灰黄霉素中去氯灰黄霉素杂质的提取和分离

2022-10-16

灰黄霉素 (griseofulvin) , 属于芳香族衍生物类抗生素, 分子式为C17H17Cl O6, 相对分子质量为352.77。生物合成灰黄霉素过程中, 缺少氯离子或氯化反应受阻时, 灰黄霉素的合成量下降甚至不能产生, 会通过一个分支反应途径, 形成去氯灰黄霉素。去氯灰黄霉素抗真菌的活性很弱, 会严重影响灰黄霉素的使用效果, 是灰黄霉素发酵产物中的主要杂质, 所以必须严格控制灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的含量。而在质量控制和检验过程中, 需要去氯灰黄霉素的纯品作为对照标准品。本文探讨了从灰黄霉素中提取和分离去氯灰黄霉素的条件和方法。

1 材料与方法

1.1 实验药品及来源:

灰黄霉素产品:由赤峰制药股份有限公司提供;试剂为分析纯, 设备仪器为实验室常规使用设备。

1.2 实验方法

1.2.1 薄层层析法考察洗脱剂的条件:

通过HPLC法测得灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的含量为0.3%。根据相关文献可知, 去氯灰黄霉素在丙酮和N, N-二甲基甲酰胺中具有较大的溶解度, 故分离去氯灰黄霉素的展开剂由乙酸乙酯与正己烷组成。本实验以不同配比的展开剂进行薄层层析对比分离效果, 并对比采用丙酮和N, N-二甲基甲酰胺作为溶剂的分离效果。

1.2.2 硅胶柱层析

a准备工作:取一柱长45cm, 直径约3cm的下端有沙漏和活塞的玻璃层析柱, 洗净, 凉干。取层析硅胶200克于大烧杯中, 加入配好的比例为正己烷:乙酸乙酯为1:3的展开剂至层析硅胶完全浸没, 密封, 放置24小时。

b装柱:向浸泡后的层析硅胶中加入适量展开剂, 用玻璃棒搅起硅胶沉淀, 然后将浑浊夜倒入玻璃柱中然后静止, 待硅胶沉淀完全, 放出适量展开剂, 再以同样的方法将剩下的层析硅胶装入柱内, 静置至沉淀完全, 始终保持液面高于层析硅胶上面。

c样品溶液配制:称取约30g的灰黄霉素产品于100m L锥形瓶中, 加入展开剂至100m L的刻度线处, 置于超声波仪器中超声30min, 取出静置至沉淀完全, 将上清液用滤纸过滤后收集滤液, 待用。

d层析分离:将过滤后的样品溶液加入到层析柱中, 加入样品溶液的高度约4cm, 流速每秒1-2滴, 用50m L锥形瓶接流出液, 做薄层层析, 收集带有去氯灰黄霉素斑点的流出液。

经过柱层析, 灰黄霉素和去氯灰黄霉素并未成功分离, 可能是溶剂丙酮影响了展开剂的比例, 使层析效果不佳。改为N, N二甲基甲酰胺溶剂后, 分离效果理想。去氯灰黄霉素在灰黄霉素产品中含量很少, 须经多次硅胶柱层析, 将所有收集到的去氯灰黄霉素溶液合并, 进行浓缩结晶, 才能得到一定量的去氯灰黄霉素溶液。

1.2.3 浓缩与结晶:

将含有去氯灰黄霉素组分的合并洗脱液用旋转蒸发仪进行浓缩, 60℃条件下蒸馏, 将得到的剩余溶液倒入干净的锥形瓶中, 加入少量水, 即有白色晶体析出, 经过滤、洗涤、干燥, 即得去氯灰黄霉素结晶。

1.2.4 产物的纯度检查:

采用反向HPLC法, 以乙腈:水=35:65为溶剂, 以乙腈:水:冰乙酸=40:50:1为流动相。采用面积归一化法计算产品的纯度, 在相同条件下测定去氯灰黄霉素和灰黄霉素产品的色谱图。

2 结果

2.1 薄层层析法考察洗脱剂的条件

2.1.1 丙酮作为溶剂时薄层层析法结果:

各比例展开剂的薄层层析实验图如图1, 其中1为去氯灰黄霉素, 2为灰黄霉素。其中展开剂正己烷:乙酸乙酯的比例分别为:a=1:1, b=1:2, c=1:3, d=2:1, e=3:1。由图可知, 样品中物质分离且样品点展开位置比较理想的是正己烷:乙酸乙酯为1:3的展开剂。

2.1.2 N, N-二甲基甲酰胺作为溶剂时薄层层析法结果:

不同溶剂所得薄层色谱图效果如图2。其中1为去氯灰黄霉素, 2为灰黄霉素。f是以N, N二甲基甲酰胺为溶剂, g是以丙酮为溶剂。对比可知, 以N, N二甲基甲酰胺为溶剂时, 样品中物质分离较好, 且样品点展开位置比较理想。

2.2 硅胶柱层析结果

采用HPLC面积归一化法计算去氯灰黄霉素的纯度为90.5%, 保留时间为10.640, 谱图见图3。在相同条件下测定灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的保留时间为10.429, 谱图见图4。

3 结语

通过实验分析可知, 在展开剂中正己烷:乙酸乙酯为1:3时, 灰黄霉素和去氯灰黄霉素有较好的分离效果, 因此选择正己烷:乙酸乙酯 (1:3) 的展开剂为柱层析的洗脱剂, 以N, N二甲基甲酰胺为溶剂, 分离得到的去氯灰黄霉素, 其HPLC主峰保留时间 (t=10.640min) 与灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素峰的保留时间 (t=10.429min) 基本一致, 说明所得产物为去氯灰黄霉素, 且纯度可达90.5%。

摘要：采用薄层色谱法和硅胶柱层析法对灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素杂质进行分离提取。利用柱层析硅胶为固定相, 正己烷-乙酸乙酯 (1:3) 为洗脱剂, 进行单向一次性色谱分离得到去氯灰黄霉素, 用HPLC法测得其纯度为90.5%。

关键词：灰黄霉素,杂质,去氯灰黄霉素,薄层层析,硅胶柱层析。