尿酸对DOCA-Salt高血压大鼠内皮细胞的影响

尿酸是一种黄嘌呤被氧化代谢后的有机小分子。在大多数物种中, 尿酸在尿酸酶的作用下继续被代谢为尿囊素排出体外。而在灵长类动物和人类, 由于基因的突变而缺乏尿酸酶, 尿酸是嘌呤代谢的最终产物, 它很难溶于水, 在高浓度, 酸性或者其他分子的存在下, 易形成尿酸钠的结晶产物[1]。许多动物和人的实验已经说明, 血尿酸浓度和高血压是存在着独立的正相关性, 是心血管疾病的危险因素之一[2~3]。KHOSLA等[4]研究发现高尿酸恶化了血管内皮细胞的功能, 进而可能诱发了高血压和心血管疾病。然而Szasz和Watts[5]通过体外实验发现, 不论是在血压正常的大鼠还是DOCA盐性高血压大鼠, 尿酸对内皮功能却没有明显的影响。

一氧化氮 (nitric oxide, NO) 和内皮素-1 (endothelin-1, ET-1) 是广泛分布于血管系统的一种细胞因子, 在维持血管正常结构和功能方面起重要作用, 内皮素与一氧化氮平衡失调是动脉内皮受损的显著特征。核转录因子 (nuclear factor-κB, NF-κB) 是一个广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子, 是参与炎症反应的蛋白质因子, 因而可能是内皮细胞激活的调控中一个重要转录激活因子[6]。有研究显示NF-κB是控制内皮细胞分泌ET-1的细胞因子之一[7], 本研究通过对正常血压和DOCA-salt高血压大鼠的ECs培养, 研究尿酸对内皮细胞中NO、ET-1, NF-κB生成的影响, 从而来探讨尿酸是如何影响高血压内皮细胞功能及其信号通路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

DOCA、尿酸购于美国Sigma公司, 大鼠ET-1定量EISA试剂盒 (上海西唐生物科技有限公司) 。

1.2 动物模型及分组

体重200~250g雄性SD大鼠 (中山大学实验动物中心提供) 分为DOCA-Salt高血压大鼠组和对照组, 其中DOCA-Salt高血压大鼠模型根据Theodora Szasz的方法制备, 用3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉, 常规消毒后, 摘除左肾, 于大鼠右下腹皮下置入含200mg/kg的DOCA硅肢管, 术后给予含l%NaCl和0.2%KCl的饮用水, 术后所有大鼠连续3d肌肉注射青霉素钠盐 (5×l0UPG/d) ;对照组不植入DOCA硅肢管, 不摘除左肾, 给予正常饮用水。

1.3 收缩压测量

每周用RBP-100型大鼠血压心率测定仪, 测定大鼠尾动脉的收缩压 (SBP) 1次, 每只大鼠测3次, 取平均值。

1.4 主动脉内皮细胞培养及分组

用3%的戊巴比妥钠 (30mg/kg) 分别麻醉DOCA-Salt高血压大鼠和对照组大鼠, 无菌条件下剪开胸腹腔, 超净台中取出胸主动脉并放入装有含20%FBS的M199培养基的培养皿中, 剥离干净血管外结缔组织及脂肪组织, 用PBS洗净血管内残血, 然后移入另一含有培养液的培养皿中, 用镊子将血管外翻, 使内膜暴露出来, 用灭菌线将血管两端处扎紧, 培养液漂洗内膜。将血管放入装有2.0g·L-1I型胶原酶的培养瓶中, 置37℃、5%CO2培养箱中消化1h, 取出并用培养液轻轻漂洗2次, 用刀片将血管两末端切去, 余下的血管切成约2mm×2mm小块, 按内膜朝下贴入预先用3%的明胶铺板的12.5mL的培养瓶中, 初次接种体积2mL, 37℃, 5%CO2培养箱静置培养, 12h后再补加培养液1mL, 24h后即可见大鼠主动脉内皮细胞从组织块周围迁出。以后每2~3天换1次液, 10~14d后即汇合成单层细胞, 呈典型的铺路石状。分组如下:DOCA-Salt高血压大鼠主动脉内皮细胞分别用10、50、100μm尿酸和载体Na OH孵育1/2h, 对照组大鼠主动脉内皮细胞分别用10、50、100μm尿酸和载体Na OH孵育1/2h。

1.5 ELISA法检测ET-1

按照试剂盒中操作指示进行细胞培养上清液中ET-1浓度的测定。建立标准曲线, 每孔加入待测样品l00uL, 37℃温育60min, 洗涤液充分洗涤5次, 向滤纸上印干, 然后每孔中加入抗ET-1生物素100uL, 37℃温育60 min, 洗板, 再加浓缩酶联物, 每孔100 uL, 3 7℃温育30min, 洗板, 加TMB显色液, 37℃暗处温育25min, 加入终止液, 每孔100uL, 450nm处测吸收值, 根据标准品250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、0pg/mL之OD值, 酶标仪自动汇出标准曲线, 根据样品OD值在标准曲线上查出相应样品的ET-1的浓度 (pg/mL) 。

1.6 细胞上清液NO水平测定

NO测定用Griess重氮化反应方法, 药盒由南京聚力生物有限公司提供, 用722分光光度仪在540nm处测定, 根据公式计算出NO2—含量, 用来反映细胞培养上清液NO浓度。

