循环肿瘤细胞检测

循环肿瘤细胞检测（精选9篇）

篇1：循环肿瘤细胞检测

滋养细胞肿瘤，别名：滋养层细胞疾病;滋养层细胞瘤;滋养叶肿瘤;滋养层肿瘤;致溃疡性胰岛细胞瘤;胃泌素瘤;瘤细胞可分泌胃泌素;滋养细胞肿瘤是指胚胎的滋养细胞发生恶变而形成的肿瘤。最早分为两种一种良性的称“葡萄胎”,另一种恶性的称“绒毛膜上皮癌”。以后发现介于这两种之间，还有一种形态上像葡萄胎，但具有一定的恶性，可以侵袭肌层或转移至远处。

篇2：循环肿瘤细胞检测

实验动物中缺乏叶酸可致胚胎死亡，推测母体缺乏叶酸可能和滋养细胞肿瘤的发生有关。特别在胚胎血管形成期(受孕后13～21天)，如营养物质中缺乏叶酸和组胺酸，会影响胸腺嘧啶的合成，从而导致胎盘绒毛的血管缺乏以及胚胎坏死。葡萄胎的绒毛基本病理改变也符合此点。

2.病毒学说

有观点认为葡萄胎与病毒感染有关。20世纪50年代有人曾在葡萄胎和绒癌组织中分离出一种滤过性病毒，称为“亲绒毛病毒”，并认为这种病毒是导致滋养细胞肿瘤的原因。但迄今30余年，未再有人证实这种病毒的存在。20世纪60年代有作者通过电子显微镜检查滋养细胞肿瘤标本，见到一些细胞浆内的包涵体，类似实验性白血病中见到的病毒颗粒，因此提出滋养细胞肿瘤由滤过性病毒诱致的看法，但也有异议。

3.内分泌失调学说

WHO综合报告，15～20岁组葡萄胎发生率较20～35岁组为高，40岁以上发病的危险性增加，50岁以上妊娠后发生葡萄胎的危险性将是20～35岁者的200倍，此时期都为卵巢功能尚不完全稳定或已逐渐衰退特点故联想到滋养细胞肿瘤是否与卵巢内分泌功能密切有关，卵巢功能紊乱是否与产生的卵子不健全有关。

4.孕卵缺损学说

葡萄胎的发生与孕卵异常有关。如上所述，小于20岁或大于40岁妇女中葡萄胎发生率较高，该年龄组妇女妊娠后自然流产率及新生儿畸形率也高，可能与孕卵本身缺陷有关。

5.种族因素

葡萄胎多见于亚洲各国，特别是东南亚一带更为多见，因此认为可能与种族有关。但种族问题与环境、气候、饮食习惯、水源、传染病、动物媒介等因素相关。

6.细胞遗传异常学说

篇3：循环肿瘤细胞检测

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究选择2012年1月‐2015年4月在本院接受治疗的食管鳞癌患者134例,其中,手术患者67例,非手术患者67例。134例患者中,男89例,女45例;年龄45~80岁,平均(63.69±10.74)岁,按照TNM标准分期,Ⅱ期肿瘤78例,Ⅲ期肿瘤56例。排除其他肿瘤患者,本次治疗前均未通过任何措施进行抗肿瘤治疗。所有受试者均知情同意,并自愿签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1采集血液标本手术患者在术前1 d,术后1 h、10 d,非手术患者在化疗前1 d及化疗后5 d空腹状态下采集5 ml肘静脉血,妥善保存血液标本后送检实验室,避免外周血被无关上皮细胞污染。

1.2.2检测步骤将所有受试者血液标本中单个核细胞分离出来,采用流式细胞仪进行检测,记录其中循环肿瘤细胞CD45-Ep-CAM表达情况;选择细胞角蛋白19(Cytokeratin 19,CK19)经免疫细胞化学手段鉴定血液中细胞是否为肿瘤细胞,分析手术前后及化疗前后患者血液中的循环肿瘤细胞CD45-Ep-CAM表达差异,及其表达情况与病理学之间的关系。其中,每例血液样本均检测相同细胞数量,即3×106个,检测患者外周血液中循环肿瘤细胞CD45-Ep-CAM表达则依靠血液标本中每106个单核细胞中所包含的循环肿瘤细胞CD45-Ep-CAM数量[4];判断阳性循环肿瘤细胞CD45-Ep-CAM则依靠CK19,细胞质内CK19能够阳性表达,经染色后发现细胞质出现棕黄色颗粒沉着,则表示该细胞为阳性细胞。

1.3 统计学方法

本次研究选择SPSS 18.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示,计量资料应用t检验;多组计量资料比较应用方差分析;计数资料应用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

