生物化学实验技术

第一篇：生物化学实验技术

《生物制药技术》实验指导

实验一 金霉素链霉菌培养基的制备(验证型)

实验目的：

1、学会培养基的配制

2、掌握灭菌方法。 实验原理：

金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)亦称“金色链霉菌”， 放线菌门(Actinobacteria)， 放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素，故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色，长孢子后变青色。在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。抗菌素工业上用以生产金霉素。

放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状，故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密，不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病;有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶;有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。

四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。 器材：

1ml移液枪;铝锅;电炉 试剂：

NaBr母液(100 g/L) KCl母液(100 g/L)

M-促进剂母液(2.5 g/L) 实验步骤： 1.种子培养基

种子培养基(g/L)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4， (NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先称取黄豆饼粉20g，单独煮沸10分钟，加入少量凉水降温，4层纱布压榨取汁，与其它称好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分装到250ml三角瓶中，每组2瓶。 2.定向发酵培养基

1 发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉100，黄豆饼粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5， (NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同种子培养基，配好后分装到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分别加入如下成分，比较它们对四环素产量的影响：

(1) 对照(不加其他成分);

(2) 加入NaBr母液至终浓度为2g/L; (3) 加入KCl母液至终浓度为2g/L;

(4) 加入NaBr母液至终浓度为2g/L及M-促进剂母液至终浓度为0.025g/L。 每两组配一套。 3.灭菌

将封好口的培养基121℃灭菌30min。同时灭1ml 剪口移液枪头、1.5mL离心管。 (总过程：称量——溶化——定容——分装——封口——灭菌) 注意事项：

1.黄豆饼粉煮沸取汁。

2.培养基封口最好用8层纱布或棉花塞，最好不用橡胶塞，以增加透气性。 3.灭菌时锅内要补足水分。由于灭菌锅较大，升温排气一定要充分(10min)。 补充阅读：

工业发酵中利用生产菌发酵得出最终产物是一个逐级放大的过程，各个不同的阶段对于营养成分的要求也各有特点，根据发酵不同阶段的要求，培养基可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。

孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富(特别是有机氮源)，否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖-硝酸盐-其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的pH和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。

种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。

发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。

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实验二 金霉素链霉菌的定向发酵(验证型)

实验目的：

1、学习和掌握无菌操作技术。

2、掌握定向发酵四环素的原理。 实验原理：

定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。

金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：

R1 R2 Cl H H OH H H

金霉菌原是产生金霉素(Chlortetracycline)的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。另外，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强;当温度超过35℃时则只合成四环素。

本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。 材料和试剂：

金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(菌种保藏号：CGMCC4.1043;订单号20111133 550元)。 实验步骤：

前期准备工作：配制斜面培养基(可选，1号培养基由菌种保藏中心提供)

1、麸皮36.0 g， K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，(NH4)2HPO4 3 g，琼脂 15～20 g，定容至1L，pH 7。

2、可溶性淀粉20g，KN O3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl

0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.2~7.5。

1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中(不加琼脂的斜面培养基)，28℃下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入斜面培养基，28℃培养5～7天， 金霉素 土霉素 四环素

3 待孢子长成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、种子培养：在斜面上用接种铲挑取1cm2左右生长良好的菌体接入装有50ml四环素种子培养基的250ml锥形瓶中， 230 r/min、28℃下振荡培养20～24h。

3、发酵培养：以剪口移液枪头取10 ml种子液接入装有100ml发酵培养液的500ml锥形瓶中(注意：同一处理组用同一瓶种子液接种)，230 r/min、28℃下振荡培养5 d。用于后面的测定效价和薄层层析实验。

四环素的提取和精制(选作)

一、实验目的

1 .掌握沉淀法精制四环素的原理、方法和基本操作技术。 2 .熟悉pH 的控制与产量、质最的关系。

二、实验原理

四环素为两性化合物，其等电点为5.4 。当溶液pH 等于等电点时，四环素呈游离碱形式，从水溶液中沉淀出来。利用四环素的这一性质，可将四环素从发酵液中提取出来。

在连续结晶过程中，pH 的高低对产量、质量都有一定的影响。四环素的等电点为5.4 , 在pH 4.5~7.5 之间，游离碱在水中的溶解度乎不变。若pH 控制在接近等电点时，沉淀结品虽然比较完全，收率也高，但此时会有大量杂质同时析出，影响产品的色泽和质量;若pH控制得较低一些，对提高产品质量虽有好处，但沉淀结晶不够完全，收率会低些，影响产量。因此，在选择沉淀结晶pH 时，就必须同时考虑到产量、质量的效果。在正常情况下，工艺上控制pH4.8左右。若沉淀结晶质量较差，pH可控制得稍低些，有利于结晶质量的改善，但不能低于4.5，否则收率低，影响产量。

