TTC比色法测定甲砜霉素/氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的体外抗菌活性

甲砜霉素 (ThiamphenicoL, TAP) 为氯霉素类广谱抗菌素, 其化学结构与氯霉素相似, 是氯霉素的类似物, 对光、热稳定, 有吸湿性, 被称为第二代氯霉素;氟甲砜霉素 (FLorfenicoL, FOL) 是甲砜霉素的氟化衍生物, 被称为第三代氯霉素。作为氯霉素的替代品, 其作用机理与氯霉素相同, 他们都是甲砜基取代了氯霉素的硝基, 有效地克服了氯霉素导致再生障碍性贫血的缺陷, 抗菌作用比氯毒素强, 允许作为兽药使用。但由于其味苦, 溶解度小, 在兽药领域, 其剂型主要为散剂和片剂, 这影响了其药效并限制了其应用范围。羟丙基-β-环糊精 (HP-β-CD) 是β-环糊精的羟丙基衍生物, 是低毒、安全、有效的药物增溶剂, 通过与药物的包合作用可以显著增加难溶性药物的溶解度和相对生物利用度[1]。如果将甲砜霉素/氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精制成溶解性很好的包合物, 则可制成的可溶性粉剂、注射剂和易于分散的软膏剂等剂型。为此, 作者已成功的将甲砜霉素、氟甲砜霉素制成了相应的包合物[2]。前期研究结果表明:制成包合物后, 甲砜霉素、氟甲砜霉素的溶解度得到显著改善。为了考察甲砜霉素、氟甲砜霉素被包合后, 其体外抗菌活性和生物利用度有无变化, 我们进行甲砜霉素/氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物的体外抗菌活性和体内药动学研究。现将其体外抗菌活性研究成果报道如下。

国内外文献报道[3~6], 欲测定某种药物体外抗菌活性, 通常是在在特定环境下其抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度。药物最小抑菌浓度测定方法主要有常量肉汤稀释法, 微量肉汤稀释法, 琼脂稀释法。作者以微量肉汤稀释法为基础, 首次采用氯化三苯基四氮唑 (TTC) 比色法, 以血清型O78大肠杆菌为试验菌株, 测定了甲砜霉素、氟甲砜霉素原料药溶液和相应浓度的包合物溶液的最小抑菌浓度。TTC比色法测定药物最小抑菌浓度 (MIC) 的原理[7~9]:无色的TTC和活细菌内的脱氢酶反应, 生成红色而不溶于水的三苯甲臢 (TPF) , TPF比较稳定, 不会被空气中的氧自动氧化, 如果没有活的细菌或活细菌的量很少, 则氯化三苯基四氮唑 (TTC) 不会被还原, 溶液呈无色, 因此, 氯化三苯基四氮唑 (TTC) 可作为细菌是否存活的显色剂。

1 仪器与材料

1.1 仪器

VX-100漩涡混合仪 (美国Labnet, 附件含有酶标板的振荡板、离心管振荡板) ;SWCJ2FD型超净工作台 (苏州净化设备有限公司) ;LRH250S恒温恒湿培养箱 (广东省医疗厂) ;全自动YXQLS50SⅡ立式电热压力蒸汽灭菌器 (上海博迅公司医疗厂) ;FA1604电子天平 (上海精密仪器仪表有限公司) ;移液器 (20~200μL, 芬兰) ;移液器 (100~1000μL, 芬兰) ;移液器 (1000~5000μL, 芬兰) 。

1.2 材料

1.2.1 药物

甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物 (江苏省动物药品工程研发中心自制, 含量为19.69%) ;氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物 (江苏省动物药品工程研发中心自制, 含量为6.90%) 、甲砜霉素 (江苏省倍康药业有限公司提供, 含量99.2%) ;氟甲砜霉素江苏省倍康药业有限公司提供, 含量99.7%) , 2, 3, 5-氯化三苯四氮唑 (简称TTC) 。