本次研究134例患者中,18例患者检测到EpCAM细胞,检出率约为13.43%。

2.1 手术患者外周血中循环肿瘤Ep-CAM表达数量检测

手术患者术前(T1)、术后1 h(T2)、术后10 d(T3)检测外周血Ep-CAM平均数量分别为(12.012±7.012)pg/ml、(12.125±6.692)pg/ml及(8.435±4.572)pg/ml,不同时间点之间差异有统计学意义(F=22.574,P=0.000);对比T1与T2,差异无统计学意义(P>0.05);对比T1与T3,差异具有统计学意义(P<0.05);对比T2与T3,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 非手术患者外周血中循环肿瘤Ep-CAM数量检测

非手术患者化疗前、后外周血标本中循环肿瘤Ep-CAM数量分别为(18.309±3.347)pg/ml、(11.108±2.525)pg/ml,差异具有统计学意义(t=19.274,P=0.000)。

2.3 手术患者术前Ep-CAM数量的病理学意义

134例患者外周血中阳性循环肿瘤细胞Ep-CAM数量与肿瘤浸润程度、分化程度等指标无密切相关性(P>0.05),见表1、2和表3,与其是否存在淋巴结转移具有明显相关性(P<0.05),见表4;Ⅱ期及Ⅲ期肿瘤术前阳性循环肿瘤细胞Ep-CAM数量分别为(33.021±10.213)pg/ml、(36.879±11.436)pg/ml,差异具有统计学意义(Z=-3.660,P=0.000)。

3 讨论

食管癌在消化道肿瘤中比较常见,诱发因素较多,主要包括遗传易感性、生活环境、饮食习惯、生活习惯及种族等[5]。目前,临床尚未明确食管癌的发病原因及发病机制。我国是食管癌发病的重灾区,国内发病率及致死率均远远高于世界其他国家平均水平,而且国内食管癌分布区域性比较明显。部分食管癌患者在病情早期得到确诊后未检出转移明确证据,但经食管癌根治术治疗后却显现出肿瘤转移及复发临床表现。食管癌患者经手术、放疗及化疗等治疗后,常规临床检查方法多半检查不出其余肿瘤病灶,但肿瘤复发或转移却成为患者最终死因,这些与肿瘤微转移具有隐性特点、循环肿瘤细胞关系比较密切。

据医学文献表明,肿瘤细胞可通过侵袭瘤体临近血管,经上皮-间质的分化作用进入人体血液循环系统,其中手术肿瘤细胞并未被免疫系统发现,因此能够停留在循环系统[6]。需要注意的是,肿瘤循环细胞中仅0.1%能够发展成肿瘤转移灶,在外周血中含量极少,因此,为提高循环肿瘤检出率,应尽可能采用特异性检测技术鉴定循环肿瘤细胞,如细胞计数法、肿瘤相关基因突变分析、核酸检测法等。本次研究中应用流式细胞技术、免疫细胞化学技术均为细胞计数法典型代表。

食管癌的肿瘤标志物检测在临床中是比较重要、且急需解决的问题。Ep-CAM在上皮组织中表达率很高,尤其是恶性上皮肿瘤组织中,其表达活跃程度远远高于常规上皮组织,而在非上皮组织中表达率极低[7]。本次研究中在多数受试者外周血标本中检出Ep-CAM阳性循环肿瘤细胞,支持上述观点。国外学者发现,在食管癌微转移的检测中,Ep-CAM具有较好特异性及较高灵敏度[8],本次研究支持此观点。需要注意的是,循环肿瘤细胞Ep-CAM数量与临床疗效关系密切,若循环肿瘤细胞Ep-CAM表达数量增加,则表明该治疗措施有效,有利于患者选择更为合适的治疗方案。

总之,CTC检测能有效检出外周血中CTC数量,CTC数量越多,表明肿瘤病理分期越晚,治疗计划需及时作出有效调整。

参考文献

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篇4：循环肿瘤细胞检测

膀胱镜/输尿管镜可以观察尿道、膀胱和输尿管，明确膀胱及输尿管是否有肿瘤以及肿瘤的数目、大小、形态和部位等信息，被认为是尿路病变检测的金标准1。但是膀胱镜/输尿管镜也并非完美，它的缺点也很明显，一些原位癌有可能和周围组织无明显区别，常常被漏诊；有5%的接受镜检的患者可能继发感染；另外，它是一种创伤性检测，对于病人尤其是男性病人，会产生疼痛出血，依从性不高，有些病人甚至无法接受检查。因而细胞学、FISH和NPM22等非侵入性检测手段越来越受到患者和医师的关注2。既往文献表明，尿路上皮肿瘤的常见症状-无痛性全程鏡下血尿或肉眼血尿-会导致NPM22等非侵入性的尿液检测结果产生假阳性3，但是血尿是否对细胞学和FISH检测结果产生影响，不同程度的血尿产生的影响如何，这些问题国内尚未见文献报道。本研究回顾我院2009年9月-2012年3月306例血尿患者的资料，阐明不同程度的血尿对细胞学和FISH检测结果的影响，为在怀疑尿路上皮肿瘤患者中合理应用细胞学、FISH和膀胱镜/输尿管镜检奠定基础。