四环素的提取和精制分酸化、纯化、过滤、结晶和淋洗五个步骤。

(1 ) 酸化加入草酸，使积聚在菌丝体内的四环素尽可能多地成为可溶性盐，而转入液相。四环素在酸性条件下较隐定，且草酸与钙离子反应生成不溶性的草酸钙，析出的草酸钙能促进蛋白质的凝固，提高滤液的纯度和过滤速度。

( 2 )纯化 纯化剂(黄血盐、硫酸锌和硼砂)与草酸一起混合作用，可以除去发酵液中大量酸溶性蛋白质、铁离子和其他多种离子色素以及其他杂质，从而使滤液纯净，并减少发酵液的粘度，利于过滤。其中纯化剂黄血盐能与发酵液中的铁离子作用，生成普鲁士盐而除去铁离子。

( 3 )过滤 通过过滤，使四环素溶液与菌丝体以及其他杂质分离，再经过复滤、精滤，进一步提高滤液质址，得到澄清的滤液。

( 4 ) 结晶

将滤液的pH调节到等电点，在较低温度下析出纯净的四环素。

( 5 )淋洗 虽然发酵液经酸化后大部分四环素已溶入溶液中，但仍有部分残存在菌渣中，且过滤不可能十分彻底。所以用酸水淋洗，以提高收率。

三、实验试剂及仪器 1.试剂

300 g/L草酸溶液、200 g/L 黄血酸钾溶液、200 g/L 硫酸锌溶液、200 g/L 硼砂溶液、浓氮水、3 g/L草酸溶液。 2.仪器

1000 mL 烧杯、搅拌器、布氏漏斗、抽滤瓶、滤纸、量筒、pH 试纸、酸度计、温度计、水泵、表面皿。

四、实验步骤 1.酸化

取600ml 四环素发酵液，置装有机械搅拌的1000 mL烧杯中，开始搅拌，待发酵液温度降至20 ℃ 以下时，缓缓加入草酸溶液，草酸加入量为27～35g/L，并不时测定发酵液的pH。当发酵液pH为1.7~1. 8 时(用酸度计测定)，酸化完毕。 2.纯化

在酸化反应的烧坏中，按酸化的发酵液净体积，搅拌下依次缓慢加入纯化剂(黄血酸钾溶液、硫酸锌溶液、硼砂溶液)，每种溶液终浓度均为2 g/L，加入时间间隔15min ，以便作用完全。 3.过滤

将布氏漏斗装于抽滤瓶上，铺好滤纸，开启水泵，用少量水将滤纸湿润，并使滤纸紧贴布氏漏斗。将纯化后的溶液缓缓倒入布氏漏斗，过滤滤液应完全澄清，否则必须重新过滤，直到完全澄清。 4. 结晶

将抽滤瓶中的滤液倒入装有机械搅拌的1000 mL烧杯中，开动搅拌，并用水或冰水冷却。待滤液温度冷至5 ～ 7 ℃ 时，徐徐加入经过滤的浓氨水，并随时用pH 试纸测定溶液的pH，当pH 达到4 . 6 ～4 . 8 时(用酸度计测定)，停止加入氨水，并继续搅拌2 h，使结晶完全。

装好布氏漏斗后，将上述液缓缓倒人布氏漏斗，过滤。结晶液全部倒入后，抽干。用35～45 ℃ 的热水充分洗涤粗碱3 次，抽干，再用0 . 3 %草酸洗涤，抽干。

五、注意事项

1.纯化搅拌时间不应少于2h，溶液温度保持在15 ℃ 以下。 2.pH 要调准确。

六、结果与讨论

1 .计算四环素的得率。

2 .讨论影响四环素得率和纯度的因素。

实验三 四环素、金霉素的薄层层析鉴定(验证型)

实验目的：

掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理：

层析(色谱，chromatograpby)是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体(与上述液体不相混合的)或气体作为移动相的系统中(根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种)，使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析(column chromatography)，在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物(硅胶、纤维素和淀粉等)作为固定相的称为薄层层析(thin layer chromatography)，或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质(试料)间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来 5 也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物(通常为共价键)结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。

分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快(阻力小)。

薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。

仪器和设备：

1. 玻璃层析缸

2. 层析板 (薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售) 3. 毛细玻璃管或微量注射器 4. 紫外投射仪 试剂：

四环素、金霉素标准品 用0.01M盐酸溶解定容，4℃冰箱保存(可使用7天)。 展开剂：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5) 2L。 凡士林 实验步骤：

1.层析板处理

层析板105℃烘烤过夜，均匀喷上0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH4.5)，于空气中晾干、备用。

2.点样

选取两种定向发酵液加草酸酸化至pH为1.5～2.0，取上清约l .2 ml于1.5ml离心管中，10000 rpm，5min，备用。在距层析板底边2.5~3 cm起始线上(用铅笔划线，做出点样点记号)，用毛细玻璃管在薄层层析板上点四环素标准品和金霉素标准品溶液3次，发酵液上清点8～10次，点样点不大于0.4cm，每次都要吹干后再点。(一般效价在1000u/ml以上点3次，500～1000u/ml点4次，200～500u/ml点5次)。剩余的发酵液上清于4℃冰箱保存。