1.2.2 试验菌株

备注: (1) “-”表示无细菌或生长受抑制, 培养液清亮; (2) “+”表示有细菌生长, 培养液呈红色。

鸡大肠杆菌O78, 由扬州大学动物科技学院提供, 由江苏畜牧兽医职业技术学院动物药学系微生物实验室活化培养。

1.2.3 肉汤培养基

称取蛋白胨10g、牛肉浸出粉3.0g、氯化钠5g, 将其混合后, 加蒸馏水适量微温溶解, 再加水至1000mL, 调节pH为弱碱性, 煮沸, 滤清, 调节pH值使灭菌后为pH7.0±0.2, 分装, 灭菌[2]。

1.2.4 4%TTC溶液

准确称取TTC2g, 溶于少量灭菌水中, 定容到50mL。置于冰箱中冷藏保存。临用时用肉汤稀释稀释至需要的浓度[7]。

1.2.5 甲砜霉素/氟甲砜霉素及其包合物原液的配制

分别精密称取甲砜霉素/氟甲砜霉素及其包合物适量, 按无菌操作溶于适宜的溶剂中, 并稀释适当体积, 使其含量均为1000μg/mL。待用。

2 实验方法

2.1 试验菌种悬液的制备

将大肠杆菌培养液接种肉汤培养基置37℃培养6h~8h, 增菌后的对数生长期菌液, 用生理盐水稀释至0.5麦氏比浊标准, 约含大肠杆菌1×108CFU/mL, 然后再用肉汤培养基稀释100倍后使用, 约含大肠杆菌1×106CFU/mL。

2.2 TTC肉汤显色液

按无菌操作, 量取4%TTC0.5mL, 用肉汤稀释至100mL, 此时, TTC浓度为0.02%。

2.3 甲砜霉素/氟甲砜霉素及其包合物使用液的配制

分别精密量取甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精、甲砜霉素原料、氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物、氟甲砜霉素原料药抗菌药物原液1mL, 分别用肉汤液稀释至5mL。其使用液浓度为200μg/mL。

2.4 甲砜霉素/氟甲砜霉素及其包合物抗菌活性测定

取1张无菌96孔板, 采用二倍稀释法测定。在每组1~12号孔, 加入肉汤液各0.2mL。然后在第A1、B1加入0.2mL甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精抗菌药物使用液, 第C1、D1加入0.2mL甲砜霉素原料药抗菌药物使用液, 第E1、F1浓度加入0.2mL氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物抗菌药物使用液, 第G1、H1加入0.2mL氟甲砜霉素原料药抗菌药物, 然后吸取0.2mL至第2孔, 混匀后再吸取0.2mL至第3孔, 如此连续倍比稀释至第10孔, 并从第10孔中吸取0.2mL弃去, 混匀, 此时每组1~10号的药物浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20μg/mL。然后后在每组1~10号孔内加入上述制备好的被测菌种悬液、TTC肉汤液各0.1mL, 此时每组1~10号的药物浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10μg/mL。最后, 在第11号孔加试验菌种悬液、TTC细菌显色液各0.1mL, 作无药生长对照, 第12号孔加细菌显色液各0.2mL作无菌对照。涡旋振荡混匀, 于37℃培养12h~18h观察结果。以未生长菌 (即未显红色) 的最低药物浓度作为MIC。

3 结果与讨论

3.1 甲砜霉素/氟甲砜霉素及其包合物抗菌活性

抗菌试验结果, 如图1和表1所示。

结果表明, 当甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物、甲砜霉素原料药当其药液的浓度大于12.5μg/mL时, 96孔板上A、B、C、D组的相应试验孔均无细菌生长, 其最低抑菌药物浓度 (MIC) 相同, MIC值12.5μg/mL;当氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物、氟甲砜霉素原料药当其药液的浓度大于1.56μg/mL时, 96孔板上E、F、G、H组的相应试验孔均无细菌生长, 其最低抑菌药物浓度 (MIC) 相同, MIC值1.56μg/mL。这说明甲砜霉素/氟甲砜霉素被包合后抗菌活性未受影响。

3.2 菌接种量、体外培养时间及TTC浓度的对最小抑菌浓度的影响

3.2.1 菌接种量

文献报道[9], 接种菌液的浓度与药物的最小抑菌浓度 (MIC) 有关, 在温度、培养时间相同时, 药物MIC值随着接种量的增大而升高, 为使试验条件保持一致, 将所有菌株接种浓度确定为2.5×105cfu·mL-1。

