番茄毛状根诱导影响因素研究进展

毛状根培养技术是在植物基因工程和植物细胞工程相互融合基础上发展的一种新的培养技术[1]。毛状根发根是由发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 侵染双子叶植物、裸子植物或少数单子叶植物, 在植物侵染部位或周围产生大量不定根, 而获得的毛状根所再生的植株, 不仅表现出抗逆境能力强、叶片皱缩、节间缩短等现象, 而且还能提高产量, 次生代谢含量很大程度上高于原品种。国外已利用发根农杆菌获得次生代谢产物, 在这方面有深入的研究, 其中许多植物 (如紫草、甜菜、萝卜、长春花等) 的发根已进行工业化生产;国内在利用发根农杆菌获得转基因植物和生产次生代谢方面也取得了可喜的成绩, 获得了油菜、甘草、甘蓝、决明、西洋参、番茄等植物的发根, 有的还得到了转基因植物, 有的在发根中检测到了次生代谢[2]。

番茄红素 (Lycopene) 是一种天然类胡萝卜素, 而类胡萝卜素也是三大次生代谢产物之一 (萜烯类化合物) , 其猝灭单线态氧和清除自由基能力是最强的[3]。番茄红素具有抗氧化能力, 能有效降低癌症、心血管病、血脂病、血糖病等多种疾病的发病率, 能增强免疫细胞活性, 预防骨质疏松, 抗炎症、抗凝血, 降低总胆固醇含量等[4,5,6,7,8,9,10,11]。番茄红素主要存在于番茄、西瓜、葡萄柚和番石榴等植物中, 其中以番茄相对含量最高, 达到0.2~20 mg/100 g, 但绝对含量依然很低, 且不同品种及不同成熟程度含量也明显不同[12]。毛状根培养技术是提高番茄中番茄红素最有效的途径之一, 而发根农杆菌的菌株类型、外植体的类型、预培养和共培养时间、侵染时间和菌液浓度、抗生素及外源生长调节剂和化学因子均是发根农杆菌诱导番茄产生毛状根的影响因素。本文就近些年番茄毛状根研究进展进行系统阐述, 并对番茄毛状根诱导问题作展望。

1 发根农杆菌的生物学特征及分类

发根农杆菌是一种寄生非常广泛的土壤细菌[13], 为根瘤科 ( Rhizobiaceae ) 农杆菌属 (Agrobacterium ) 的一种革兰氏阴性菌, 外形呈杆状, 具鞭毛, 其内具有诱导毛状根产生的Ri质粒[2], Ri质粒是发根农杆菌染色体外一个巨大的侵入性根诱导质粒, 为共价闭合环状DNA, 大小为200~800 kb, 具有独立的遗传复制能力, 按其功能的不同主要有T-DNA区 (Transfer-DNA region) 、Vir区 ( Virulence region ) 、 Ori区 ( Origin of replication) 、冠瘿碱代谢功能区 (OPCA, Opine catabolism region) [14]。T-DNA区意为“转移进入植物细胞核的转移区”, Vir意为“致瘤区”。

发根农杆菌侵染植物后, T-DNA在Vir区的胁迫下能够转移并整合到植物基因组中, 利用植物的营养成分编码合成冠瘿碱, 根据侵染产生冠瘿碱种类的不同, Ri质粒可以分为农杆碱 (agropine) 型、黄瓜碱 (cucronpine) 型、甘露碱 (mannopine) 型和异黄瓜碱 (mikimonpine) 型, 其中含农杆碱型Ri质粒上的菌株具更广泛的宿主范围和发根性[15]。

2 发根农杆菌诱导毛状根的影响因素

2.1 菌株类型

目前常用的发根农杆菌菌株有ATCC15834、R 1 0 0 0 、 A 4 、 R 1 6 0 1 、 C 5 8 C 1 等, 在诱导植物产生毛状根的菌株中, A 4 菌株使用率 ( 2 7 % ) >ATCC15834 (20%) > R1601 (14%) ;不同植物对于不同菌株的敏感性差异较大[16], 同种植物对于不同菌株的敏感性也有一定的差异。胡霄等[17]以番茄子叶为外植体, 选用R1000、A4和ATCC15834菌株对其进行转化, 结果表明, 当番茄苗龄为12~16 d、菌液浓度OD600=0.4~0.6时, A4菌株 (29.6%) 的诱导率均大于R1000 (7.4%) 和ATCC15834 (17.3%) 。郝瑞文[18]利用A4、9402Bin19、ATCC15834这3个发根农杆菌菌株感染怀牛膝的叶切片和茎段外植体, 获得毛状根转化体系, 并筛选了优质株系, 其中3个菌株诱导毛状根的频率明显不同, ATCC15834的转化频率最高, 为60%~80%, A4的转化频率为40%~55%, 9402Bin19的转化频率最低, 为30%~40%。因此, 利用不同菌株转化同一植株部位, 或利用同种菌株转化同一植株不同部位, 或利用同种菌株转化同一植株同一部位的不同生理期, 毛状根诱导率均存在差异。