3. 层析(展开)

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展开剂。层析前需预先用展开剂预平衡层析缸，可在缸中倒入2cm高的展开剂，密闭，一般保持15-30分钟。然后将层析板置于盛有展开剂的层析缸中，在室温下展层6～8h(与温度有关)。封口不严可涂抹凡士林。

4.荧光显影

待溶剂前沿展至板的一半以上时将层析板取出，标出溶剂前沿，于通风橱中晾干，用氨水熏数秒钟后即可在紫外灯下显影，画出黄色斑点，分别算出Rf值。(四环素标准品慢和金霉素标准品快)

6 无水四环素在波长365nm下显黄色荧光，根据与标准对照可定性测定。 注意事项：

因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH=1.5～2.0，使四环素尽量溶解。

点样时必须注意勿损伤薄层表面。要控制好点样量，样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象。

若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。

作展开剂中极少量强极性溶剂(0.5%)或pH值的改变可显著改善拖尾现象。

实验四 四环素的效价测定(综合型)

实验目的：

1、了解抗生素效价的表示方法

2、学习抗生素的测定方法 实验原理：

实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。效价(titer或titre)是评价抗生素效能的标准，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，也是衡量发酵液中抗生素含量的尺度，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。

四环素和金霉素在酸性条件下，加热，可产生黄色的脱水金霉素和脱水四环素，其色度与含量成正比。

在碱性条件下，四环素较稳定，而金霉素则生成无色的异金霉素：

根据上述原理，可以在酸性条件下，利用比色法测定四环素、金霉素混合液的总效价;而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无色的异金霉素，然后再在酸性条件下，使四环素生成黄色的脱水四环素，经比色测得四环素效价。总效价与四环素效价二者之差即为金霉素的效价。本实验只测定四环素的效价。

因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH=1.5～2.0，使四环素尽量溶解。发酵液中，由于杂质的干扰，将影响比色的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)，可以减少杂质对比色反应的干扰。 实验步骤：

取上述保存的处理发酵液上清l ml (效价约为1000U/m1)于50ml容量瓶中，加入lml浓度为lg/l00ml EDTA溶液，加蒸馏水9ml，再加入lml浓度为3mol/L的NaOH，在20~25℃下保温15min后，加入2.5ml浓度为6mol/L的HCl，煮沸15min后，冷却，稀释至刻度，在分光光度计上于440nm处测定其吸光度值。(紫外为100-390nm;可见光为380-780nm，根据波长选择石英比色池或玻璃比色池，否则玻璃对于紫外光有吸收)

对照样品(不加诱导剂)的前处理方法与上述步骤一样，只是在加入HCl后，不加热，稀释至刻度，作为测定样品的空白对照, 调零。

四环素标准品(1000U/ml)取1ml于50ml容量瓶中，加1ml浓度为6mol/L的HCl，水浴煮沸15min后，冷却，稀释至50ml，380nm测吸光度。(以蒸馏水作为空白测定)

以定向发酵培养基中的对照组作为空白对照，测定其它三个处理组的吸光度。(有时可能因对照组处理不当而使其它组的读数为负值，这时可以以蒸馏水作为空白。)

计算公式：

发酵液中四环素的效价=

A发酵 A四环素标准

×四环素标准品的效价

第二篇：《园艺植物生物技术》实验教案

实验一 现代生物技术实验室与实验仪器

一、实验目的

实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。

二、实验场所选择及实验内容

园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等;与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。

三、实验方法与步骤

1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。

2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况;针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。

四、实验注意事项

实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。

五、思考题

1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。

2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些?实验二 质粒DNA的提取、纯化及检测

一、实验目的

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

三、主要仪器及试材

含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。

液氮、及DNA提取有关试剂。

四、实验方法与步骤

(一)试剂配制:

1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，蛋白胨(Peptone)10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶(250ml/瓶)。高压灭菌15min，室温贮存。

2、X-gal(20mg/ml):20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG(200mg/ml):1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。

4、Amp(100mg/ml):1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。

7、溶液III:醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml(视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制)，贮存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml，0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

9、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)。

10、乙醇(无水乙醇、70%乙醇)。

11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

12、溴化乙锭(EB)：10mg/ml

13、Rnase A(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。

14、6×loading buffer(上样缓冲液):0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%(W/V)蔗糖水溶液。

15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5ug/ml(注意：EB为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液1×TBE)，即可上样。

(二)实验步骤

1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。

2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。

3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液;吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。

4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀(注意：应彻底混匀沉淀或碎块)。

5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀(不可剧烈震荡)，并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解(溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。

