海洋固氮细菌的研究进展

氮是海洋生物必需的大量元素, 又是海洋生物生长的主要限制因子之一, 研究氮元素的补充机制对了解海洋生态系统有重要意义。固氮作用是生态系统氮循环的重要过程[1]。生物固氮是指固氮生物将大气中的氮气 (N2) 转化为可被生物体利用的过程, 在海洋自然生态系统的氮循环和氮平衡中具有极其重要的作用[2]。首先, 在海洋的各种生态系统中, 生物固氮是重要的氮素的来源, 是维持海洋初级生产力持续发展和形成新生产力的一个重要生态反应过程[3];其次, 固氮生物也是环境变化的重要生态指示物, 对海洋生态环境的维护与平衡有重要作用[4]。海洋中固氮生物种类较多, 迄今已知的能固氮的海洋生物均为原核生物, 包括固氮蓝藻、异养细菌和光合细菌。生物固氮作为海洋生态系统和生源元素地球化学物质循环的重要环节, 对海洋生物圈及海洋生态环境产生极大的影响[3]。本文就海洋固氮细菌的多样性、研究进展及其研究方法作较全面的阐述。

1 生物固氮的概念、研究历史

分子氮 (N2) 在生物体内由固氮酶催化还原为氨的过程称为生物固氮作用。1888年Beijerinck第一次分离出具有固氮活性的微生物;1889年Frank发现含有蓝藻的土壤具有固氮能力, 随后由Drews (1928) [5]首次, 从无氮培养基上分离到具有固氮能力的多变鱼腥藻等纯培养物。到20世纪60年代, 已发现有细菌、放线菌和蓝细菌三大类固氮微生物, 它们通过自生、联合及共生三种主要固氮方式, 在自然界中形成丰富多样的生物固氮体系。自20世纪70年代起, 由于化学氮肥的大量使用及生产过程所需的大量能源, 世界范围内首次掀起生物固氮研究高潮。研究领域涉及固氮生物资源、生态、生理生化、遗传等诸多方面, 目的主要是减少化肥使用、提高生物对自然氮素的利用。20世纪80年代后期, 研究发现海洋、湖泊等自然生态系统中的固氮生物对生态系统的群落结构、演替和生产力持续发展有重要影响。目前固氮生物对海洋氮素循环及海洋自然生态系统的影响, 已成为生物固氮研究的前沿领域。

2 海洋固氮细菌的研究现状

迄今为止, 已有许多国家对海洋中具有固氮能力的生物群落进行过研究[6]。结果表明海洋固氮细菌在世界不同海域具有丰富的物种多样性和多种固氮方式, 它们对海洋生物链中的物质循环与能量转换作用巨大。目前已对海洋固氮微生物的种类与组成有比较一致的看法[7], 主要包括蓝藻类、异养细菌类和光合细菌类。

2.1 固氮蓝藻类

已知具有固氮能力的蓝藻约30种, 其中属于海洋浮游蓝藻的束毛藻属 (Trichodesmium) 是目前海洋中分布最广、固氮量最大的一类群体海洋细菌[1], 其中的红海束毛藻 (Trichodesmium erythraeum) 和薛氏束毛藻 (T.thiebautii) 已证实为生物固氮的主要贡献者, 推测其他种类如T.t e n u e、T.contortum和汉氏束毛藻 (T.hildebrandtii) 等也具有一定的固氮能力。某些自养蓝细菌如假膜藻属 (Katagnymene) 也具有固氮酶活性, 但种类不如束毛藻丰富[8~9]。一些球型的海洋蓝细菌如球状微型蓝藻代表属聚球藻属 (Synechococcus) 可在黑暗条件下恒定培养固氮[9], 其中2种个体较大的 (直径3~4µm) 能在晚上固氮的海洋蓝细菌球形细胞株Cyanothecespp.[10]和Eryth rosphaera marina[11]已被分离出来。另外, 海洋中属于浮游性固氮蓝藻的还包括颤藻属 (Oscillatoria) 、浮丝藻属 (P e l a g o t h r i x) 、微囊藻属 (Microcysits) 、聚胞藻属 (Synechocystis) 。

此外, 固着海底、岩石上以及与其他生物共生固氮的蓝藻种类繁多, 如眉藻属 (Calothrix) 、伪枝藻属 (Scytonema) 、胶须藻属 (Rivularia) 、双须藻属 (Dichothrix) 、单歧藻属 (Tolypothrix) 、蓝枝藻属 (Hyella) 、鞭鞘藻 (Mastigocoleus) 、席藻属 (Phormidium) 、粘球藻属 (Gloeocapsa) 、节球藻属 (Nodularia) 、织线藻属 (Plectonema) 、岩线藻属 (Scop ulonema) 、束丝藻 (Aphanizomenon) 、管孢藻属 (Chamaesiphon) 、鱼腥藻属 (Anabaena) , 以及胞内植生藻 (Richelia intracellu laris) 、丝状鞘丝藻 (Lyng by a conf ervoides) 、原型微鞘藻 (Microcoleus chthonop lastes) 等种。深水型的蓝藻有蓝纤维藻属 (Datyliococcopsis) 、念珠藻属 (Nostoc) 。

