青霉素在海带配子体培养中的作用初探

海带属 (Laminaria) 褐藻具有异型世代交替生活史, 包括二倍性孢子体世代和单倍性配子体世代。20世纪70年代末, 我国遗传学家方宗熙等发现在人工培养条件下, 雌、雄配子体都能形成无性繁殖系 (克隆) , 并能产生配子[1]。在海带育种、育苗、生理及遗传学研究中发挥越来越重要的作用[2,3]。目前, 海带种质保存技术主要以保存配子体为主, 方法主要是通过人工擦洗抱子囊去除附着的污物和其他生物, 然后在煮沸过的海水中放散得到配子体。而这种方法得到的海带配子体在保存过程中, 仍会存有许多细菌并大量繁殖, 附着在配子体克隆体表, 阻碍了配子体的正常生长, 对海带配子体的生长产生抑制, 除此之外, 日常管理中的一些操作, 也会带进污染物, 导致配子体克隆停止生长、色素变淡, 但具体机理不明, 推测是生长竞争性的抑制。

为此, 尝试利用青霉素来抑制细菌。青霉素是人类历史上发现的第一种抗生素, 且应用非常广泛。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称, 它们具有相似的作用机理。细菌一般都处于低渗 (即外界的渗透压低于细菌体内部) 的环境中, 因而会自发地吸收外界的水分。为了防止细胞因吸水过多而膨胀炸裂, 细菌在其细胞壁中合成一种名为肽聚糖的物质, 以此抵抗细菌体的自发吸水膨胀。青霉素即作用于肽聚糖的合成过程中, 阻止它的合成, 进而导致细菌体失去抵抗渗透压的能力而胀破[4]。

1 材料

选取的实验材料为901杂交海带的雌性配子体克隆, 它是一个比较有代表性的材料, 抗逆性比较强[5]。具体选择青霉素G钠作为该实验用抗生素。

2 方法

2.1 实验相关的消毒的方法

种质保存的条件之一就是相对的无污染, 且要排除物品上污染的干扰, 故实验所用材料和物品初始需要相应的消毒或灭菌。

2.1.1 实验材料的消毒

实验用的901杂交海带的雌性配子体是使用无菌培养技术得来[6]。

2.1.2 实验物品的消毒

实验所用的物品经过120℃, 20 min蒸汽高压灭菌后, 再经过烘箱120℃, 2 h高温处理。

2.1.3 培养液的消毒

所用海水经过沉淀, 沙滤后, 经过活性炭吸附, 再由5μm和1μm规格pp棉过滤, 得到最终的海水。添加N (10 g/L) 、P (1 g/L) , 青霉素G钠 (12 mg/m L) 配制成培养液, N、P的母液均是经过120℃, 20 min蒸汽高压灭菌处理。

2.1.4 培养液的抽滤

加有青霉素G钠的培养液需要通过膜滤器抽滤的方法处理。采用的滤膜为孔径是0.22μm醋酸纤维酯微孔滤膜, 孔径有效地达到了除菌的目的, 其不带电荷的特性又可最大程度地保留培养液中的有效成分。

2.2 实验方法

为了拥有一个良好的初始状态, 先用超声波粉碎仪将一定量的901杂交海带的雄性配子体克隆簇打碎成较短的细胞段[7], 多次更换培养液后, 再经过7 d的自然光生长恢复。

设置3组实验, 第1组始终使用加有青霉素G钠的培养液, 第二组中期停加青霉素, 改用普通培养液, 而最后一组始终使用普通的未加青霉素G钠的培养液, 实验在在10℃, 光照强度1500Lx培养。

在传统海带配子体克隆种质资源保存过程中, 会定期更换培养液。更换培养液的周期一般为30 d。整个实验期间的操作, 包括更换培养液和观察都在超净工作台内完成, 瓶口等都在酒精灯下过火, 确保实验不被干扰。为了能及时有效地掌握信息, 7 d观察一次。

3 结果和讨论

3.1 结果

经过120 d的培养后, 我们发现, 始终使用加有青霉素G钠组是最好的一组, 整个过程中都不见其它污染物, 但显微镜下观察, 偶见有孢子体的出现。始终未加入青霉素G钠组, 在后期出现了少量的杆菌和球菌。对此, 改用加有青霉素的培养液培养一段时间后, 杆菌和球菌明显减少, 但是出现了一种有丝真菌。可见, 利用青霉素来培养海带配子体是可行的, 而且对已有的污染物能够很好的控制。

3.2 讨论

第一, 青霉素G钠水溶液极不稳定, 青霉素G钠盐易水解, 在不同温度下有效期有很大差异, 它随着温度的升高, 水解加速。所以配制好的青霉素G钠培养液要及时地使用[8];第二, 为了能有效地控制细菌, 每隔一段时间都要使用带有青霉素G钠的培养液更换;第三, 虽然海带配子体和细菌的细胞壁组成不同, 所以青霉素不会影响海带配子体细胞壁合成, 但是长时间接触青霉素, 对海带配子体细胞的其它细胞器有无影响, 尤其是核心的遗传物质, 特别是第一组出现了孢子体, 还有待讨论;第四, 培养后期出现了其它的污染物, 青霉素无法控制, 以后可以试验加入其它药物联合处理。

摘要：海带配子体克隆技术的建立具有极其重要的应用价值。配子体克隆及其杂交为通过杂交方法培育优良品种和杂交海带提供了可能。为此, 配子体克隆演变为海带种质资源保存和利用的主要手段。

关键词：青霉素,海带,配子体培养

参考文献

[1] 方宗熙, 欧毓麟, 崔竞进, 等.海带配子体无性繁殖系培育成功[J].科学通报, 1978 (2) :115-116.

[2] 张全胜, 罗世菊.海带种质保存技术的研究现状和发展前景[J].水产科技情报, 2006, 3 (2) :61-63.

[3] 杨官品, 李晓捷, 丛义周, 等.海带配子体无性繁殖 (克隆) 技术研究与应用进展[J].中国海洋大学学报, 2007, 37 (4) :569-572.

[4] 王磊, 任东明.青霉素——从发现到应用[J].生物学通报, 2006 (12) :61-62.

[5] 李晓捷, 王国文, 张全胜, 等.温度对“901”海带配子体克隆生长的影响[J].水产科技情报, 2004, 31 (4) :166-168.

[6] 张壮志, 钱瑞, 罗世菊, 等.海带种质保存防污染技术[J].河北渔业, 2010 (5) :30-31.

[7] 刘涛, 朱明壮, 包振民, 等.超声波对海带配子体克隆的作用[J].海洋湖沼通报, 2000 (4) :39-44.

[8] 郭忠信.不同室温下的青霉素水溶液失效探讨[J].云南医药, 1995 (4) :298-299.·