MNP-端粒酶反义寡核苷酸复合物诱导HL-60细胞凋亡

MNP-端粒酶反义寡核苷酸复合物诱导HL-60细胞凋亡（精选2篇）

篇1：MNP-端粒酶反义寡核苷酸复合物诱导HL-60细胞凋亡

MNP-端粒酶反义寡核苷酸复合物诱导HL-60细胞凋亡

反义寡核苷酸具有抑制细胞基因表达作用,对于病毒感染及癌症的治疗具有潜在疗效,然而由于其在生物介质中的不稳定性和低穿透率,常需要修饰于一定的载体上,纳米粒子便是其良好的.载体,修饰后可提高反义寡核苷酸的稳定性.研究应用FACS,MTT比色法,电子显微镜,原子力显微镜,细胞集落法研究MNP-端粒酶反义寡核苷酸复合物体外诱导HL-60细胞(人急性早幼粒细胞白血病细胞系)细胞凋亡情况.研究结果表明:通过MTT比色法检测可知不同的药物浓度对细胞的生长有明显的抑制影响;实验组细胞在诱导后于流式细胞术检测中产生了亚二倍体峰(凋亡峰);通过集落形成及电镜观察都有明显的凋亡现象产生,因此认为MNP-端粒酶反义寡核苷酸复合物具有诱导HL-60细胞凋亡的作用.

作 者：程呈 忻茜 陈祥峰 李兴玉 CHENG Cheng XIN Xi CHEN Xiang-feng LI Xing-yu 作者单位：上海师范大学生命与环境科学学院,上海,34刊 名：上海师范大学学报(自然科学版) ISTIC英文刊名：JOURNAL OF SHANGHAI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCES)年，卷(期)：37(3)分类号：Q291关键词：磁性纳米粒子 细胞凋亡 流式细胞术 MTT比色法 HL-60

篇2：MNP-端粒酶反义寡核苷酸复合物诱导HL-60细胞凋亡

1 材料和方法

1.1 细胞培养

大鼠C6胶质瘤细胞株(哈尔滨医科大学第一临床医学院中心实验室保存)在含有10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco,美国)中,置37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养。

1.2 寡核苷酸的设计、合成

选择Survivin m RNA模板区232～251 bp的序列3'-GGGTCGGAAGGTCGAGGAAC-5'作为靶位点合成ASODN,另设正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)作为对照组。寡核苷酸碱基均进行全硫代修饰以增加其稳定性。寡核苷酸合成序列:A-SODN 5'-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3',SODN 5'-CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG-3'。碱基序列的合成及修饰均由上海生物工程公司完成。

1.3 实验分组

空白对照组;脂质体对照组;Survivin SODN组;Survivin ASODN组。

1.4 转染

按Lipofectamine TM 2000(Invitrogen,美国)说明书进行。取对数生长期C6细胞,以无血清、无双抗的DMEM培养基培养4 h;取合成的寡核苷酸与脂质体以1∶8比例混合,15℃～25℃放置10～15min,加入至C6细胞培养基中(培养基与脂质体体积比为100∶6);细胞继续培养12 h后,弃去培养基,进行各项指标的检测。每项实验重复5次,取平均值。

1.5 MTT试验

将上述各组细胞按1×105/m L密度接种于平底96孔板中,培养12、24、36和48 h后弃去培养液,加入MTT(5 g/L)100μL继续培养4 h,吸去上清,加入0.1 m L DMSO,振荡溶解细胞,用酶标仪(Bio-Rad Model 550,USA)检测490 nm处的吸光度值(A),计算生长抑制率。生长抑制率(%)=(1-A实验/A对照)×100%。

1.6 We s te rnblot法检测S urvivin蛋白的表达

收集6×106个细胞,加入4℃50μL细胞裂解液,冰浴20 min,12 000 r/min(离心半径为20 cm)离心后取上清液,测蛋白浓度。取含约50μg蛋白的样品,10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同大小蛋白质,再通过电转移法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上,加入1∶1 000羊抗人Survivin抗体(Santa cruz,美国),4℃过夜,漂洗后加入1∶4 000辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG二抗(Santa cruz,美国),室温孵育1 h,洗膜后用ECL化学发光试剂盒(Amersham,美国)检测。在暗室中压片、自显影、洗片。同样方法进行各样本中内对照β-actin的检测。