6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀(溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀)。

7、吸取800ul上清液(注意：不要吸到漂浮的杂质)至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。

8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。

9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE(含RNase A 20ug/ml)，37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。

10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。

五、实验注意事项

1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。

2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。

3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。

六、思考题

简述质粒DAN提取的步骤。

实验三 PCR技术

一、实验目的

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。

二、实验原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。

三、主要仪器及试材

含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA;外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。

四、实验方法与步骤

1、调整模板浓度至5ng/ul。

2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒(注意加1滴矿物油覆盖PCR管)。

Template DNA

2ul(20ng) 10×buffer

2.0ul MgCl2(25mM)

1.5ul Primer F(10uM)

0.2ul Primer R(10uM)

0.2ul dNTPs(2mM)

2.0ul Taq(5U/ul)

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反应循环条件设置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳

5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳;EB染色，紫外观察。

五、实验注意事项

1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计;引物分装成多管，不宜反复冻融多次;

2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作;

3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件;

4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。

六、思考题

简述PCR技术的原理和步骤。

第三篇：土壤微生物的分离培养技术实验报告

重庆大学研究生专业实验教学

实验报告书

实验课程名称： 实验指导教师： 学

院： 专业及类别： 学

号： 姓

名： 实验日期： 成

绩：

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;

2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术;;

3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能;

4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。

二、实验原理

1、培养基的种类

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基;根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。

已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。

培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。

2、接种方法与无菌接种

将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。 接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。

划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。研究霉菌形态时就常用此法。

穿刺接种是用针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。该法常用于厌氧菌种的保藏或微生物的动力研究。

混浇接种是先将待接的微生物放入培养皿中再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就被稀释了。待平板凝固后，置于适宜温度下培养，就可以长出单个菌落的微生物。

涂布接种是将菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出单个菌落的微生物。

本实验采用的是划线接种。为了防止接种时引入其它微生物，整个操作过程均需在无菌操作台上进行，还需对操作员的双手进行酒精消毒，每次划线前都需灼烧接种环，接种时才打开培养皿且不能全部打开，接种完马上关上。

三、实验器材

1、仪器

培养皿、 量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、15ml离心管、试管架、镊子、电磁炉、锅、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、酒精灯、天平、滤纸等。

2、材料

土豆、琼脂、蒸馏水、酒精、土壤样品

四、实验步骤

1、土壤稀释液的配制

① 在菜地用九点取样法取适量土壤样品，具体操作为：在菜地选取九个取样点，在每个取样点取相同量的表层土壤(10cm左右)，然后将其混合均匀;

② 称取1g土壤样品与99ml蒸馏水，将其配制成100ml的土壤溶液; ③ 用移液管取9ml蒸馏水于15ml离心管中，再用移液枪取1ml前一步已配制的土壤溶液于离心管中，摇匀，即为10-3的土壤溶液;

④ 重复前一步，将土壤溶液稀释为10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀释液。

2、土豆培养基的制备

① 用天平称取200g土豆，清洗干净后去皮切丁;

② 用量筒量取1000ml蒸馏水与电磁炉锅中，再加入已准备好的土豆，将其煮烂;

③ 从锅中取出已煮烂的土豆，用纱布过滤，滤液待用; ④ 称取20g琼脂与滤液中，再用蒸馏水定容至1000ml;

⑤ 在制备好的滤液中加入0.1ml菌液，然后放入高温灭菌锅中，在121℃下灭菌20min;

⑥ 取出已灭菌的土豆培养基，待其熔化后冷却至60℃，倒入每付平板约15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接种与分离

① 将接种需要的所有器材均放置于无菌操作台上;

② 用浸泡在酒精里棉花给双手灭菌，点燃酒精灯，右手拿接种环，左手拿培养基;

③ 将接种环放在火焰上烧灼，待其冷却后在10-6土壤稀释液中蘸取少量液体，打开培养基的一部分，采用划线接种，使之形成单菌落，一共划线3-4次，每划线一次就需在火焰上烧灼一次;

④ 重复上步，接种10-

7、10-8的土壤稀释液的微生物;

⑤ 接种完的培养基放在恒温培养箱中倒置培养48h，取出观察。

五、结果与思考

1、实验结果

图1 实验结果如图1所示。由图1可知，采用划线接种土壤微生物的培养皿里有单菌落出现，这说明划线接种能达到分离培养的目的。

学习过微生物这门课程的同学都知道，真菌的菌落较大且疏松，菌丝细长，呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑，孢子会呈现红色、褐色、绿色、黑色、黄色等不同的颜色;细菌的菌落较小，形状表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多为白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有细菌。

2、思考题

⑴在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉?

答：这么做的主要目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，以使下次划线的菌种直接来自于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少，从而达到分离菌株的目的。

⑵为什么要把培养皿倒置培养?

