GPI-PLD过表达对甲状腺癌细胞株SW579生物学特征的影响

甲状腺癌是头颈部常见恶性肿瘤, 研究发现一些糖基化磷脂酰肌醇 (glycosylphosphatidylinositol, GPI) 锚定蛋白质已经成为甲状腺癌的肿瘤标志物, 如GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP) [1]和癌胚抗原 (CEA) 等[2]。目前在人体内经分子生物学证实的只有糖基化磷脂酰肌醇特异性磷酯酶D (glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D, GPI-PLD) 能在特定的情况下特异性水解GPI锚定蛋白中的肌醇磷酸脂键, 释放细胞质膜上的锚定蛋白[3]。本课题在预实验中发现甲状腺癌细胞株SW579的GPI-PLD酶活性低下。这些研究提示甲状腺癌细胞的GPI-PLD活性降低, 导致GPI锚定蛋白水解释放相应减少, 可能在甲状腺癌发病机制中起作用。但GPI-PLD及GPI锚定蛋白质是否影响甲状腺癌细胞的生长、增殖、凋亡等生物学特征, 目前尚无实验证据。本研究通过稳定转染GPI-PLD基因, 从甲状腺癌细胞增殖、凋亡及补体对肿瘤细胞的杀伤作用这3个方面来观察GPI-PLD基因过表达对SW579细胞的作用, 为探讨甲状腺癌的发病机制和可能的基因治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

甲状腺癌细胞SW579购买与武汉大学细胞宝藏中心。大肠杆菌DH5α为本室保存菌种, 重组的真核细胞表达型质粒pcDNA3.1 (+) /GPI-PLD由周俊涛博士馈赠。兔抗人β-actin抗体购自湖南长沙科泰生物公司, 逆转率试剂盒购自英俊生物公司, 为MBI公司产品, 质粒提取试剂盒购自BMI公司, 碱性磷酸酶测定试剂盒为Promega公司, CEA定量ELISA试剂盒为Sigma公司产品。

注:*表示P<0.05

1.2 重组质粒pcDNA3.1 (+) /GPI-PLD转染SW579细胞、筛选并鉴定

设立pc DNA3.1 (+) /GPI-PLD, pc DNA3.1 (+) 空白载体及空白对照组, 按照脂质体使用说明进行转染, 用G418筛选, 获得阳性克隆, RT-PCR检测GPI-PLD m RNA表达水平, GPI-P L D引物:正向5′-T T C A C G G C T C C T A T T C A-3′, 反向5′-TTCAGTTAGGGATGTAGTCA-3′, 扩增片断大小为494 bp。以GAPDH为内对照。

1.3 GPI-PLD酶活性水平测定

用购买自Sigma公司的完整GPI结构的胎盘碱性磷酸酶 (PLAP) 为底物, 通过TX-114分相, 定量检测转染细胞中GPI-PLD活性。具体步骤按已经报道的方法进行[4]。GPI-PLD酶活性计算公式为:

GPI-PLD酶活性= (待测组W管吸光度值×待测组水相体积) / (待测组T管吸光值×待测组总体积) - (对照组W管吸光度值×对照组水相体积) / (对照组T管吸光度值×对照组总体积) ×100%。

1.4 分光光度法测定GPI锚定PLAP

细胞培养48h后, 收集培养液和细胞, 超声波粉碎细胞后离心收集上清液。按试剂盒使用说明步骤加入加缓冲液和基质液, 37℃水浴1min后加入1.5mL显色剂, 立即混匀, 空白管调零, 520nm处测定各管吸光度。按照下面公式计算胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP) 的活性。

1.5 ELISA检测GPI锚定CEA

细胞培养48h后, 收集培养液, 按试剂盒使用说明步骤加入试剂, 在酶标仪上用空白孔调零, 读取450nm处的吸光度。结果计算:以CEA标准浓度用SPSS 11.0软件求解其直线回归方程, 再根据标本的平均OD450值代入直线回归方程, 求出样本的CEA浓度。