1.7 细胞凋亡的流式细胞术检测

细胞凋亡的检测按照ApoAlert Annexin V-FITC试剂盒(BD公司,美国)说明书进行操作。用不含EDTA的胰酶消化收集C6细胞,用PBS洗涤细胞2次(1 000 r/min离心5 min)。收集5×105个细胞;加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞;加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5μL PI,混匀;室温、避光、反应15 min;用流式细胞仪(FACSAria BD公司,美国)检测。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行数据处理,所有数据以均数±标准差表示。对各计量指标进行Shapiro-Wilk正态分布检验和Levene方差齐性检验。两组间均数比较用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)检验。取P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组C6细胞S urvivin蛋白的表达

空白对照组的C6细胞可检测到较高水平的Survivin蛋白表达,脂质体对照组及Survivin SDON组C6细胞表达Survivin蛋白水平差异无显著性(P>0.05)。而Survivin ASDON组,则检测到了C6细胞Survivin蛋白表达明显减少(P<0.01),结果见图1。

2.2 S urvivin AS ODN对C6细胞生长的影响

由图2可以看出脂质体对照组及Survivin SODN组C6细胞生长无明显的受抑现象(P>0.05),而Survivin ASODN对C6细胞生长有明显的抑制作用,并且此作用呈时间依赖性(P<0.01)。

2.3 S urvivin AS ODN诱导C6细胞凋亡的检测结果

正常C6细胞凋亡发生较少,以脂质体转染后,细胞凋亡水平无明显变化(P>0.05);以SODN转染后可见较多C6细胞发生了凋亡(与脂质体对照组比较,P<0.05);而在Survivin ASODN组,C6细胞则发生了显著凋亡,其凋亡率明显高于脂质体对照组及Survivin SODN组(P<0.01)。表明Survivin ASODN可显著诱导C6细胞发生凋亡,见图3、图4。

3 讨论

细胞凋亡与肿瘤发生关系密切。从前人们更关注的是对肿瘤细胞增殖机制的研究,自从有人发现原癌基因bcl-2后,人们才发现肿瘤发生是细胞增殖过度与凋亡减少导致过量蓄积的结果。自此诱发肿瘤细胞凋亡成为研究肿瘤治疗的一个新方向。细胞凋亡过程受凋亡促进因子p53、Fas、c-myc等和凋亡抑制因子如bcl-2、CAP家族、Survivin等的共同调节。Bcl-2家族在凋亡研究中倍受重视,近年IAP家族的作用亦越来越引起人们的注意,其中最引人注目的是1997年发现的Survivin基因,一般认为Survivin是目前已知最强的凋亡抑制因子[4]。

人Survivin基因全长1 417 kb,位于17q,由4个外显子和3个内含子组成,编码产生一个由142个氨基酸组成的胞浆蛋白,是迄今为止发现的分子量最小、抗凋亡作用最强的IAP。Survivin蛋白发挥着抑制细胞凋亡和促进细胞分裂的作用,在绝大多数人类肿瘤细胞中Survivin都高表达,包括胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和神经系统肿瘤等。而在正常分化成熟的组织(包括成人正常脑组织)中不表达[5]。CHAKRAWARTI等[6]认为Survivin的表达水平对判断肿瘤的预后有重要的价值。在神经系统的一些良性肿瘤如神经鞘瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤中也发现了Survivin有表达的情况[7],一般认为可能是肿瘤细胞生长和增殖活跃的表现。因此针对Survivin蛋白寻找相应干预手段有可能为肿瘤的治疗提供新的思路。