答：①操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌，倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上;

②培养过程中，细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物，释放热量及有水排出，如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中，影响菌落的生长; ③如果培养目标是收集细菌代谢物，而且代谢物易溶于水，倒着培养可能会方便收集。

六、实验总结 我本科所学专业是材料科学与工程，本次实验是我高中后第一次接触微生物方面的知识。在本次实验课里，段老师先给我们详细讲解了微生物分离培养方面的许多理论知识，然后才进入了理论环节。在实验操作过程中段老师一直在我们旁边观察我们的实验操作过程，一旦出现错误，会立即指出并耐心的给我们讲解应该怎么做，我担心自己从来没做过微生物培养方面的实验会做不好，段老师还一直在旁边鼓励我，并给我讲解了许多微生物分离培养方面的知识，最后我独立完成了本次实验。此次实验课，我真的是受益匪浅，学到了许多微生物分离培养方面的知识，十分感谢段老师。

图2 如图2所示，本次微生物分离培养实验中，有些培养皿里菌落很少，只有一个，有的甚至没有。我认为出现这种情况原因可能是：划线接种时，未等接种环冷却就开始接种，微生物可能被高温杀死;在接种时，酒精灯火焰太大，进行接种操作的全过程又离酒精灯火焰很近，这也可能将微生物杀死。

第四篇：微生物实验室无菌操作技术规范

1. 目的

规范无菌操作流程，减少及避免发生染菌现象出现。

2. 使用范围

无菌室及洁净区的操作。

3. 无菌操作技术原则

3.1 环境要清洁，在每次无菌操作结束后都需要对环境进行清理、清洗;且避免操作前进行清扫。

3.2 做好个人卫生，进入无菌室前需修剪指甲、洗手，穿好无菌服，帽子需遮住所有头发，口罩遮住口鼻。

3.3 在无菌操作时，不可讲话，打喷嚏，对怀疑染菌的无菌物品，不可使用。

4. 内容

4.1.1准备：工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲;备齐用物(如：接种针、接种环、酒精灯、斜面、平皿、摇瓶、75%酒精棉、无菌水等);核对无菌用品，接种菌种的种类、型号。

4.1.2 所有实验使用的物品都需要进行消毒、灭杀;进入洁净区前需要经传递窗进行紫外表面消毒30min以上;

4.1.3 开始实验前需要打开超净台的紫外灯，消毒半个小时以上;超净台避免放入过多的物品(一般只放入当次的实验所有的物品)，所使用的试剂和耗材都需事先进行灭菌(灭菌日期超过4天的需重新消毒)。

4.1.4 进入洁净区前关闭紫外灯，并打开风机，等待半个小时以上，使臭氧尽量排放干净。 4.1.5 除去手腕等部位的饰品，穿好无菌服，戴好头套、口罩，做到“三不漏”：不暴漏头发，不暴漏口鼻，不暴漏躯干皮肤和衣物。 4.1.6双手要进行清洗、消毒。

4.1.7要经风淋室风淋30秒后再进入洁净室。 4.1.8在局部百级区域操作要戴一次性无菌手套。 4.1.9 实验操作过程中应尽量减少进入洁净区的人员(不超过4人/间)并尽量减少人员走动。 4.1.10 所有要放入超净工作台的物品都需进过消毒液喷洒擦拭消毒。

4.1.11无菌物品若取离超净台则视为已污染，不得放回再用;无菌液体在取离超净台前必须密封其开口;密封的无菌液体容器在放入超净台后，对其开口前须对开口在酒精灯火焰上烧烤。

4.1.12在拆开任何一次性无菌使用耗材的包装时都要在超净台内完成，并须同时保证与细菌直接接触的使用端/面不得与超净台内的任何物品发生触碰。 4.1.13工作台面上的用品要放置有序、布局合理，一般说酒精灯(当工作不需要时也可不用)在中间，右手使用的物品在右侧，左手使用的物品在左侧。工作时忌忙乱而要有序。 4.1.14 开始操作前先用医用酒精对双手进行消毒。 4.1.15点燃洁净工作台内的酒精灯，在打开/关闭试剂瓶口、试管口时应将瓶口或者试管口过火;接种针、接种环在使用前或在与台面发生碰触后应经过火焰的灼烧;接种针/接种环过火操作方法为：使其头部到身部反正面在火焰上各烤燎通红;烧过的器械要冷却后才能使用，以免对细菌造成损伤。

4.1.16操作前试管(或摇瓶)口需要在火焰上方反转镣铐两周。 4.1.17操作时左手拿试管(或摇瓶)，右手拇指、食指、中指操作接种针(接种环)，右手小指和无名指夹住瓶塞，取下瓶塞，瓶塞再反转镣铐两周后开始操作。 4.1.18在超净台内，尽量避免瓶口长时间敞开直立。

