煎剂, 正常对照组给予同体积生理盐水。最后1次给药1.5h后, 3%的水合氯醛麻醉SD大鼠, 颈后部备皮并用75%酒精消毒。从大鼠枕骨大孔进行无菌穿刺并缓慢抽出脑脊液。脑脊液3000rpm4℃离心10min, 收集上清液用0.22μm滤膜过滤, -80℃冻存备用。

2.2 药物处理

实验分空白对照组、MPP+对照组、CSF-ZGXF组, 共3组。PC12细胞经0.125%胰蛋白酶消化后以1×105细胞/cm2接种于96孔培养板培养24h。各组细胞加入CSF或培养基, 在37℃, 5%CO2饱和湿度孵育箱内培养30min后, 正常对照组加入培养基, 其他2组分别加入含250μmol/L MPP+的DMEM培养基, 细胞继续培养72h。

2.3 Western blotting检测PC12细胞p-c-jun蛋白表达

采用细胞蛋白抽提试剂盒提取PC12细胞蛋白质, 提取的蛋白质保存于-70℃低温冰箱备用。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测提取样品中蛋白质的浓度后, 将蛋白质50μg加入2×SDS凝胶加样缓冲液中经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。胶中蛋白质在70mA恒流状态下4℃过夜电转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜经5%脱脂奶粉在37℃封闭2h。加入一抗c-jun (1∶1500) 和p-c-jun (1∶1000) , 硝酸纤维素膜4℃孵育过夜。与辣根过氧化物酶标记的二抗IgG (1∶5000) 37℃孵育1h。用western blotting印迹荧光发光检测试剂盒曝光、压片。western blotting检测结果采用AlphaImager (tm) 图像分析系统扫描, 利用AlphaEaseFC软件中SpotDenso功能测定积分光密度值。

2.4 统计学分析

结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析。各组之间差异的显著性分析采用2组独立样本的t检验。

3 结果

western blotting检测PC12细胞p-c-Jun蛋白表达 (图1和表1) 结果显示, 与正常对照组比较, MPP+组p-c-Jun表达显著上调。与MPP+组, CSF-ZGXF组的p-c-Jun蛋白的表达显著降低。

4 讨论

帕金森病病机复杂, 在短期内要获得很好的疗效, 则有一定困难。西医目前临床治疗PD, 主要是应用L-多巴等DA替代疗法, 虽能使PD患者的临床症状在一定时间内获得一定程度的好转, 但均不能阻止本病的自然进展, 且各种药物都有不同程度的毒副反应, 因而限制了其自身在临床上的应用[3]。因此研制安全、有效、可控的药物是当前乃至今后医学科研的重点。挖掘中医学宝库, 筛选有效且毒副作用小的方药越来越受到学者的关注。

采用中药及复方直接进行体外实验, 难以反映机体真实血药浓度下的药理作用及变化规律, 阻碍了中药作用物质基础和作用机制研究的发展。血清药理学在方法学上解决了中药复方提取物直接应用于离体实验的难点, 可以研究进入体内的中药有效成分或其代谢产物的药理作用。在体外进行中药对神经保护作用研究时, 由于血脑屏障的存在, 使脑的内环境、神经元生存的微环境与身体血液系统有着显著的不同, 而且药物是否能透过血脑屏障成为研究中药神经保护作用的关键。同时, 由于血清中含有多种活性酶及蛋白, 对神经细胞均有一定的影响。基于此, 梅建勋等用含药脑脊液代替含药血清, 建立了中药脑脊液药理学方法。本研究采用脑脊液药理学方法克服了中枢神经系统存在血脑屏障的问题, 同时排除了体外实验的各种干扰因素, 可直接以观察镇肝熄风汤作用于中枢神经系统的药效学效应。

丝裂原激活的蛋白激酶是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递。从细胞外刺激作用于细胞, 至细胞出现相应的生物学效应, 其间通过了MAPK信号转导通路多级蛋白激酶的级联反应。JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一。JNK的活化是通过其氨基酸残基磷酸化, 一旦被激活, 胞浆中的JNK移位到细胞核。活化的JNK可以和c-Jun的氨基末端区域结合, 使转录因子的活性区域发生磷酸化。c-Jun属于亮氨酸拉链家族成员, 它以同二聚体或异二聚体复合物的形式和许多基因启动子上的AP-1 (activator protein-1) 和AP-1样位点结合, 提高AP-1的转录活性。研究提出将JNK下游底物c-Jun的显性阻滞突变体转染至NGF诱导分化的PC-12细胞中, 发现该突变体可以抑制MEKK1及NGF撤除诱发的细胞凋亡。最近一些研究也证实JNK通路的激活与细胞凋亡有密切关系。c-Jun的过度激活与表达能提高转录因子复合物AP-1的DNA结合活性, 促进多种凋亡蛋白的表达, 从而启动下游级联反应导致细胞凋亡。

本研究发现, 与空白对照组比较, CSF-ZGXF组p-c-jun蛋白表达显著升高;与MPP+组比较, CSF-ZGXF组p-c-jun蛋白表达显著降低, 表明CSF-ZGXF对MPP+诱导的c-jun磷酸化具有一定抑制作用。因此, 我们推测, 镇肝熄风汤可能通过抑制c-jun磷酸化, 从而起到对PC12细胞的损伤保护作用, 进而发挥抗PD作用。

摘要：目的 探讨镇肝熄风汤载药脑脊液对甲基-苯基-吡啶离子 (1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+) 诱导的PC12细胞c-Jun磷酸化的影响。方法 镇肝熄风汤载药脑脊液预处理体外培养的PC12细胞后, 加入MPP+诱导PC12细胞损伤模型。用Western blotting检测c-Jun和phospho-c-jun蛋白表达。结果 MPP+处理72h, 与空白对照组比较, 模型组phospho-c-jun蛋白表达显著上调, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。与模型组比较, 镇肝熄风汤载药脑脊液组phospho-c-jun蛋白表达显著下调, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。而各组之间c-jun蛋白表达无显著性差异 (P>0.05) 。结论 镇肝熄风汤载药脑脊液对MPP+诱导的PC12细胞c-Jun磷酸化具有抑制作用。

关键词：帕金森病,镇肝熄风汤,载药脑脊液,c-Jun,1-甲基-4-苯基吡啶离子

参考文献

[1] Naoi M, Maruyama W.Cell death of dopamine neurons in aging and Parkinson's disease[J].Mech Ageing Dev, 1999, 111 (2～3) :175～188.

[2] 夏荣蓉, 吴颢昕, 姜惟.镇肝熄风汤对实验性脑出血大鼠低氧诱导因子-1α的影响[J].中华实用中西医杂志, 2005, 7 (18) :958～959.

[3] 高敏, 郭彩红, 林莹莹.帕金森病的中医临床研究进展[J].辽宁中医药大学学报, 2010, 12 (2) :11～13.

[4] Bochu W, Liancai Z, Qi C.Primary study on the application of Serum Pharmacology in Chinese traditional medicine[J].Colloids Surf B Biointerfaces, 2005, 43 (3～4) :194～197.