3.2.2 体外培养时间

文献报道[10]体外培养时间-MIC曲线显示药物的MIC在温度、接种量相同时, 随着培养时间的延长而趋于稳定, 为了得到稳定的MIC, 培养时间确定为16h。

3.2.3 TTC浓度

据文献报道[11], 显色剂TTC的最终浓度过低影响显色反应, 失去指示作用, 浓度过高有抑菌作用, 最佳浓度为0.005%TTC。另有文献报道[12], 显色剂TTC浓度过高对革兰氏阳性细菌有明显抑制作用, 对革兰氏阴性细菌无明显抑制作用。因此, 作者把TTC的最终浓度定为0.005%, 并选择革兰氏阴性细菌大肠杆菌作为试验菌株。

3.3 TTC比色法的应用价值

T T C比色法既可用于药物残留的检测, 还可用药物体外抗菌活性的测定。如果将细菌还原产物三苯甲臢 (TPF) 溶于适当溶剂, 用酶标仪测定其吸光度, 则可对血浆等样品中微量药物进行定量分析。

4 结语

该研究结果表明:甲砜霉素、氟甲砜霉素用羟丙基-β-环糊精包合物后, 在试验条件下, 其体外抗菌能力未受影响。TTC比色法简便、快捷, 用于药物残留的检测, 还可用药物体外抗菌活性的测定, 甚至生物样品的定量分析。由于大肠杆菌对氟甲砜霉素的敏感度要比甲砜霉素强, 因此, 在治疗鸡大肠杆菌疾病时, 最好应使用动物、畜禽专用抗生素氟甲砜霉素, 以减少治疗用量, 降低药物的残留。

摘要：目的:考察甲砜霉素、氟甲砜霉素被包合后, 其体外抗菌活性的变化情况。方法:分别配制一系列不同浓度的甲砜霉素、氟甲砜霉素原料药溶液和相应浓度的包合物溶液, 在以O78大肠杆菌为试验菌株的情况下, 氯化三苯基四氮唑 (TTC) 作为细菌是否存活的显色剂, 测定其最小抑菌浓度。结果:在体外试验条件, 甲砜霉素、氟甲砜霉素包合物的最小抑菌浓度与其原料药是相同, 体外抗菌活性未受影响。结论:该方法简便、快速、准确, 可用于甲砜霉素/氟甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合物抗菌活性的测定。

关键词：TTC法,甲砜霉素,氟甲砜霉素,包合物,抗菌活性

参考文献

[1] 张小华, 葛竹兴, 郁杰, 陶冠红.甲砜霉素-羟丙基-β-环糊精包合作用的研究[J].泰州职业技术学院学报, 2007, 37 (6) :44～46.

[2] 葛竹兴, 张小华.羟丙基-β-环糊精对甲砜霉素包合物制备和鉴定[J].南京师大学报, 2008, 31 (4) :74～79.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 (2000版二部附录) [M].北京:化学工业出版社, 2000.

[4] 刁有祥, 李久芹, 陈庆普.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医报, 2002 (1) :21～23.

[5] KUKUROVA I.Interactions of anti-microbiaLs in miLk and their detec-tion by the disk diffusion method and deLvotestSP[J].Jour-naL of AOAC InternationaL, 2003, 86 (3) :529～533.

[6] SHITANDI A.Laboratory evaLuation of the improved tube test detection Limits forβ-Lactam residues in Kenyan miLk[J].African JournaL of BiotechnoLogy, 2004, 3 (1) :82～87.

[7] GB/T4789.27-2003, 食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留量检验[S].中华人民共和国国家标准.

[8] 徐尔尼.快速检测大肠菌群数的研究[J].南昌大学学报 (理科版) , 2001, 39 (4) :339～343.

[9] 陈秀枢, 屠溥涛.微量肉汤稀释法测定MIC的评价[J].中华医学检验杂志, 1994, 17 (2) :95～97.

[10] 马志俊, 蒯迎平.TTC用于MIC结果的判读[J].临床检验杂志, 1996, 14 (1) :56.

[11] 曹杨.纸片法测定细菌总数——TTC显色浓度试验[J].江苏食品与发酵, 2008, 135 (4) :39～40.

[12] 张淑华, 沈文堪.TTC试剂抑菌效果试验观察验[J].中国公共卫生学报, 1998, 17 (1) :28.