4.1.19盖封瓶口时，应将瓶口和瓶盖内面各自在火焰上燎烤两周再盖上瓶盖。

4.1.20实验用胶塞、橡皮乳头等橡胶和塑料用品在过火焰时也不能时间过长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养的细胞。 4.2 无菌液体标准转移程序：

4.2.1无菌液体的转移须在超净台进行，转移过程要尽量保持密闭，必须用移液管或移液器来完成操作;

4.2.2 移液管上方口应塞入棉絮(脱脂棉)，用牛皮纸包好进行消毒灭杀;

4.2.3无菌液体瓶再封口时，须将瓶口和瓶盖分别燎烤2周后再封盖;封盖后须贴上相应的标签;

4.2.4在使用移液管转移液体时，应保证移液管尖端距移液器边缘1cm以上;在使用移液管时，每次液体吸入量不应超过移液管的警示标记，更不能触及移液管上方的防尘棉絮;在使用移液管移出废液时，移液管尖端应距废液缸5cm以上;在将细胞悬液转移至培养瓶中时，移液管尖端应距培养瓶0.5cm以上;

4.2.5放置吸管时管口应向下倾斜，以防液体倒流入橡皮乳头内而引起污染或者损坏电动移液枪;

4.2.6向离心管、细胞冻存管、培养瓶、培养皿内添加液态物质时，所加入的量不应超过管上所标示的最大量;

4.2.7实验人员在操作时，应保证开口离心管或开口试剂的上方为不可逾越区;严格禁止采用双臂交叉的方式来拿取尚在开口状态的离心管或试剂瓶;在面向操作台工作时勿大声讲话或咳嗽，以免喷出的唾沫把细菌带入工作台面发生污染;

4.2.8在使用细胞刮刀时，手握部位应尽量远离培养瓶口，以防污染;

4.2.9如果在转移任何液态物质的过程中出现滴漏，则应立即使用消毒液浸泡的棉球或纱布擦净;

4.2.10使用完毕的实验耗材应在第一时间内处理完毕，避免堆积在超净台内或层流罩上，以防污染;

4.2.11当所有操作完成后，应及时使用消毒液对台面进行清理;擦拭完毕后再开启紫外灯照射一个小时。

第五篇：信息技术在中学化学实验教学中的应用

常德市西湖区第一中学

摘 要

化学实验是中学化学教学中最重要的组成部分，由于实验条件的限制，部分化学实验的科学性、直观性、探索性和操作性等特点在教学中未能真正体现，使现有部分实验不能完全地发挥其教学作用。而现代信息技术应用于化学实验教学中，可克服实验条件的限制，提高化学实验的可见度，增加化学实验的时效性，保障化学实验的安全性，加强学生实验操作的规范性，创造学生进行实验设计的条件，丰富学生的实验知识等，以期最大限度地发挥实验的作用,提高学生学习化学实验的兴趣。

关键词：化学实验、化学网络实验、多媒体课件

本文根据笔者及同行从2007年11月开始承担省级课题《利用网络环境提高高中学生化学实验的兴趣》进行高中化学网络实验教学的探索,近几年来在化学网络实验教学实践中的一些经验和体会,以化学课程和信息技术的整合的理论为基础,总结了信息技术在化学实验教学应用的一点体会。

我们进行化学信息技术在化学实验教学一般包括录像、视频技术，计算机多媒体课件和网络技术在化学实验教学等几方面。现就以下几方面在实验教学中的应用进行探索和研究。

一、录像、视频技术在化学实验教学中的应用

(一)、加强演示实验的时效性

有些演示实验的全过程需要较长的时间，且伴随着一些无关紧要的实验现象，干扰学生正常观察实验现象，影响实验的效果。由于学生课堂学习时间是有限的，要让学生在有限的时间内尽可能多地获得信息，给予学生的信息要有选择，使学生观察到的现象对所需习得知识有价值。因此，采用摄像、剪辑技术，对实验的全过程进行加工，既为学生提供实验的全过程，又突出重要的实验现象，同时也不失实验的真实性。例如，高中化学中石油的分馏等实验可采用此技术在课堂上播放，大大增强演示实验的时效性。当学生在很短的时间内看到分馏的全过程，不仅对分馏要领理解，而且对蒸馏与分馏概念的理解更深刻。

(二)、保障演示实验的安全性

中学化学实验教学中有些实验具有一定的危害性和危险性，在课堂上无法实地演示，借助于录像教学，既保证了学生的安全和保护环境，又达到良好的教学效果。同时，通过录像技术，还可以对实验中的错误操作引起的危害进行真实再现，以引起学生的重视，帮助学生掌握正确的实验操作步骤和操作技能。例如：浓硫酸的稀释实验，课堂上一般演示正确的操作，对不正确的操作进行讲解，通过录像对浓硫酸滴入水中放出大量热量使酸液飞溅现象进行演示，使学生加深对这一知识点的理解;加热胆矾晶体实验，把试管口没有向下倾斜，水流入试管底部，白色的无水硫酸铜又变成蓝色，使实验失败，然后把这一过程拍成录像。这样教学不仅使学生掌握了硫酸铜晶体与无水硫酸铜之间的相互转换，更让学生体会到正确的实验装置对实验成功的作用。

