高血糖对6-OHDA诱导的PD模型大鼠行为学的影响

帕金森病( PD) 是最常见的神经系统退行性疾病之一, 临床症状包括静止性震颤,肌强直和运动迟缓等[1]。 除遗传因素外,非遗传因素的影响:如老龄化,接触杀虫剂,饮食,肥胖及糖尿病均与PD的发生发展密且相关[2,3]。 研究表明,糖尿病伴随着更高的帕金森评定量表 (UPDRS)运动功能评分[4],糖尿病发生肌肉强直和步态异常的比例显著高于其他未患糖尿病的老年人[5]。

故该研究在高糖高脂饮食联合链脲佐菌素建立糖尿病模型的基础上,6-羟多巴胺(6-OHDA)单侧毁损法建立高血糖-PD大鼠模型,探讨高血糖对PD大鼠行为学的影响。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠90只 ,体重 (200±10)g,2~3月龄,购于新疆医科大学第一附属医院医学研究中心实验动物科学研究部。 在室温18~22℃, 湿度50%~60%,明暗周期12/12 h环境中饲养,自由摄食、饮水。 实验开始前适应环境1周。

1.1.2主要药物及仪器链脲佐菌素(Streptozotocin STZ), 6- 羟多巴胺 (6-hydroxydopamine,6- OHDA), 阿朴吗啡 (apomorphine, Apo)(均购于美国Sigma公司 ),大鼠脑立体定位仪,瑞特血糖仪。

1.2 大鼠模型的制备

90只SD大鼠随机分为正常对照组 (n=5), 假手术组(n=10),糖尿病组(n=20),PD组(n=20)和高血糖-PD组 (n=35)。

1.2.1 糖尿病大鼠模型的制备 高脂高糖饮食联合 1 次性腹腔注射链脲佐菌素的方法制备糖尿病大鼠模型[6]。基础饲料:碳水化合物占53%,脂肪占5%,蛋白质占23%。 高糖高脂饲料:基础饲料60%、蔗糖20%、猪油10%、 蛋黄粉8%、胆固醇2%。

糖尿病组,高血糖-PD组的55只大鼠给予高糖高脂饲料喂养4周。 4周后,一次性腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg,3 d后尾静脉取血,用瑞特血糖仪测定大鼠随机血糖,若随机血糖≥16.7 mmol/L,确定为糖尿病成模大鼠。 2周后再测血糖,血糖值居高不下证明模型稳定, 选入正式实验。

1.2.2 PD模型的制备对高血糖PD组中糖尿病模型成功的大鼠及PD组大鼠,采用6-OHDA单侧毁损法建立实验性PD大鼠模型[7,8]。

腹腔注射30 mg/kg水合氯醛将大鼠麻醉,固定于脑立体定向仪,参照包新民[9]等所著的大鼠脑立体定向图谱,分别确定右侧黑质致密部(Substanianigta Parscompact,SNc) 和中脑腹侧被盖 (Ventral Tegmental,VTA) 坐标:SNc:前囟后(5.0±0.1) mm,矢状缝右侧(1.5±0.1) mm, 硬膜下(7.8±0.1) mm;VTA:前囟后(4.6±0.1) mm,中线右侧(0.9±0.1) mm,硬膜下(7.3±0.1) mm。 按确定坐标的位置用牙科钻小心钻透颅骨,将10 u L的微量注射器连接于微量推进器上, 垂直入颅, 缓慢进针到预定深度,向SNc和VTA每点注射8 ug 6-OHDA(溶于4 u L含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水中),留针10 min缓慢退针(1 mm/min),骨蜡覆盖钻孔,常规缝合伤口。 连续腹腔注射青霉素5万单位3 d预防感染。 手术后4周, 腹腔注射0.5 mg/kg阿扑吗啡注射液, 人工记录注射后10~40 min时段大鼠内旋转圈数。 若大鼠恒定转向左侧, 旋转圈数> 7 r/min或者> 210r/30 min, 则视为成功PD模型。

1.2.3假手术组用PD模型制备的方法向右侧SNc和VTA各注射4 u L生理盐水(仅含质量分数为0.2%抗坏血酸)。 正常对照组: 不注射任何药物。

1.3 行为学分析

在模型成功后第七,十四,二十一,二十八天,固定时间1次/周分别行以下行为学测试。

1.3.1自发行为不对称分析观察大鼠30 min的异常不自主行为,包括缩头;拱背;尾巴僵硬、上翘;头颈、躯干向对侧侧弯和扭转,严重者出现姿势不稳;损毁对侧上肢节律性不自主拍击动作。 将观察结果评分,综合评分等于各部评分之和,记录数据。

评分标准:1头部运动灵活(0分)、缩头时间<5 min (3分)、缩头时间>5 min(5分);2背部运动灵活(0分)、 拱背时间<10 min(3分)、拱背时间>10min(5分);3尾巴柔软运动灵活(0分)、尾巴僵硬离开地面(3分)、尾巴僵硬上翘弯向背部 (5分); 4头颈躯干运动灵活(0分)、头颈躯干向对侧侧弯和扭转(3分)、姿势不稳(5分);5四肢运动灵活无不自主运动(0分)、损毁对侧上肢节律性不自主拍击动作1~3次(3分)、损毁对侧上肢节律性不自主拍击动作>3次(5分)。