1 材料与方法

本研究回顾性分析2004年到2009年在我院就诊的怀疑为尿路上皮肿瘤的患者资料。2365例患者中1776例为男性，589例为女性，年龄在18-97岁，中位年龄为65岁。他们因为无痛性镜下血尿就诊。有无尿路肿瘤史的患者均包含在内。通过中段尿或导尿获得尿标本行尿成渣实验。使用Neubauer红细胞计数仪记录红细胞数。在尿沉渣实验与显微镜观察有分歧的地方，用尿显微镜进一步观察。血尿细分为0（0 个红细胞），I（1≤红细胞数＜100），II（100≤红细胞数＜250），III（250≤红细胞数），所有患者接受膀胱镜检和上尿路影像学检查（包括超声、泌尿系CT或者泌尿系MRI）。有可疑发现的行经尿道活检和/或可疑病灶的切除。尿检程序对细胞学而言，细胞离心、涂片后染色，由同一个细胞病理学家镜下评估。按说明书行FISH检查。对阳性结果，

2 结果

在2365个患者中，1822（77.0%）无尿路上皮肿瘤而543（23.0%）患尿路上皮肿瘤。在543例尿路上皮肿瘤患者中，476例（87.6%）为膀胱癌，68例（12.5%）为上尿路肿瘤。在543例癌症中，405例（74.6%）为非侵入性（pTa或pT1）；109例是肌层浸润性肿瘤。原位癌29例（5.3%）。2076例患者有血尿。其中，551例（26.5%）为I度，177例（8.53%）II度，411例（19.8%）III度更多的特征概括在表1中。尿路上皮癌在0、I、II、III度血尿的发生率为16.9%、19.7%、23.4%和30.34%。在非肌层侵润性尿路肿瘤中，血尿分别占33.2%、29.2%、12.7%和24.9%，而在肌层侵润性肿瘤中，分别占7.8%、28.5%、6.5%和57.2%。在低分级肿瘤中，血尿分别占32.5%、31.4%、10.1%和26%。在高分级肿瘤中，分别占14.5%、27.2%、12.7%和45.6%。所有尿标本中，90.5%来自于膀胱尿，9.5%来自于上尿路。34.9%以非侵入性方式取得，65.1%通过设备取尿（如尿管或尿道膀胱镜）。整个细胞学和FISH的敏感性为78.7%、69.8%。除外设备取尿和尿路感染（白细胞≥100/ul同时红细胞数量﹥1或者白细胞至少100/ul同时出现亚硝酸盐），NMP的敏感性为36.1%。整个细胞学和FISH的特异性为82.8%、80.1%。除外设备取尿和尿路感染，NMP的特异性为75.2%。

3 讨论

膀胱镜/输尿管镜检虽然是尿路上皮肿瘤诊断的金标准，但是由于该检查的侵入性，常常给患者带来一定程度的痛苦。临床医生和患者迫切地希望能用非侵入性的检测手段来诊断尿路上皮肿瘤，细胞学和FISH等非侵入性检测手段受到越来越多的关注2。然而，细胞学和FISH等非侵入性检测手段的敏感性和特异性也常常受到许多因素的影响。有文献表明，尿路感染、结石病、良性前列腺增生症和肾功能受损会影响尿液细胞学和FISH的检测特异性。镜下血尿或肉眼血尿常常是尿路肿瘤的第一症状，约85%的尿路肿瘤患者会出现镜下血尿或肉眼血尿。血尿会不会对细胞学和FISH等非侵入性检测手段的敏感性和特异性造成影响，目前尚未见文献报道。本研究评估了不同程度血尿对细胞学和FISH检测的影响。

从临床预期出发，我们的结果暗示，在排除原发性肾脏病或其他良性疾病如尿路感染、月经和结石等疾病后的镜下血尿患者，血尿的分级会影响进一步的诊断措施。在III度血尿（>250RBC/ul），尿检的特异性需要上尿路影像学和侵入性的诊断措施如尿道膀胱镜来证明。对I度和II度镜下血尿患者，由于尿检的低特异性，在侵入性诊断措施实施前，需要做另外的非侵入性尿液标记物的检测。然而，无论何时做细胞学，低分级血尿患者的低敏感性需要被慎重考虑。本研究的一个局限性是仪器取尿标本的比例偏高，这会影响结果。此外，做不同检测的标本也不同。因而，有无尿路肿瘤的患者均包含在内，这会影响数据的连续性。