一些学者已经探讨了针对Survivin蛋白的治疗手段。如SHANKAR等[8]报道了利用Survivin反义核苷酸转染人类神经母细胞瘤和少肢胶质瘤细胞株,结果发现内源性Survivin蛋白水平呈剂量依赖性下降,最终导致细胞死亡率的增高。本实验即以Survivin作为研究的靶点,以ASODN作为研究手段,观察Survivin ASODN对胶质瘤C6细胞的作用。ASODN,即为人工合成长度为10～30个碱基的分子及其类似物,通过特异的碱基配对,与靶基因(正义链)上的特定序列杂交,从而抑制该蛋白质的表达。近20年来,ASODN在治疗人体内蛋白质异常引起的各种疾病上的作用越来越受到研究者的关注,其特异性强、高效低毒、用量少及其与化疗、放疗具有协同作用等优点[9],使其成为治疗肿瘤的新一代主力军[10]。

本实验结果发现转染Survivin ASODN后C6细胞的Survivin蛋白表达水平明显下降,生长明显受到抑制,这提示ASODN能够使胶质瘤Survivin基因表达受抑,通过阻断其在癌发生发展中可能存在的重要作用,最终达到抑癌的效果。

为了观察Survivin ASODN对C6细胞凋亡的影响,本实验以Annexin V+PI染色流式细胞术检测了细胞凋亡的发生情况,结果发现ASODN可非常显著地诱导C6细胞凋亡,既证实了Survivin基因在凋亡的基因调控中的重要作用,也提示针对Survivin的分子治疗手段的良好应用前景。

综上所述,Survivin ASODN能靶向抑制Survivin蛋白的表达,从而解除其对凋亡的抑制作用,诱导胶质瘤细胞发生凋亡,最终抑制胶质瘤细胞的生长。这有可能成为治疗胶质瘤的一种新方法。

参考文献

[1]JOUANNEAU E.Angiogenesis and gliomas:current issues and development of surrogate markers[J].Neurosurgery,2008,62(1):31-50.

[2]ALTIERI DC.Survivin,cancer networks and pathway-directed drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2008,8(1):61-70.

[3]FU XH,ZHANG JS,ZHANG N,et al.Combination of telom-erase antisense oligonucleotides simultaneously targeting hTR and hTERT produces synergism of inhibition of telomerase activity and growth in human colon cancer cell line[J].World J Gas-troenterol,2005,11(6):785-790.

[4]张轶庠,杨江根,章道恒,等.Survivin反义寡核苷酸诱导人膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的实验研究[J].中国现代医学杂志,2007,17(11):1334-1340.[4]ZHANG YX,YANG JG,ZHANG DH,et al.Studies on anti-sense of oligodeoxynucleotide targeting Survivin inducing apoptosis of human bladder transitional cell carcinom a T24cell lines[J].China Journal of Modern Medicine,2007,17(11):1334-1340.Chinese

[5]PENNATI M,FOLINI M,ZAFFARONI N.Targeting Survivin in cancer therapy[J].Expert Opin Ther Targets,2008,12(4):463-476.

[6]CHAKRAVARTI A,NOLL E,BLACK PM,et al.Quantitatively determined Survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas[J].J Clin Oncol,2002,20(4):1063-1068.

[7]ANDERSEN MH,SVANE IM,BECKER JC,STRATEN PT.The universal character of the tumor-associated antigen Surviving[J].Clin Cancer Res,2007,13(20):5991-5994.

[8]SHANKAR SL,MANI S,O'GUIN KN,et al.Survivin inhibition induces human neural tumor cell death through caspase-inde-pendent and-dependent pathways[J].J Neurochem,2001,79(2):426-436.

[9]张梅春,胡成平,赵子文,等.Survivin反义寡核苷酸逆转顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡耐受作用[J].中国现代医学杂志,2007,17(15):1793-1807.[9]ZHANG CM,HU CP,ZHAO ZW,et al.Antisense oliodeoxynu-cleotides targeting Survivin gene reverse apoptotic resistance in-duced by cisplatin in human lung adenocarcioma cells[J].China Journal of Modern Medicine,2007,17(15):1793-1807.Chinese