1.7 R T-PC方法

检测内皮细胞NF-κB mRNA的表达TRIZOL (Gibco) 提取细胞RNA。用核酸蛋白测定仪测光密度OD260/280比值在1.8~2.0之间, 表明RNA纯度达到要求。从Gene Bank上下载大鼠mRNA序列全长, 利用引物设计软件Primer Primer 5.0设计NF-κB上下游引物。NF-κB引物序列:上游:5-CCAGGCGGACATCTACAA-3, 下游:5-CAAGGCCAAATGAAAGGA-3, 扩增片段大小为230bp。上述引物均由英骏生物技术有限公司合成。PCR反应条件:94℃5min、94℃30s、72℃1min30个循环72℃10min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳, 于凝胶图像分析系统进行扫描分析, 计算mRNA的灰度比值。

1.8 统计学处理

使用SPSS统计软件进行数据分析, 所有实验结果均以表示。组间比较采用SPSS 13.0统计软件作单因素方差分析及两两比较, P≤0.05者认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 血压变化

4周观察期间, 正常对照组血压平稳, 无明显波动。模型对照组血压逐周上升, 2周后与正常对照组相比, 有统计学差别, P<0.05;4周后进一步升高, 与正常对照组相比, P<0.05, 血压显著升高 (表1) 。

2.2 尿酸对大鼠内皮细胞分泌ET-1的影响

图1中ELISA检测结果显示, 通过不同浓度的尿酸与内皮细胞培养1/2h后发现, 10μm和50μm尿酸对内皮细胞分泌ET-1没有明显的影响, 而100μm的尿酸却能促进内皮细胞分泌ET-1, 特别是100μm的尿酸对DOCA-salt高血压大鼠的内皮细胞分泌ET-1有着更明显的促进作用。

2.3 尿酸对大鼠内皮细胞NO的影响

图2中Griess重氮化反应方法检测内皮细胞上清液NO的浓度显示, 100μm的尿酸培养内皮细胞NO的浓度下降最明显 (P<0.05) , 其中DOCA-salt高血压大鼠内皮细胞的NO浓度较对照组下降更明显 (P<0.05) , 而10μm、50μm尿酸和载体NaOH培养内皮细胞, NO的浓度没有明显变化。

2.4 尿酸对大鼠内皮细胞NF-κB mRNA表达的影响

从图3可见, DOCA-salt高血压大鼠内皮细胞可见NF-κB mRNA明显表达, 其中100μm的尿酸培养内皮细胞, NF-κB mRNA表达最明显 (P<0.0 5) 。对照组N F-κB m RN A呈低表达或不表达。DOCA-salt高血压大鼠组与对照组比较差异均有显著性 (P<0.05) 。

3 讨论

尿酸是一种抗氧化剂, 而且有促进内皮细胞功能紊乱的作用, 而高血压与内皮细胞的功能有着密切的关系, 此前也有文献报道通过别嘌醇治疗降低血尿酸浓度, 改善了高血压的程度[8], 所以我们希望通过此研究了解尿酸在内皮细胞水平上对血管的影响。

ET-1是由血管内皮细胞分泌的生物活性多肽, 它不仅是迄今为止已知的作用仅次于血管紧张素II的强力血管收缩剂, 而且能刺激血管平滑肌细胞合成DNA和促进细胞发生有丝分裂, 引起血管重构, 因其在高血压的形成中具有重要的调节作用。NO是由血管内皮细胞合成的一种酶催化的生物活性物质, 具有强有力的扩张血管, 降低血压, 是已知的具有抗高血压作用的保护性因子[9]。正常情况下, ET、NO两者保持动态平衡, 共同维持血管张力, 调节血管内皮功能。而在病理状态下两者动态平衡失调。本实验结果显示, 在对照组中, 100μm的尿酸才刺激ET-1的分泌, NF-κBmRNA的表达并抑制NO的生成, 而在DOCA-salt高血压大鼠血管内皮细胞中, 100μm的尿酸明显促进ET-1的分泌, NF-κBmRNA的表达同时抑制NO的合成, 内皮依赖性血管扩张作用减弱, 进一步导致血管内皮功能失衡, 说明在DOCA-salt高血压大鼠中, 100μm尿酸有明显促进血管内皮细胞功能失调。

较多研究显示NF-κB是促炎症基因表达的枢纽之一, 当细胞受多种因素的刺激时, 通过一系列细胞信号转导作用NF-κB被释放出来, 在人核引导序列的作用下进入细胞核, 启动下游靶基因的表达。如NF-κB可诱导趋化因子、粘附因子等的表达, 而这些因子又对相应细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌起着直接的调控作用, 此前已有研究表明内皮细胞分泌ET-1和NO受到许多物质的影响, 如:凝血酶, 转化生长因子-β, TNF-α和NF-κB。在我们的研究中发现, NF-κB的变化与ET-1和NO的变化是一致的, 所以我们认为尿酸影响内皮细胞分泌ET-1和NO可能是通过NF-κB来调节的。

综上所述, 尿酸可能通过NF-κB调节了ET-1和NO的分泌, 进而影响了DOCA-salt高血压大鼠内皮细胞功能的失调, 可能促进并加重高血压及其血管的病变。

摘要：目的 探讨不同尿酸浓度对DOCA-salt高血压大鼠内皮细胞的影响。方法 根据Theodora Szasz的方法制备DOCA-Salt高血压大鼠模型, 4周后与对照组分别培养胸主动脉内皮细胞, 然后用10、50、100μm尿酸和载体NaOH和内皮细胞孵育1/2h, 比较ET-1、NO及NF-κBmRNA表达的差别。结果 在100μm尿酸的作用下, DOCA-salt高血压大鼠组血压ET-1和NF-κBmRNA表达均明显高于对照组 (P<0.05) , 而NO的表达明显低于对照组 (P<0.05) 。结论 100μm尿酸促进了DOCA-salt高血压大鼠内皮细胞功能的失调, 可能通过NF-κB影响了ET-1和NO的表达, 从而促进并加重高血压及其血管的病变。

关键词：DOCA,尿酸一氧化氮,内皮素-1NF-κ B

参考文献

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