4 结论

镜下血尿的程度显著性影响尿路肿瘤患者尿液标记物的检测。高分级的镜下血尿与尿液标记物检测敏感性增高和特异性降低有关。这强调了血尿分级与尿路肿瘤患者尿液标记物检测结果合理解释的关联性。

参考文献

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篇5：循环肿瘤细胞检测

1.1一般资料:本次研究选择了2013年1月至2014年1月在吉林省某医院接受治疗的130例乳腺癌患者为研究对象,所有患者的检测指标均满足国家相关机构制定的规范和标准。按照抽签的方式将其随机划分为两组,分别是对照组和实验组。对照组中患者年龄在24~72岁,平均48.5岁;实验组中患者年龄在22~71岁,平均48.8岁。两组患者在性别、年龄等方面无显著性差异,不具有统计学意义,但具有可比性。 1.2纳入和排除标准。纳入标准:1所有患者均进行相关检查和穿刺活检后确诊为乳腺癌;2年龄在18~75岁;3所有患者均进行了胸部彩超及腹部CR检查确认无肺、肝转移,对于一些情况特殊的患者也要进行胸部或腹部CT检查或者进行全身骨扫描以保证无骨转移;4肿瘤为单侧、单发乳房病变;5患者不存在化疗禁忌证;6患者就诊前均未接受过任何药物和辅助治疗;7均无其他恶性肿瘤病史。排除标准:1哺乳期乳腺癌;2炎性乳腺癌;3有较严重的心肺疾病;4已发生远处转移;5入院前已经进行过肿块切除活检处理;6患者治疗依从性比较差,无法按照相关方案进行新辅助化疗。

1.3治疗方法:对于乳腺癌循环肿瘤细胞患者的治疗,最好做到早发现、早诊断,早治疗,这样不仅可以避免病情的进一步扩展,而且还能有效提高患者的临床治疗效果。这就要求医护人员根据患者的临床表现及病史、影像学检查、体格检查、细胞病理学检查和组织病理学,对乳腺癌循环肿瘤细胞进行全面的检测,对于异常情况要给予密切关注,以保证病情得到有效控制[1]。在上述基础上,对照组患者给予多西他赛+环磷酰胺化疗,多西他赛75 mg/m2,静脉滴注时间控制在1 h,每21 d为1个疗程;600 mg/m2环磷酰胺,静脉滴注时间控制在1 h,每21 d为1个疗程。而实验组患者给予了多西他赛+表柔比星+环磷酰胺化疗,75 mg/m2多西他赛,静脉滴注时间控制在1 h,每21 d为1个疗程;75 mg/m2表柔比星,静脉滴注控制在1 h,每21 d为1个疗程; 500 mg/m2环磷酰胺,静脉滴注时间控制在1 h,每21 d为1个疗程。两组患者在化疗的过程中要对其临床反应进行密切的关注,如果出现不良反应,要及时采取有效解决措施。

1.4观察指标:两组患者分别抽取静脉血5 m L,对其化疗前,化疗后1、2、3、4个周期中外周血CK8/18CTC阳性值进行检测和记录。

1.5统计学处理:对两组患者研究过程中涉及的所有数据均采用了SPSS16.0统计学软件进行统计与分析,计数资料采用均数±标准差表

示,组间比较采用t检验,如果P<0.05,则说明差异具有统计学意义, 反之则不具有统计学意义。

2结果

化疗前,两组患者的治疗效果无明显差异,不具有统计学意义(P>0.05),但是化疗后1、2、3、4个周期,两组患者的治疗效果具有明显差异,而且实验组患者的化疗效果要明显好于对照组,并且他们之间的差别具备统计学意义(P<0.05),见表1。

3讨论

乳腺癌属于一种全身性疾病,其癌细胞一般会在肿瘤形成早期发生脱落,并直接进入或通过淋巴系统进入血循环系统,从而使肿瘤细胞扩散到全身。虽然有70%~80%的乳腺癌患者通过手术治疗和辅助化疗能够达到一定的治疗效果,但是仍有超过20%的患者会在几年内复发,导致病情进一步恶化。大量研究表明[2,3,4],30%~40% 的乳腺癌初治患者骨髓、静脉血及常规病理检查会发现癌细胞转移现象,从而说明循环肿瘤细胞是导致乳腺癌患者复发的主要原因。 因此,在对乳腺癌进行治疗过程中,要采取有效方法对循环肿瘤细胞进行早期检测和诊断,了解患者肿瘤细胞转移区域及影响范围, 因此该检测结果不仅可以为后期的治疗、化疗及康复提供很好的借鉴,而且还能提高患者的临床治疗效果,降低治疗后的复发率,提高患者生活质量。