1.3.2姿势不对称性分析提起鼠尾将大鼠悬空于实验台上方约10 cm处,观察大鼠头或身体转动的方向,连续做20次,其中向未损伤侧转动所占的频率作为评价指标[10]。

1.3.3 僵直实验 (Catalepsy test) 将大鼠的前肢 置于 9 cm 高的横杆上,秒表记录前肢移动的潜伏时间,单位为s[11]。

1.3.4 旋 转行为分析 腹腔注射 0.5 mg/kg 阿 扑吗啡注 射液,人工记录注射后 10~40 min 时段大鼠内旋转圈数。

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0进行数据分析,计量数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型成功率

在动物模型制备过程中,假手术组有1只大鼠死亡; 糖尿病组有3只死亡,模型成功14只(70%);PD组模型成功12只(60%)。高血糖-PD组模型成功18只(51.4%)。

2.2 行为学分析结果

行为学分析发现,PD组及高血糖-PD组自发行为不对称分析评分明显增加,且两组评分随时间延长逐渐增加(F=53.04,P<0.01)(如图1);向未损伤侧转动所占的频率明显增加(F=54.30,P<0.01)(图2);前肢潜伏时间明显延长(F=53.04,P<0.01)(图3)。 与正常组,假手术组及糖尿病组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 组内比较

高血糖-PD组自发行为不对称分析评分较PD组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。实验第二周后, 高血糖-PD组前肢潜伏时间较PD组明显延长,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 旋转行为分析

PD组及高血糖 -PD组注射Apo可诱发异常旋转行为, 旋转时多以右侧后肢为支点身体向右侧弯曲,呈头尾相接状态,以旋转次数≥210次 /30 min为阳性标准, 随时间延长,两组旋转圈数逐渐增加,差异有统计学意义(F=44.04,P<0.01)(图4)。 但高血糖-PD组及PD组旋转圈数差异无统计学意义(F=1.04,P>0.05)。

3 讨论

6-OHDA单侧损毁模型是目前使用得最多的PD模型之一,这种模型最突出的优点是药物诱发的旋转行为可被量化,因而一致公认为是运动缺陷机制研究的优良模型[12]。 在此研究中,PD模型成功率为60%,其成功率与文献[13]报道的30%~70%相近,在后续的旋转实验中,大鼠旋转行为稳定,旋转行为随时间延长逐渐加重, 与文献报道相似。 提示该实验制备的模型是基本可靠的。 而高血糖-PD模型成功率为50%,是否与高血糖有关,还有待于进一步的研究证实。

在自发行为不对称性研究中,大鼠行为评分在高血糖-PD组模型成功1周后就与PD组有显著差异,且随时间延长,运动评分逐渐增大。 同时高血糖-PD组僵直时间从第二周开始较PD组明显增加。 上述结果提示,高血糖可能加重PD大鼠的运动不协调能力,随时间延长, 高血糖对PD大鼠行为学影响会逐渐加重;但高血糖对PD大鼠旋转能力未见明显影响 。 目前的研究表明 ,持续高血糖引起机体组织的代谢紊乱,可侵犯感觉神经、 运动神经和自主神经,累及运动神经严重者可导致运动功能障碍;研究证实高血糖对轴性体征、强直及震颤均有加重作用[14],其可能为PD的危险因素。 该实验证实, 高血糖会加重PD大鼠自发行为不对称及运动不协调性,从行为学角度证实高血糖可能会加重PD患者的临床症状。

综上所述,该文从行为学方面对高血糖与PD之间的关系进行阐述,证实高血糖会加重PD大鼠的临床症状,但是,对于高血糖与PD之间关系的具体机制目前尚未完全阐明,其有待与下一步的进一步研究。

摘要：目的 在建立糖尿病SD大鼠模型的基础上,6-OHDA单侧毁损法建立高血糖-PD大鼠模型,探讨高血糖对PD大鼠行为学的影响。方法 90只SD大鼠随机分为正常对照组(n=5),假手术组(n=10),糖尿病组(n=20),PD组(n=20)及高血糖-PD组(n=35)。采用高糖高脂饮食联合一次性腹腔注射链脲佐菌素的方法制备糖尿病模型,高血糖SD大鼠以6-OHDA立体定向两点单侧注射至右侧黑质致密部(SNc)和中脑腹侧被盖(VTA),制备高血糖-PD大鼠模型。术后不同时间点(第七、十四、二十一、二十八天)进行行为学分析(自发行为不对称性,姿势不对称性,僵直实验,旋转实验)。结果PD组及高血糖-PD组自发行为不对称性,姿势不对称性及僵直实验,旋转实验中各项实验指标与正常对照组,假手术组,糖尿病组比较,差异有统计学意义(P<0.01);高血糖-PD组在自发行为运动评分,僵直实验的指标与PD组相比有显著差异;随时间延长,PD组及高血糖-PD组自发行为不对称评分逐渐增大,旋转圈数逐渐增加;高血糖对PD大鼠旋转能力无明显影响。结论 高血糖可加重PD大鼠的运动不协调能力,随时间延长,高血糖对PD大鼠行为学影响会逐渐加重。

关键词：帕金森病,6-羟多巴胺,链脲佐菌素,动物模型