1.6 生长曲线测定

取对数生长期的细胞, 制成单细胞悬液, 分别接种于24孔板中, 每孔接种1.0×104个细胞, 每3天换1次培养基。接种后第2、4、6、8和10天每种细胞随机取3孔, 进行细胞计数, 按时间及每孔平均数绘制生长曲线。

1.7 统计学处理

数据以均数标准差表示, 采用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理, 组间数据比较采用t检验, P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR法检测GPI-PLD mRNA的表达水平

RT-PCR检测发现, 稳定转染重组质粒的SW5 79细胞组 (pcDNA/GPI-PLD组) 的GPI-PLD mRNA表达上调。灰度扫描结果表明, 转染组与转染空载体组 (pcDNA3.1组) 和未转染的SW579细胞组 (Control组) 相比, 其GPI-PLD mRNA的表达水平增加明显增加, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;而转染空载体组SW579细胞与未转染组SW579细胞相比, GPI-PLD mRNA的表达无明显变化。该结果表明高表达GPI-PLDmRNA的SW579细胞株构建成功。

2.2 细胞GPI-PLD酶活性测定结果

培养各组细胞48h, 测定GPI-PLD酶活性水平, 共测定9次。转染组 (pcDNA/GPI-PLD组) 与其他2组 (转染空载体组 (pcDNA3.1组) 和未转染的SW579细胞组 (Control组) 相比, 其GPI-PLD酶活性水平增加3～4倍, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 转染空载体组和未转染的SW579组无明显差异 (P≥0.05) 。

2.3 GPI锚定PLAP释放检测

转染空载体和未转染的2组SW579细胞, 其PLAP活性主要分布于细胞上, 而阳性转染组PLAP活性则大部分分布于细胞培养液中, 而且其细胞PLAP总活性高于前2组细胞。

2.4 不同SW579细胞释放GPI锚定CEA水平测定

细胞培养48h后, 转染组 (pcDNA/GPI-PLD组) 较转染空载体组 (pcDNA3.1组) 和未转染组 (Control组) 的SW579细胞, 其培养基上清液中CEA浓度显著提高, 具有统计学意义 (P<0.01) , 增高水平达9倍 (表1) 。而转染空载体组和未转染的SW579细胞组比较, 则无明显差异 (表1) 。

2.5 不同SW579细胞株生长速度观察

细胞计数显示转染有GPI-PLD组 (pcDNA/GPI-PLD组) 的SW579细胞生长速度较转染空白载体组 (pcDNA3.1组) 和未转染组 (Control组) 明显减慢, 具有统计学意义 (P<0.05) 。

2.6 补体介导的细胞毒试验

细胞培养48h后, 稳定转染细胞较阴性对照自然死亡后被台盼蓝染色的细胞而言, 转基因的细胞被补体杀伤时, 细胞肿大更加明显, 胞膜边界也更加模糊, 证明补体对这些细胞有明显杀伤作用。补体介导的细胞毒 (CDC) 杀伤率显示, pcDNA/GPI-PLD组较pcDNA3.1组和Control组细胞组杀伤率显著增高, 增高倍数超过了3倍, 而pcDNA3.1组和Control组细胞组间无明显差异 (表2) 。