参考文献

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篇6：蝎蛋白点亮肿瘤细胞

为此，奥尔森与一位神经外科住院医师合作，开始一起寻找可以在手术室里照亮癌细胞的方式。他们最终发现了一篇关于蝎毒素附着脑肿瘤并且不附着健康细胞的研究报告。研究人员认为，在将这种蝎毒素蛋白的人工合成蛋白与一种在近红外线下发光的分子进行键合以后，他们可能发现了其所命名的“肿瘤涂漆。”

初步测试显示，二人将上述蝎毒素化合物注入体内含有移植人体肿瘤的小鼠尾部静脉。“在第15至20分钟内，肿瘤开始发光发亮并与小鼠其他部位区分开来，”奥尔森说。

一家名为光辉生物科技（Blaze Bioscience）的西雅图公司从弗雷德·哈钦森癌症研究中心（Fred Hutchinson CancerCenter）为该技术申请了许可证书。奥尔森表示，这项研究的人体试验将于2013年年末进行。

蝎毒素的特殊性不仅在于其附着肿瘤细胞，还因为它能穿透血脑屏障一大脑血管内壁一种可阻止大多数化合物侵入的细胞和分子壁垒。

“肽通常不进入大脑，除非它们附着于某些特殊物质被携带至内，”伯明翰阿拉巴马大学一位神经生物学家哈拉尔德·松特海默尔（Harald Sontheimer）如是说，哈拉尔德是发现蝎蛋白对神经系统潜在功效的第一人。

蝎毒素源自毒液，但却似乎呈现出安全特性。一家由松特海默尔创立的生物技术公司通过早期临床试验证明，患者体内的放射性碘附着蝎毒素是安全的。但该公司还未来得及进行该碘附着化合物的后期测试就已关门大吉，该化合物现归日本卫材（Eisal）药业公司所有。

篇7：循环肿瘤细胞检测

高分辨率熔解曲线 (High Resolution Melt, HRM) [3,4]是近年来国际上发展的一种新型核酸研究技术, 主要基于核酸分子的片段长度、GC百分含量和分布等物理性质的差异, 通过实时监测升温过程中DNA双链荧光染料与PCR扩增产物的结合变化情况实现检测。本研究通过HRM法探讨不同肿瘤细胞系中PTEN的突变情况, 现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 细胞

各种人源肿瘤细胞系 (均购自ATCC) :HepG2, huh07, MDA-MB-231, 293, BEL-7402, Jurkat。

1.2 主要试剂

RPMI-1640培养基、DMEM液体培养基、胎牛血清, 均购自Gibco;基因组提取Kit、高保真DNA Polymerase, 均购自北京全式金生物技术有限公司;HRM筛选用Mix, 购自Roche;DNA marker DL2000、普通Taq酶、T4DNA连接酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司 (TAKARA) 。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司根据设计合成。

1.3 主要仪器

SW-CJ-1F超净工作台 (苏净集团安泰公司) ;荧光定量PCR仪 (Lightcycler 480, Roche) ;HERAcell 150CO2培养箱 (德国Heraeus) ;北京六一DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽;赛默飞NanoDrop 2 000分光光度计。

2 方法

2.1 细胞复苏与培养

按ATCC细胞培养条件复苏培养相应细胞, 收集细胞。

2.2 基因组DNA的提取与测定

基因组DNA提取参照EasyPure Genomic DNA Kit说明, 具体步骤为:离心收集细胞, 加入100μL LB2、20μL RNaseA和20μL Proteinase K充分混匀裂解细胞释放基因组, 然后加入500μL BB2, 过吸附柱, 再用CB2和WB2洗涤基因组, 最后用100μL预热EB (65℃) 洗脱于干净EP中。基因组产物采用1.0%琼脂糖进行电泳, 同时用NanoDrop2000测定基因组浓度和纯度, -20℃保存。

2.3 HRM筛选分析

参照Cosmic中PTEN基因突变的高频区设计特异引物如下:Forward primer:GTTAAAGGCATTTCCTGT-GAAATAATAC;Reverse primer:CTTTTTTAGCATCT-TGTTCTGTTTG。