(三)、加强学生实验操作的规范性

学生实验是学生学会实验基本技能的最有效途径。对一些操作较复杂的实验，通过录像对学生进行正确、规范的指导，避免了因教师演示需较长时间的缺陷。例如，对高三学生实验基本操作的复习中“取、量、热、装、洗”的教学，可采用录像技术进行演示，同时对操作注意点进行局部放大、停顿、旁白介绍，使学生不仅能理解“为什么这样操作”，更能体验正确的操作，对学生最终学会这些操作提供保证。

高速或缓慢的摄像技术和放像的快、慢、倒等功能，不仅可以使学生缓慢地看到快速的变化，还能使学生快速地观察到缓慢的变化，让学生迅速感知不易观察到的实验细节，提高学生观察的敏捷性，同时缩短了教学时间，增加了演示实验的时效性，提高了教学效益。摄像、放像技术还可以显示较复杂的化工生产过程，使抽象的教学内容直观化，便于学生对这类知识的理解和掌握。对一些价格昂贵的实验、危险性大的实验、要求较高的操作技术或装置复杂的实验也可以借助教学录像来完成，保证演示实验的安全性，加强了学生实验操作的规范性。

二、计算机多媒体课件在化学实验教学中的应用 多媒体课件在化学实验教学中的运用的研究，我们通过反复探索、实践、对比，确定出以下几种情况：

确定选择多媒体课件的几种类型：一是演示实验。二是实验操作中分解组合模拟。三是实验中化学原理分析。四是对习题中的综合实验设计、创造。五是实验批判与评价等。

确定选择实验课件来源是：高中化学课本中的187个演示实验;50个学生实验;各层次不同能力要求的自创实验、设计实验、实验评价与改进、综合实验等。

确定选择多媒体课件课件使用方式：一是与实物实验并用，很好地为实体实验加深印象。二是对实物实验的补充，主要适用于微观变化的动态难以在宏观中展示;有的实验现象微弱;综合组装实验等。三是独立使用多媒体模拟演示实验。它适用于分析实验原理;内容多、战线长、涉及面广的实验;微观变化宏观反应;逻辑抽象想象太强;理论与实际实验中有很大跨度等等类别实验。在模拟实验中，要求要以新的视觉，作用于学生感官，显新奇、神异，但不失科学性。扣住教学原则，认知理论心理学，能有效调动学生积极思维，拓展视野，兴奋神经，引起学生极强的专注，极大的兴趣，看后久久回味。

确定选择多媒体课件课件的来源：一是重点放在充分利用现有条件下的网络信息资源素材库和教学软件中。根据不同教学情境的需要，有的直接使用，有的根据该实验的特点，加以增、删、改后使用;二是自己设计制作课件。通过集体共谋，论证出可行性，在实验中那些问题该发展?那个地方该改进?选择什么样的内容?做出什么风格的课件，都在教研会上，大家积极献策献力，以求模拟实验具有客观性、在现真实性、包容性，引起深层思考，由此架起抽象顿悟的桥梁。

实物实验展示的是立体化。实验现象偶而会出现始料未及的复杂多变，以事实胜于雄辩的亲身感，会激起学生思维的一种亲近感。但它要受空间距离不同，导致对实验观察有影响，由反应快慢又多受时间制约。多媒体技术，形成的模拟实验课件，虽有声、形、图、动画毕竟在银屏上是流动的一副平面画。对实体有所矫正，导致颜色偏差，体现了设计者主观性，表现不出实体实验的多重困难，多向复杂。但它有利于控制时间，指向性强，便于大家观看和操作。因此在用多媒体设计模拟实验中，我们有清醒的认识，任何课件实验代替不了实体实验，它不是实验教学的万能，只是一个补充释译，通过对实验模拟、虚拟促进对实验的发明创造。

确定选择多媒体课件的原则是：必有实效性，遵循教学规律及教改的发展方向，要体现学生认知规律，唤起学生的内在学习动力(需要、兴趣、信心)，提升主动探求的欲望和动力，在学习中获得体验。注重潜在能力的挖掘，关注全方位学生发展，注重知识结构，使学生自主学习空间增大;能提供师与生、生与生积极有效互动、实现沟通、共享、形成智慧的流动场相互促进。能有效组织控制创造本学科结构知识学习的课堂动态的生成。关注学生探究发现创造性占有的过程，使其在掌握分析化学实验的成败、知识结构、运用能力中，增强参与性、反思性、开方性，执着与责任感，在置疑中体现严谨、成熟富有批判性、创造性科学素养。