2.2 外植体类型

发根农杆菌已在许多植物 (番茄、棉花、人参等) 的外植体上诱导出毛状根, 不同外植体 (叶片、茎、子叶、愈伤组织、下胚轴等) 诱导植株产生毛状根存在差异。黄彩红等[19]利用发根农杆菌对2个番茄品种 (P2 6和组培大黄) 的子叶、下胚轴 (上、中、下部位) 4种外植体进行诱导, 结果表明, P26番茄的诱导率, 子叶 (平均为36.7%) >下胚轴中部 (28.8%) >下胚轴下部 (26.6%) >下胚轴上部 (9.5%) ;而组培大黄的下胚轴上部 (平均为24.5%) >下胚轴下部 (22.4%) >子叶 (21.2%) >下胚轴中部 (18.3%) 。胡霄等[17]利用发根农杆菌ATTCC15834对番茄无菌苗的不同部位 (子叶、下胚轴、叶片) 进行诱导并产生毛状根, 结果表明, 只有子叶能长出稳定的毛状根;下胚轴有少量毛状根产生, 但容易出现褐化, 并且不易脱菌;叶片出现褐化且无毛状根产生, 这可能是因为子叶和下胚轴的再生能力强;叶片在处理过程中容易被风干, 伤口处的细胞容易死亡, 从而影响其侵染;而下胚轴在侵染以后, 很难将其多余菌液吸干, 造成不易脱菌。一般认为, 幼嫩的、生长旺盛的植物组织对发根农杆菌更敏感, 有利于菌株的侵染, 适宜作为诱导植株产生毛状根的外植体。

2.3 预培养和共培养时间

2.3.1 预培养时间

外植体经过预培养后能促进细胞分裂, 分裂的细胞更容易整合外源DNA, 从而提高外源基因的转化效率;同时, 通过预培养还能提高外植体的适应能力, 使其能够适应离体培养的条件, 保持活跃的生长状态[20]。任永霞等[21]研究表明, 不经预培养直接侵染的3个番茄品种 (‘东农709’、‘东农7 0 8 ’和‘东农7 0 4 ’) 的子叶均变白、变褐、萎蔫, 无产生抗性愈伤组织的能力, 而经过预培养2或5 d后抗性愈伤诱导率均较高, 且不同品种间也有差别, 东农704诱导率最高 (42.2%) , 东农708其次 (28.9%) , 东农709最低 (27.9%) ;且随着预培养时间的不同, 抗性诱导率也不同, 子叶 (东农709品种外植体) 预培养2和5 d, 而后侵染10、15和20 min, 其5 d预培养且侵染10、15和20 min的抗性愈伤诱导率 (37.0%、27.9.5%和26.3%) 均大于2 d预培养且侵染10、15和20 min的抗性愈伤诱导率 (32.1%、21.6和11.6%) 。

2.3.2 共培养时间

共培养时间对诱导植株产生毛状根的频率也有影响, 这是因为发根农杆菌的T-DNA转移与整合需要一定的时间, 所以为了能够保证充分转化, 一般都将外植体放在不含抗生素的培养基上共培养2 d左右, 进行除菌[20]。陈双臣等[22]、刘晶等[23]和王婷婷[24]研究均表明, 共培养2 d对农杆菌介导番茄转化是最优的。

2.4 侵染时间和菌液浓度

2.4.1 侵染时间

侵染时间是影响发根农杆菌诱导植物外植体产生毛状根的关键因素。侵染时间过短, 发根农杆菌不能对植物细胞进行充分附着;侵染时间过长, 发根农杆菌则容易对植物细胞造成伤害[15]。不同的学者采用了不同的侵染时间来诱导番茄产生毛状根, 梁超[25]用OD600为0.3的菌液侵染预培养2 d的番茄子叶, 结果表明, 当侵染3、6和10 min时, 抗性芽的生成率分别是8.6%、24.8%和1.4%。王金华等[26]对预培养的天数 (1、2和3 d) 、农杆菌液的倍数 (10、20和30倍) 、侵染时间 (10、20和30 min) 、共培养天数 (1、2和3 d) 这四因素, 采用L9 (34) 正交实验, 结果表明, 预培养3 d、农杆菌的稀释倍数30倍、侵染时间20 min和共培养天数2 d, 可达到最佳的遗传转化效果。

2.4.2 菌液浓度

菌液浓度对毛状根的诱导转化也存在差异, 不同植物、不同外植体诱导毛状根所需菌液浓度不同, 菌液浓度的高低直接影响着农杆菌侵染效率[15]。番茄遗传转化所用农杆菌菌液浓度多为OD600=0.2~0.6。胡霄等[17]以番茄子叶为外植体, 在8~12 d的苗龄时, ATCC15834菌株的诱导率在侵染菌液浓度OD600=0.4~0.6时诱导率最高, 可以达到58.8%;在8~12 d的苗龄时, R1000菌株诱导率随侵染浓度增加而增加, OD600=0.2~0.4、0.4~0.6和0.6~0.8, 诱导率分别为13.0%、17.0%和25.5%。