HRM分析参照LightCycler 480 HRM Master Mix (Roche) 说明, 具体参数如下:PCR总体系为20μL:模版2μL (10ng/μL) , Primer F 1μL (5μM) , Primer R 1μL (5μM) , MgCl2 3μL (25mM) , PCR Grade Water 3μL, 2X Master Mix 10μL。PCR条件:95℃预变性10min, 95℃变性10s, 50℃退火15s, 72℃延伸10s, 45个循环;High Resolution Melting;Cooling。比较分析各细胞系HRM溶解曲线, 确定突变细胞系。

2.4 测序验证HRM筛选结果

各细胞系基因组参照高保真DNA Polymerase说明, 扩增出特异性片段, 并用扩增的相应前后向引物用Sanger测序法测序确定筛选结果。

2.5 TA克隆鉴定细胞系突变类型

细胞系基因组用高保真酶扩增出相应的片段, 加A尾, 再与T载体连接, 转化, 挑单克隆测序分析。

3 结果

3.1 HRM筛选分析曲线

6个不同肿瘤细胞系HRM筛选结果显示, Jurkat细胞系分析曲线与其他细胞系分析曲线差异显著, 可初步判断Jurkat细胞系PTEN基因存在突变。结果见图1 (注:如需彩色图片请与作者或编辑部联系) 。

3.2 HRM测序验证

各细胞系基因组高保真酶扩增PTEN序列, Jurkat细胞系测序结果出现双峰, 其他均正常, 与HRM分析曲线结果一致。测序结果见图2。

3.3 TA克隆测序鉴定

Jurkat细胞系扩增片段加A尾, 连接T载体, 转化大肠杆菌, 菌落PCR显示Jurkat细胞系PTEN基因存在大小接近的2种片段, 挑取单菌落测序, 测序比对结果进一步明确了Jurkat细胞系PTEN基因与正常序列 (Normal) 的差异。结果见图3。

4 讨论

PTEN是最重要的肿瘤抑制基因之一, 与多种肿瘤疾病的发生和发展密切相关, 在血液系统肿瘤、胶质瘤、消化道肿瘤、妇科肿瘤、泌尿道肿瘤、肺癌、骨肉瘤等[5,6,7,8]多种恶性肿瘤中均发现突变或杂和性缺失 (LOH) , 研究判断肿瘤患者PTEN基因的变化对疾病的控制、治疗和预后均有着不可估量的作用。

HRM是一种利用饱和荧光染料、未标记探针和实时荧光定量PCR的检测基因突变与基因分型的新型分子诊断技术。HRM分析要求使用饱和荧光染料, 对PCR反应的抑制作用较低, 可饱和性地结合到DNA分子双螺旋的小沟里, PCR产物熔解过程中不会发生染料分子的重排, 准确性、敏感性均极高[9]。此外, HRM分析还要求引物设计特异性要高, PCR产物要单一, 不能形成引物二聚体, 扩增长度不能太长, DNA样本纯度要高[10]。

本实验研究结果表明, 利用HRM法筛选不同肿瘤细胞系PTEN基因突变准确性高, 证实了PTEN基因在肿瘤细胞系中的突变情况, 可为肿瘤基因诊断和基因治疗提供一定的方法和依据。

参考文献

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篇8：循环肿瘤细胞检测

【关键词】 巨噬细胞；异质性；肿瘤；研究深化

1 关于恶性肿瘤的分析

我们平常所说的恶性肿瘤，是通过对转移能力的应用，来进行人体相关细胞组织的破坏的，具备很大的危害性。其运作环节是比较复杂的，我们在研究中发现，其巨噬细胞在乳腺癌、肺癌及其其他癌症中实现了对组织蛋白酶的产生，其促进了肿瘤的生长及其浸润环节的运行，在肿瘤的发展过程中，它实现了对白细胞介素的有效释放，促进其创伤修复环节及其组织重构环节的发展，确保其生长因子的有效分泌，比如一系列的细胞因子、补体因子等。

2 关于肿瘤相关巨噬细胞的分析

2.1 我们所说的肿瘤的巨噬细胞是人体的活性蛋白系统的重要组成部分，它促进了人体的肿瘤的有效免疫，实现了对相关肿瘤细胞的有效控制，促进其有效杀灭，有利于人体的骨髓造血干细胞的发展，有利于促进一系列的骨髓抑制现象及其血小板减少等环节的避免。其肿瘤的巨噬细胞产生于其外周循环血中，其产生于一系列单核细胞。受到一系列的细胞因子的影响，其相关肿瘤结构的单核细胞发生改变，促进了巨噬细胞的形成。

其巨噬细胞具备不同的功能，我们一般分为两个类型，分别是M1及其M2。在其肿瘤环节的运作过程中，其诱导巨噬细胞实现了相关环节。我们日常所说的炎症疾病，就是一种重要的效应细胞，其通过对ARDS的发病环节的参与，进行AMS的有效刺激激活，促进了IL-1、IL-87等的有效释放，促进了其ALI环节的稳定运行。在此过程中，其巨噬细胞环节实现了不断的发展，在某些场景下其M1和M2之间是进行相关转化的。