我国对海洋固氮蓝藻有过一些研究, 包括海洋固氮生物的类群组成、固氮能力及其对主要海洋生态系统 (如珊瑚礁生态系统和红树林生态系统等) 和海水中的碳、氮贡献的研究等[12]。

迄今为止, 对海洋生态系统生物固氮的研究主要集中在束毛藻的种群、分布与固氮能力方面[13]。美国等国家近年在对赤潮形成海洋浮游蓝藻如束毛藻 (Trichodesmium) 等进行卫星遥感监测的同时[14], 也对其它新发现的海洋固氮微生物的分子分类学和遗传多样性[15~6]等方面进行了研究。如Zehr等[16]的研究发现, 许多固氮蓝细菌在亚热带的北太平洋海域均可表现出固氮酶基因nifH表达活性。这些新固氮微生物发现或固氮基因的活跃表达, 意味着有待对传统海洋生物固氮的概念、调控和模型结构进行重新评价[17]。

2.2 异养固氮细菌类

迄今为止, 研究发现海洋中的除蓝细菌以外的异养固氮细菌包括:肺炎克雷伯氏菌、产气肠杆菌、梭菌、固氮菌、黄杆菌、芽胞杆菌、克氏杆菌 (Klebstella) 、弧菌属 (Vibrio) 、梭状芽胞杆菌 (Clostridium) 、脱硫弧菌属 (D e s u l f o v i b r i o) 、假单胞菌属 (Pseudomonas) 等属中的一些种。在对海草生态群落的联合固氮的研究中发现[18], 温带海洋植物大叶藻 (Zostera sp.) 生产力高且可以维持相当量的根际固氮, 其根际中联合固氮的优势固氮菌是硫还原细菌。在珊瑚礁生境中, 有珊瑚和固氮细菌的互作联合固氮, 如石珊瑚 (StoneCorals) 和固氮菌属的联合, 同时在此生境中也有蓝藻和固氮细菌的联合固氮作用。此外, 固氮菌属 (Rhizobium) 细菌可以与海洋硅藻如Asterionella glacialis和绿藻如Chlamydomonas relhardtii等形成外共生关系, 这种关系是导致海洋赤潮的起因之一。

目前已知具固氮能力海洋弧菌只有Vibrio diazot rophicus和Vibrio nat riegens两种;前者除了分布于海水中, 也常见于海胆消化道内。但谢文阳等人[19~20]的研究显示, 至少还有其它三、四种尚未被命名的固氮性海洋弧菌广泛分布于海洋近海水域与沉积物中, 以及某些海洋无脊椎动物的体表或体内、海草根圈中。推测固氮海洋弧菌可能是海洋生态系中数目最多、分布最广的异养性固氮细菌。

2.3 其它光合固氮细菌类

除蓝细菌外的某些其它光合细菌主要是与其他生物进行联合固氮。其中固氮红螺菌、红硫菌、紫硫菌 (如着色菌属Chromatium) 、无色硫细菌 (如贝氏硫细菌属Beggiatoa) 等经检测具有固氮酶活性。

虽然目前海洋中除蓝细菌外的其它光合细菌在海洋氮循环方面的贡献很少有研究报道, 但考虑到这些光合细菌在海洋中巨大的生物量、铵盐和N2均可作为其氮源或能源、以及某些光合细菌还具有同化型或异化型硝酸盐还原能力, 所以, 其在氮循环过程中的贡献是不容忽视的。

3 海洋中固氮细菌的研究方法

研究海洋生物固氮能力的方法主要包括: (1) 无氮介质的细胞培养富集技术; (2) 乙炔还原法测定固氮酶活性; (3) 稳定性15N同位素示踪技术检测氮素流向; (4) PCR或分子杂交方法对固氮基因 (nifH、D、K) 的检测等[21]。以上方法各有优缺点, 在实际操作中, 可以根据具体要求选择适合的方法与组合以确保实验结果的准确性。随着固氮检测技术的发展和进步, 对海洋固氮微生物的认识和研究将更加深入和全面。

4 展望

海洋固氮细菌是海洋生态系统中生物所需氮素的主要供应者, 对海洋的初级生产力及综合生产力有极其重要的作用。对新的海洋固氮菌群及其固氮能力发现与研究, 可对整个海洋初级生产力水平进行重新合理估算, 具有海洋物质循环与海洋生态学上的重要意义。展望今后的研究方向, 还有许多值得进一步研究的关键问题。

(1) 特征海域固氮细菌的群体多样性, 优势类群。

(2) 特征海域固氮细菌丰度和固氮作用程度。

(3) 影响固氮细菌生长、分布和固氮作用的其他生物和环境因素。

(4) 海洋中自由生活的生物及其共生固氮细菌的遗传多样性。

(5) 浮游动物体内缺氧微环境中的厌氧菌能否固氮。

(6) 海洋固氮细菌对海区新生氮和新生产力贡献评估。

摘要：固氮微生物在海洋生态系统的氮素供给和生物生产中有重要作用。本文从海洋生物固氮的研究历史与研究现状着手, 阐述了海洋生物固氮的意义, 并重点对海洋固氮细菌的多样性、海洋生物固氮的研究方法等做了综述, 在此基础上展望了海洋生物固氮方面有待深入研究的科学问题。

关键词：海洋固氮微生物,微生物多样性,研究进展

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