3 讨论

本研究结果显示, GPI-PLD基因过度表达可抑制SW579细胞的生长, 推测其分子机制可能是GPI-PLD基因表达增强, 使GPI-PLD酶活性增加, 水解释放细胞膜上GPI锚定的蛋白质如CD87, CD55, CD59, PLAP, CEA和CEACAM6等增加, 改变了这些GPI锚定蛋白质的功能和信号传递途径。已经发现GPI锚定蛋白质、糖脂、胆固醇和小窝蛋白等以脂质微域形式富集于细胞质膜的特定区域-小窝内, 而很多信息传递通路包括G蛋白介导途径、Ca2+介导途径、酪氨酸激酶途径等中的大量信息传递通路蛋白富集于小窝内[5]。因此, GPI锚定蛋白质的释放可能影响到该蛋白质的生物学作用和脂质微域的信号转导。用CEACAM5和CEACAM6稳定转染结肠肿瘤的两种细胞株SW112和Caco-2发现, 细胞表面表达的CEACAM5和CEACAM6分别增加10倍和30倍, 并且在裸鼠过度表达CEACAM5和CEACAM6可促进其结肠肿瘤的形成。因此GPI-PLD释放肿瘤细胞表面的CEACAM5和CEACAM6, 使其失去与α5β1整合素受体结合的能力, 因此, 甲状腺癌细胞过度表达CEACAM5和CEACAM6等GPI锚定蛋白, 从而促进了癌细胞的生长。本研究结果还显示, GPI-PLD具有增强补体对肿瘤细胞的杀伤作用, 可能是因为GPI-PLD基因表达增强, 使细胞膜上GPI锚定的CD55和CD59等膜结合补体调节蛋白水解释放, 从而使细胞失去CD55和CD59等的保护, 导致肿瘤细胞失去对补体杀伤的抵抗作用, 从而增强肿瘤细胞对补体的敏感性而杀伤肿瘤细胞。

因此, 稳定转染GPI-PLD基因可以使细胞GPI-PLD酶活性和GPI-PLDmRNA水平显著增高, GPI-PLD活性的改变影响了肿瘤细胞增殖、凋亡及对补体杀伤的敏感性, 可以利用GPI-PLD的水解活性来影响肿瘤细胞表面GPI锚定蛋白的释放从而达到治疗肿瘤的目的。

摘要：目的 研究GPI-PLD基因转染并过度表达对SW579细胞的影响。方法 用脂质体转染法将GPI-PLD真核表达载体pcDNA3.1 (+) /GPI-PLD转入SW579细胞, 以未转染的SW579细胞及转染空载体pcDNA3.1 (+) 的细胞为对照, 筛选出阳性细胞克隆。以胎盘碱性磷酸酶为底物, 定量检测GPI-PLD活性, RT-PCR法确定GPI-PLDmRNA表达水平。细胞计数绘制生长曲线, 台盼蓝排斥法观察补体介导的细胞毒 (CDC) 杀伤率, ELISA检测癌胚抗原 (CEA) 的表达情况。结果 阳性细胞克隆GPI-PLD酶活性水平比对照组升高约3倍, GPI-PLD mRNA表达水平约增加6倍;GPI-PLD基因过度表达可促进GPI锚定的蛋白质如CEA和PLAP等被大量水解释放入培养基, 导致细胞增殖能力减弱, 对补体杀伤的敏感性增强。结论 成功将GPI-PLD基因转染入SW579细胞, 并在细胞中稳定表达。GPI-PLD过表达能抑制肿瘤细胞增殖, 增强肿瘤细胞对补体杀伤的敏感性。

关键词：糖基化磷脂酰肌醇特异性磷酯酶D,甲状腺癌,SW579细胞,转基因

参考文献

[1] Nagpal JK, Dasgupta S, Jadallah S, et al.Profiling the expression pattern of GPI transamidase complex subunits in human cancer[J].Mod Pathol, 2008, 21 (8) :979～791.

[2] Camacho-Leal P, Stanners CP.The human carcinoembryonic an-tigen (CEA) GPI anchor mediates anoikis inhibition by inactiva-tion of the intrinsic death pathway[J].Oncogene, 2008, 27 (11) :1545～1553.

[3] Watanabe K, Bianco C, Strizzi L, et al.Growth factor induction of Cripto-1shedding by glycosylphosphatidylinositol-phospholipase D and enhancement of endothelial cell migration[J].J Biol Chem, 2007, 282 (43) :31643～31655.

[4] Yamamoto Y, Hirakawa E, Mori S, et al.Cleavage of carcinoembryonic antigen induces metastatic potential in colorectal carcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun, 2005, 333 (1) :223～229.

[5] Taylor DR, Hooper NM.The prion protein and lipid rafts[J].Mol Membr Biol, 2006, 23 (1) :89～99.