2.2 肿瘤的巨噬细胞过程的运作，离不开其对旁分析系统及其自分泌系统的应用，确保其肿瘤的运作环节的有效控制，这个环节有利于促进肿瘤不断生长及其转移。由于其纤维细胞中的PTEN基因的缺失，导致其肿瘤内部相关环节的改变，不能实现其内部环节的有效协调，从而促进了其内部结构及其组成结构的改变，比如我们纤维蛋白胶原的不断增多，其炎症细胞的广泛增加，促进其巨噬细胞的有效转移，最终进行肿瘤组织的迁移，促进其肿瘤血管的数量的不断增多，从而优化了其肿瘤系统的完善发展。所有这些都有利于肿瘤的增长。我们发现肺癌周边的新生淋巴管是促进肿瘤向淋巴结转移的必经之路，而且发现在此过程中，巨噬细胞已经“投降”、“变质”，是推波助澜的“帮凶”。此后，他们对肺癌间质中的巨噬细胞进行鉴定，发现这群细胞拥有全新的表型。在通过复制动物模 型和跟踪临床病例之后，证实检测这些已经“变质”的巨噬细胞和肺癌周边新生淋巴管的数量。

2.3 为了确保实际的肿瘤环节的有效研究，我们要进行肿瘤分子环节深入剖析，促进其巨噬细胞与其相关肿瘤分子之间的关系的应用，确保其肿瘤细胞生长的基质成分的有效分析，促进其巨噬细胞因子环节的有效发展。通过对路易士肺癌模式的应用，我们可以得到其多功能多功能蛋白聚糖的应用，实现了对TLR2/TLR6环节的应用，进行巨噬细胞的应用，促进其炎症因子的不断转移。而相关肿瘤相关的巨噬细胞不仅通过产生细胞因子，而且通过分泌生长因子和基质讲解酶来辅助肿瘤细胞的恶性行为。另外由研究小组在小鼠乳腺癌模型中则证实肿瘤相关吞噬细胞肿瘤相关巨噬细胞在分泌IL-4的CD4+T淋巴细胞的调节下，可以分泌EGF，后者和乳腺癌表皮细胞上的受体结合，从而激活了乳腺癌表皮细胞内的信号通路，促进了该肿瘤的转移。

我们通过相关研究得到，其高度恶性骨肉瘤过程中的肿瘤相关巨噬细胞环节与其转移环节及其相关环节存在联系，这一环节和其他相关肿瘤类型相比，具备一定的特殊性，值得我们为此深入研究，通过不断的深入，该研究为利用巨噬細胞活化剂对高度恶性骨肉瘤进行辅助治疗提供了生物学理论依据，促进了对肿瘤系统有效研究的深化，保证了日常工作环节的稳定运行。

2.4 为了有效进行肿瘤系统的深化，我们要进行肿瘤增殖环节及其相关肿瘤相关巨噬细胞的应用，确保其肿瘤治疗系统的深化，以有利于实际工作应用的发展。我们发现其干扰素环节的应用，对肿瘤细胞的增长具备一定的意义，有利于其抗原的细胞活性的提升，当然这一环节需要进行刺激因子的应用，促进人体组织系统之间的监察，促进肿瘤细胞的及时发展，促进对肿瘤细胞的有效消除应用，促进其骨髓造血功能的不断增强，满足日常化疗效果的提升，以保证下序环节的进行。通过对老鼠的乳腺癌细胞的运作过程的分析，我们可以指导一种比较特殊的巨噬细胞能够实现恶性肿瘤细胞的体内转移。该研究发现的这类巨噬细胞或许能提供一种治疗癌症有用的靶标，通过药物治疗的方法或许能够阻断癌变的过程。

我们也要进行肿瘤的血管生成环节及其肿瘤相关巨噬细胞环节的应用，我们平常所说的肿瘤的血管包括其内皮细胞的有效激活、增值，促进其血管基底膜环节的有效降解，促进其下序环节的稳定运行，确保其内皮破坏系统的有效迁移。在这个运作过程中，其肿瘤的巨噬细胞扮演一个重要的角色。在此环节中其受到肿瘤间质的低氧环境的应用，其细胞因子不断生成，从而促进了血管环节的稳定运行。现有的研究数据表明，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的血管生成方面起着重要作用，它不但参与了新生血管的形成，更为重要的是重构了血管生成的网络。同时还有研究表明，乳粘素和巨噬细胞具有能够协同降低凝血活性的能力，其对PS相关的凝血功能紊乱有可能是一个有吸引力的治疗策略。并且，乳粘素介导的吞食将有助于改善APL纤溶亢进状态。

