不同剂量瑞芬太尼对缺血再灌注时大鼠肾细胞凋亡和bcl-2、bax表达的影响

肾缺血再灌注 (ischemic reperfusion, I/R) 损伤是一种常见的临床病理生理过程, 常见于低血压休克、肾手术、肾移植、失血、后微循环再通、体外震波碎石等过程中, 均可发生不同程度再灌注损伤, , 是导致急性肾功能衰竭的重要原因之一。因此, 如何防治肾脏急性IR是临床迫切需要解决的问题。

动物研究表明[1], 瑞芬太尼可以模拟心脏缺血预处理作用, 对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。本实验通过建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型, 观察不同剂量瑞芬太尼对肾细胞凋亡调控基因表达的影响, 探讨瑞芬太尼肾保护作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用健康雄性Wistar大鼠40只, 体重250-300g, 由山西医科大学实验动物中心提供。40只动物随机分成假手术组、缺血再灌注 (I/R) 组和高剂量组、中剂量组、低剂量组, 每组8只。

1.2 动物分组及模型建立

模型组实验动物术前12h禁食, 自由进水, 10%水合氯醛3mg/kg腹腔内注射麻醉, 行腹正中切口, 钝性分离肾包膜, 显露和游离肾脏, 仔细分离肾蒂, 保护输尿管, 用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂, 造成肾缺血45min, 松开动脉夹恢复灌注, 再灌注6h后再次麻醉动物, 摘取左、右肾分别进行细胞凋亡检查。

注:与假手术组比较, △P<0.05;与缺血再灌注组比较﹡P<0.05

注:与假手术组比较, △P<0.05;与缺血再灌注组比较﹡P<0.05

假手术组动物, 仅行开腹, 游离出双侧肾脏, 分离双侧肾蒂不夹闭, 伤口用生理盐水纱布覆盖, 暴露45min不作肾缺血处理。

三给药组大鼠分别以1μg/kg.min、2μg/kg.min、4μg/kg.min的速率, 于缺血再灌注30min前静脉持续输注30min, 即低剂量组、中剂量组、高剂量组。

1.3 主要化学试剂

瑞芬太尼粉剂购与湖北宜昌人福药业有限责任公司, 批号:080703;蛋白酶K和牛血清白蛋白购自华美生物技术公司提供;细胞凋亡检测试剂盒, 购于北京中山生物工程有限公司;;Bcl-2、Bax及DAB试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.4 原位末端标记法检测细胞凋亡

动物处死后, 迅速取肾用4%甲醛固定, 常规石蜡包埋制作肾组织切片。切片常规脱蜡至水, 经蛋白酶K消化后, 加入TdT和DigdUTP 37℃温育2.5h, 用3%胎牛血清封闭, 再加生物素化抗地高辛抗体, 洗涤, 加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素, DAB显色。镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。用彩色图像摄录输入仪和全自动图象分析仪放大 (×250) 组织切片, 随机取10个视野, 进行阳性细胞 (蓝色为阳性) 及总细胞计数, 并计算细胞凋亡指数。

细胞凋亡指数=凋亡细胞计数/总细胞计数×100%。

1.5 免疫组化检测Bcl-2及Bax表达

切片常规脱蜡、水化, 微波修复抗原, 山羊血清封闭后, 加兔抗大鼠Bax或Bcl-2抗体, 工作浓度分别为1:100和1:50。PBS洗后, 滴加生物素化羊抗兔IgG二抗, 再加卵白素-生物素-过氧化酶复合物置湿盒内37℃温育30min, DAB显色, 苏木素复染, 封片观察。胞浆有棕黄色颗粒者为阳性, 不着色为阴性。采用MIAS-2000图像分析系统 (四川川大智胜软件股份有限公司) 分析。每个切片随机选择10个不重叠的高倍视野 (×400) , 计数细胞阳性率。细胞阳性率=阳性细胞数/视野所有细胞数×100%。

1.6 统计学处理

实验数据用表示, 采用SPSS 13.0软件包统计分析, 组间比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组缺血再灌注后凋亡指数比较

由表1可见, TUNEL染色显示各组肾内凋亡细胞与假手术组比较, 缺血再灌注组细胞凋亡指数明显增加, 各给药组细胞凋亡指数与缺血再灌注组比较均有所减少, 差异有显著性, P<0.05, 并随剂量的增高而减少。

