化学液相色谱测定硫酸庆大霉素组分探析

2022-11-15

庆大霉素 (Gentamicin) 主要成分由小单孢菌所产生, 为一种多组分抗生素。性状为常用其硫酸盐, 为白色或类白色结晶性粉末、无臭、有引湿性。在水中易溶, 在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中不溶。对大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、绿脓杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素沙雷杆菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用。庆大霉素是一种杀菌力较强的广谱抗生素, 对多种革兰氏阴性菌和阳性菌有较强的抗菌作用。特别对绿脓杆菌和金色葡萄球菌有良好的抗菌作用。

庆大霉素的化学结构属于氨基糖苷类抗生素, 它是一族由小单孢菌产生的四个庆大霉素主要组分c1、c2、c1a c2a及许多庆大霉素次要组分组成的多组分抗生素。几个次要组分如西梭霉素、庆大霉素c2b、加纳米星、庆大霉素B, 还有c1、c2、c2a的前体, 因此色谱分离就成了重要的分析手段。由于庆大霉素在紫外没有吸收峰, 因此HPLC方法结合了柱前衍生来检测各组分, British Pharmacopoeia 2000, Europe Pharmacopoeia4.0, United States of America Pharmacopoeia 28, 中华人民共和国药典2000都是以HPLC方法结合了柱前衍生来检测庆大霉素各组分的。在这个系统中西梭霉素、庆大霉素c2b、加纳米星、庆大霉素B都没有得到很好的分离。庆大霉素c2b的出峰位置在c1的上升处, 在c1区域没有很好的分离;西梭霉素的出峰位置在C2a和C2相连处, 也没有得到很好的分离。由于庆大霉素中有电活性分子, E u r o p e Pharmaeopoeia 4.5版采用脉冲电化学检测器 (PED) , 使庆大霉素在外加电压的作用下, 在检测池内产生电解反应, 即在工作电极表面进行氧化还原反应, 产生不同的电流, 从而检测器能检测庆大霉素的各组分。脉冲电化学检测器使用了快速、连续多重的3种不同工作电位 (工作电位, 清洗正电位, 清洗负电位) , 在极短的时间 (60ms为增量) 不停采用多重顺序电位, 只要所设定的工作电位能保证所有被测的电活性分子都处于扩散控制平台区内, 就能检测庆大霉素的各组分及杂质。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学液相色谱仪DX一600 (Dionex公司) , 紫外检测器液相色谱仪HP1 100 (Agilent公司) , 超纯水制备仪 (MILLIPORE公司) , 超声波清洗器 (KQ-50型) ;苯乙烯一二乙烯基苯共聚物 (8 m m) 色谱柱, 粒径:100nm, 规格:4.6×250mm (PLRP—S PolymerLaboratories, shroshire, uk) 。四氢呋喃、磷酸二氢钾、磷酸均为国产分析纯试剂, 无水硫酸钠、辛基磺酸钠、氢氧化钠均为进口 (Merck公司) 分析纯试剂。庆大霉素标准品为欧洲标准品, 硫酸西梭霉素标准品 (LOTIOC238) 为美国标准品, 加纳米星标准品 (QS一00404—2) 为福抗药业的工作标准品。

1.2 实验部分

流动相:称取60g无水硫酸钠, 1.75g辛基磺酸钠, 8mL四氢呋喃和50mL0.2M磷酸二氢钾 (称取27.22g磷酸二氢钾溶解于1000mL水中, 用磷酸调pH为3.0) 溶于1000mL水中, 溶解并混匀。

柱后淋洗液:取无碳酸盐的20%氢氧化钠溶液1∶25稀释脱气后, 经375uL聚合物混合螺管, 无脉动加入;流速约为0.3mL/min。

样品溶液:取硫酸庆大霉素样品50mg, 加流动相溶解至100mL, 配制浓度为0.50mg/mL。标准品溶液:参比溶液 (a) :取硫酸庆大霉素标准品50mg加流动相溶解至100mL;参比溶液 (b) :吸取参比溶液 (a) 5mL加流动相稀释至100mL。

检测条件:流速为1mL/min;分析时间为庆大霉素Cl保留时间的1.2倍;进样量为20uL;柱温为50℃;灵敏度约为luc;检测器应保持在35℃。检测器为ED50脉冲积分安培检测器, 配置3mm金工作电极, Ag/AgCl参比电极和不锈钢池体为对电极;检测电位为+0.05V, 氧化电位为+0.75V, 还原电位为-0.15V。

测定:参比溶液 (a) 中C2a与C2的峰一谷比应不小于2.0。小于参比溶液 (b) 中C组分的平均峰面积可忽略不计。C组分的出峰J顺序为C1a、C2b、C2、C2a和C1。以峰面积归一法计算样品中各组分的含量。

2 结果与讨论

2.1 硫酸庆大霉素两种检测器测定方法的比较

硫酸庆大霉素样品中含有C1、C1a、C2、C2a及C2b。

2.2 本方法检测硫酸庆大霉素组分及杂质方法的验证

(1) 方法的精密度考察。应用本法对同一样品平行测定6次, 计算各组分及相关物质测定结果的相对标准偏差 (RSD) 分别为C1a:1.1%;C1:1.0%;C2+C2+C2b:0.2%;单个杂质:1.6%;杂质总和:1.6%。 (2) 方法的耐用性考察。采用本法更换同一型号不同批号的色谱柱;流动相主成分四氢呋喃的量改变+1%和-1%;柱温分别变更为50℃, 60℃;柱后淋洗液流速改变+10%和-10%;色谱条件改变后测定结果分别与基准条件时测定的原结果, 计算其合并相对标准偏差 (RSD) 。 (3) 线性测定。分别配制样品浓度为0.4、0.45、0.5、0.55、0.6mg/mL的溶液。在拟定的色谱条件下测定, 绘制工作曲线。以峰面积A (nC·min) 对浓度C (mg/mL) 回归计算, 结果表明线性关系良好。 (4) 方法的检测限考察。配制适当浓度的标准品溶液, 注入色谱仪, 记录色谱图, 其硫酸庆大霉素C2a组分峰高应为基线噪音2~5倍, 此浓度即为检测限。检测限为0.002mg/mL。

3 结语

通过对两种检测器检测方法的比较, 采用紫外高效液相色谱仪检测硫酸庆大霉素, 不但样品前处理时间长, 而且无法分离C2b峰和C1峰, 因此导致C1组分和杂质分析不准确。采用电化学检测器液相色谱仪测定, 样品无需前处理只要用流动相溶解, 就可直接进样, 本方法有很高的检测灵敏度, 也有很好的精密度和耐用性, 具备较大的线性范围。但电化学检测器中的金电极较容易钝化必须经常抛光, 且所用的试剂的纯度要高, 这样才能得到较好的重复性。从上述实验结果可知, 电化学检测器具有较高的准确性等特点, 是一种高灵敏度的方法。

摘要：采用电化学检测器液相色谱测定硫酸庆大霉素组分及杂质, 无需采用衍生化反应, 可以直接进样, 且检测灵敏度高、分离效果好。该方法在所测定的范围内具有良好的线性 (相关系数r>0.99) , 重复测定及耐用性的相对标准偏差组分均小于2%, 杂质均小于10%。结果表明该方法测定硫酸庆大霉索组分及杂质是一种简便、准确的分析方法。

关键词：硫酸庆大霉素,庆大霉素,电化学液相色谱仪