2.5 抗生素及外源生长调节剂

在遗传转化中, 头孢霉素、卡那霉素和潮霉素是使用较广泛的抗生素, 抗生素种类和浓度对植物转化效率有不同的效果, 合适的抗生素不仅能起到良好的抑菌效果, 而且有利于植物产生毛状根。陈珍和朱诚[27]研究表明, 以卡那霉素抗性基因作为筛选标记的植物表达载体质粒p2301和p BI121, 其转化频率高于以潮霉素抗性基因为筛选标记的植物表达载体pl301;其中在MB0诱导培养基添加不同梯度 (200、400、600和800 mg/L) 的头孢霉素, 番茄子叶外植体的再生频率分别为73.33%、60%、66.7%。

毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物生长调节剂、合成次生代谢物质能力强而且稳定, 并能向培养液释放部分代谢产物等优点, 但加入适当浓度外源生长调节剂, 更能促进毛状根次级代谢产物的积累[28]。王婷婷[24]以不同生长调节剂 (ZT、IAA和GA) 及浓度进行组合, 结果表明, 番茄子叶诱导芽分化最佳的ZT与IAA组合是“MS+ZT2.0 mg/L+IAA0.1 mg/L”, 不定芽分化效率达到了95.0%。赵明珠和张美萍[29]以‘大红番茄’‘红牛奶番茄’和‘粉冠888’这3种无菌番茄苗的子叶为外植体, 对其分化培养基及生根培养基进行筛选, 结果表明, ‘粉冠888’可为遗传转化提供大量稳定的外植体来源, 适宜的分化培养基为“MS+6-BA 1.0~2.0mg/L+IAA 0.2 mg/L”, 生根培养基为“MS+IAA0.5 mg/L”。

2.6 化学因子

植物细胞能分泌某些酚类化合物, 可诱发农杆菌内Ti或Ri质粒DNA上Vir区基因的活化和高效表达, 促进农杆菌T-DNA向宿主细胞核转移, 从而提高遗传转化效率, 其中诱导效果最佳的是乙酰丁香酮 (AS) , 而AS因其较强的诱导性, 已在许多植物如毛白杨、烟草、玉米、番茄等使用, 大大提高了其转化率[30]。有些研究表明, AS必须在诱导培养液中和共培养的培养基中同时使用, 才能大大提高转化效率[31], 目前, 在大多数的研究中, 无论是诱导培养基还是共培养基, AS的有效浓度一般为50~200 μmol/L[32,33]。另外, 也有研究者认为高浓度的乙酰丁香酮对叶片有毒害作用, 但其毒害机制尚不清楚[34]。因此, 在番茄遗传转化中, AS使用浓度有待进一步探讨。

此外, 一些金属离子 (Cu2+和Ag+) 能够很好地诱导荞麦[35]和骆驼刺[36]产生毛状根。在今后番茄的遗传转化中, 也可以尝试使用一些金属离子, 以提高转化效率。

3 问题及展望

毛状根培养系统与常规植物组织培养技术相比, 具有生长快、易于培养、有效物质产量高的优点, 具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。但毛状根培养系统大多用于生产药用植物的次生代谢产物上, 在果蔬作物上应用研究很少。随着研究的不断深入, 还有一些问题待解决, 如目前发根农杆菌不同菌株侵染相同番茄品种的能力或相同菌株侵染不同番茄品种的能力差异机制尚不明确;发根农杆菌诱导番茄产生毛状根的众多因素, 相互制约、相互促进, 在众多因素寻找一个切合点 (即番茄模式植物) 至关重要;利用毛状根体系适应逆境 (干旱) 环境和生产番茄次生代谢大多处于实验研究阶段, 较少将其作为一种生物反应器应用于工业大规模生产, 这些都需要研究者进行更深入、更成熟的探究。

随着分子生物学的快速发展, 对发根农杆菌的功能及其应用方面进一步深化了解, 未来期望对Ri质粒上的rol B基因实现准确有效的转化与调控, 达到产生特定次生代谢产物、定性改良性状的目的, 从而为解决番茄生产上适应逆境 (干旱) 环境和大量生产次生代谢物及优良品种等培育体系提供一条全新的途径。

摘要：毛状根培养技术是在植物基因工程和植物细胞工程相互融合基础上发展的一种新的培养技术。毛状根培养系统与常规植物组织培养技术相比, 具有生长快、易于培养、有效物质产量高的优点。综述了发根农杆菌诱导番茄产生毛状根的影响因素, 包括发根农杆菌的菌株类型、外植体类型、预培养和共培养时间、侵染时间、菌液浓度、抗生素、外源生长调节剂和化学因子, 并对番茄毛状根诱导存在的问题进行展望。

关键词：发根农杆菌,番茄,毛状根,诱导因素

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