确定选择多媒体课件要领是：一是转换反应的速度。根据有的实验反应瞬间即成，如Cl2与H2混和光照反应刹那间就完成，观察者很难捕捉到过程现象，像这种实验可通过课件模拟实验，减缓反应速度，帮助理解反应原理的分析。有的反应需要一定的时间，如乙烯的制取，多糖的水解等等，这些需要课件中化慢为快，给学生以更多的自主空间去探讨。

二是化危为安。有的实验毒性很大，产生气体污染也严重;气体制取实验、性质实验战线拉得过长，很容易出现不安全隐患。如氯气制取，除杂、干燥、性质，尾气处理等综合实验;如石蜡裂化，所需时间长，裂化的产物检验现象不明显，如果用违反操作引起高锰酸钾溶液倒吸在反应容器里褪色现象很明显，但又怕实验事故发，像这类实验都可以用课件模拟实验来阐明。

三是化微观为宏观，微量夸大化。在有的实验中微观粒子流动不可视的，为了促使形象思维上升到抽象思维，需要建构一个使学生认知过度的思维平台，如原电池中微观的电子流流向，阴、阳离子流向，电子互换;弱电解质的电离平衡过程展示都需要通过多媒体模拟实验课件用上述观点来完成。还有反应速度慢，浓度极低，生成量太少，而影响定性实验分析，也需通过课件实验将微量聚合造形夸大。如碳酸氢钠加入氯水;分析反应速度变化如盐酸与锌反应中加入大量醋酸钠观看反应中汽泡产生，实体很难观察到，通过课件实验会历历在目。

四是化无形为有形。此法适用于气体制取、除杂、性质尾气处理综合实验气体流向及变化分析;演示倒吸可能产生的危害;分析实验中的化学原理。如苯酚与农溴水反应在分析旧健裂新健产生无形变化化为有形促使学生理解能力增强。

五是化难为易。此法适用于讨论实验装置的系列衍变;不同气体用不同装置制取的辨析;综合装置的设计与变迁;讨论某气体收集由排气法转移到排水法，拓展转移到防倒吸原理分析，运用于喷泉实验中。像这样富含知识、能力、创造性的实验用课件就能达到化难为易;也适用于各阶段的实验复习中;还适用于难以实现的实验(如甲烷的取代反应);还能适用于仪器的剖面分析(如制蒸馏水、乙烯温度计的水银球位置确定的区别)。

六是化微声为有声。有些化学实验是伴有声音，为增强效果需放大音量。如镁条燃烧，钠与水反应，检验乙醇与钠反应中产生的氢气实验。在这些实验中声音都很微弱，不易察觉。也有的实验在模拟错误操作中，为增强危险感也必须要配制声音，以极佳的渲染效果，充分调动学生的各种感官引起兴奋而产生兴趣。

当然这六个要领不是独立的使用，根据实情，彼此相辅相成，融会贯通。达到利用多媒体技术对化学实验开发、加工、再创造、再设计，以求实验课件的最优整合。

三、网络技术在化学实验教学中的应用

在当今知识迅猛增长和信息膨胀的环境中，教师不再是学生知识和信息的惟一来源。为了加强网络化学实验教学，我们开设了ftp://172.16.2.200/校园网，在化学实验教学资源中我们开设化学动态习题、化学实验视频、化学flash课件、三维及晶体图、化学网址、化学比武课件、化学图片、化学实验创新大赛、高中化学课件全集、网络虚拟实验等项目。通过网络技术教师和学生可从中获得大量的有关化学实验的信息;通过网络的问题组还可与世界各国的学生和教师在网络上对某一实验问题进行讨论。这不仅可以扩大学生的知识面，丰富学生的课余知识，更培养了学生主动获得知识的能力。例如在网络虚拟实验,我们在石油的分馏演示实验过程中采用了多媒体网络课件来进行仪器的识别、仪器安装顺序的教学;利用多媒体形式建立实验基本操作素材库,让学生学习实验操作的形式;采用动画模拟来强化学生对错误实验操作的危害和后果的认识。又如我们采用一些设计较好的虚拟实验室软件系统,例如用Chem-lab中的虚拟气体实验室等来进行关于气体摩尔体积演示实验的教学，使学生对气体摩尔体积理解留下深刻印象。

网络技术将为学生的自主学习提供最丰富的信息资源，使学生的知识来源更广泛、更丰富;使学生可以不受时间、空间的限制对有关实验问题进行探讨;同时培养了学生获取信息，分析、归纳、整理信息、应用信息解决问题的能力。

化学实验是中学化学教学最常用和最重要的教学手段，对帮助学生理解和掌握化学知识，培养学生的动手操作能力有着举足轻重的作用。随着科学技术的发展，把现代信息技术与实验相结合，必将丰富实验的内涵，增强实验的功能，提高学生学习化学实验的兴趣，将最大限度地发挥化学实验在化学教学中的作用。