2.2 各组Bcl-2及Bax表达比较

由表2可见, 缺血再灌注组与假手术组比较, Bcl-2阳性细胞百分比降低, Bax阳性细胞百分比升高, Bax/Bcl-2升高, 差异有显著性, P<0.05;各给药组与缺血再灌注组比较叫, 细胞Bcl-2阳性细胞百分比随剂量的升高而升高, Bax阳性细胞百分比随剂量的升高而降低, Bax/Bcl-2随剂量的升高而降低, 差异有显著性, P<0.05。

3 讨论

缺血再灌注损伤的发病机制目前尚未完全清楚, 可能与很多因素相关, 其中凋亡、氧自由基损伤和炎症级联反应在其中起到了重要的作用。现已证实[2], 细胞凋亡不仅会出现在生理状态下, 在许多病理状态下也会出现。适度的细胞凋亡是机体维持细胞数量稳态的重要手段, 而过度的凋亡则会使机体造成损伤。实验证实[3]:细胞凋亡是缺血再灌注组织和器官损伤的重要途径;因而, 有效地减少细胞过度凋亡可以减轻缺血再灌注对组织器官的损伤。

瑞芬太尼是一种新型的超短效μ型阿片受体激动药, 是麻醉和镇痛中常用的药物, 给药后在血管外分布广泛, 稳态时分布容积远小于其他阿片类药, 持续输注后半衰期不受输注时间长短的影响, 具有起效迅速、镇痛效果好、作用持续时间短和可控性好等特点, 是理想的静脉麻醉靶控输注药物。动物研究表明[4], 瑞芬太尼可以模拟心脏缺血预处理作用, 对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。本实验中瑞芬太尼预处理可明显减少肾缺血再灌注损伤早期肝组织细胞凋亡, 对肾脏组织起到保护作用。bax是促凋亡基因, 能促进细胞因子缺失而诱导细胞凋亡, bcl-2与bax可形成二聚体, 2者的比例决定细胞向存活还是凋亡方向发展。本研究证明瑞芬太尼保护肾脏缺血再灌注损伤的机理, 是通过上调肾细胞bcl-2基因和下调bax基因, 从而使bax/bcl-2比值降低来发挥其保护作用。

综上所述, 瑞芬太尼预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤早期细胞凋亡有抑制作用, 其机制与下调Bax蛋白表达和上调Bcl-2蛋白表达有关。

摘要：目的 观察不同剂量瑞芬太尼对大鼠肾缺血再灌注后肾小管细胞凋亡及其调控基因bcl-2和bax表达的影响, 探讨瑞芬太尼肾保护作用的分子生物学机制。方法 用动脉夹夹闭大鼠双侧肾蒂45min再灌注6h方法 制成急性肾缺血再灌注损伤模型。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记技术检测细胞凋亡的情况。免疫组化检测Bcl-2、Bax基因表达。结果 缺血再灌注组较假手术组肾小管凋亡细胞数明显增多, Bcl-2、Bax表达均增强, Bax/Bcl-2比值增高;瑞芬太尼各剂量处理组较缺血再灌注组凋亡细胞数明显减少, Bcl-2表达进一步增强, 而Bax表达减弱, Bax/Bcl-2降低。结论 瑞芬太尼可能通过上调Bcl-2基因表达, 下调Bax基因表达, 抑制细胞凋亡, 从而发挥对缺血再灌注损伤肾脏的保护作用。

关键词：缺血-再灌注损伤,瑞芬太尼,凋亡,基因表达

参考文献

[1] 熊利泽, 杨静, 徐宁, 等.缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响[J].中华麻醉学杂志, 2007, 25 (7) :508～5l0.

[2] 苏松, 夏先明, 贺凯, 等.缺血预处理与肝脏缺血再灌注时细胞凋亡变化的关系[J].中国现代医学杂志, 2005, 15 (19) :2922～2925.

[3] 张冰, 王禾, 杨晓剑, 等.缺血预处理对严重缺血/再灌注损伤大鼠移植肾脏功能恢复的影响[J].第四军医大学学报, 2006, 27 (5) :448.