巨噬细胞的有效发展，实现了其内部微环境的相关细胞趋化因子的应用，确保其下序环节的有效运行，促进其肿瘤研究的不断深化发展。而在此过程中，许多机制我们还没有阐明。因此阐明巨噬细胞在肿瘤这个特殊的微环境中表型乃至功能变化的分子机制，最终可以抑制其促进肿瘤发展的作用有很大的应用价值。

3 结 语

为了实现对肿瘤环节的有效研究，我们要进行巨噬细胞环节的深化研究，以满足实际情况的需要。

参考文献

篇9：循环肿瘤细胞检测

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年9月~2015年8月华北石油管理局总医院(以下简称“我院”)产科收治的12例PIH患者作为研究对象,平均年龄(27.3±3.6)岁,平均孕龄(35.7±3.5)周。PIH患者的入选标准符合第6版《妇产科学》中的诊断标准,并且排除多胎妊娠以及心脏病、哮喘和糖尿病等合并症。选择同期我院12例正常孕妇作对照,平均年龄(27.5±4.1)岁,平均孕龄(35.2±3.6)周。PIH患者与正常孕妇在年龄、孕龄上的差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准,参与研究者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

内皮细胞培养基-2(EGM-2,瑞士Lonza公司);异硫氰酸荧光素(FITC)标记的激酶插入区受体(KDR),PE标记的CD34(美国BD公司);纤维连结蛋白(美国Hematological Technologies公司);噻唑蓝(MTT,美国Duchfo公司);TNF-α检测试剂盒(美国Peprotech公司);Di I标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac LDL,美国Molecular Probes公司);淋巴细胞分离液(天津TBD公司);FITC标记的血凝素(FITC-lectin,美国Sigma公司)。

1.3 检测方法

1.3.1血清TNF-α检测

于清晨空腹采集外周血5 m L,离心后分离血清,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及TNF-α检测试剂盒检测血清TNF-α水平。

1.3.2循环EPC数量检测

每位研究对象清晨空腹采集外周血5 m L,取200μL加入FITC标记的KDR、PE标记的CD34各5μL,避光孵育20 min,经红细胞裂解、2%多聚甲醛固定后,应用流式细胞仪检测CD34和KDR双阳性EPC的数量[4]。

1.3.3循环EPC体外培养和鉴定

清晨空腹采集外周血20 m L,密度梯度法分离单个核细胞(MNC),磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,1500 r/min离心2次(每次5 min),吸弃PBS后,加入EGM-2培养基反复吹打形成单细胞悬液,并调整细胞密度至1×107个/m L,取24孔板用纤连蛋白进行包被后没孔加入1 m L细胞悬液,在常规培养箱中(37℃、5%CO2)进行细胞培养,并定期换液。第7天时每孔加入5 mg/L的Di I-ac LDL,常规培养箱中(37℃、5%CO2)培养4 h。将培养基吸弃后每孔加入0.2 m L 2%多聚甲醛,常温静置15 min后用PBS浸洗5遍。吸弃PBS后每孔加入0.2 m L 5mg/L的FITC-lectin,在37℃培养箱中放置1 h。PBS浸洗3遍后,用激光共聚焦显微镜检测[5,6,7]。

1.3.4 EPC的增殖能力检测

细胞培养7 d后,用0.25%胰蛋白酶进行消化,并用EGM-2培养基重悬细胞,调整密度为1×105个/m L,96孔板每孔加入细胞悬液0.2 m L,37℃、5%CO2条件下培养92 h,加入MTT(5 mg/m L)20μL继续培养4 h。将培养基完全吸弃,每孔加入100μL DMSO,用酶标仪进行检测吸光度(A值,570 nm)。

1.3.5黏附能力检测

细胞培养7 d后,消化细胞并用EGM-2培养基重悬细胞,调整密度为5×104个/m L,取纤维连结蛋白包被的24孔板,每孔加入细胞悬液1 m L,在37℃、5%CO2条件下培养30 min。PBS冲洗3遍后,于200倍相差显微镜下对贴壁的细胞进行计数。

1.3.6细胞的迁移能力检测

细胞培养7 d后,用0.25%胰蛋白酶进行消化,并用EGM-2培养基(含0.1%胎牛血清,无细胞因子)重悬细胞,调整密度为5×104个/m L。取0.2 m L细胞悬液加入插入式培养皿中,并将其置入含0.6 m L EGM-2培养基的24孔板中,37℃、5%CO2条件下培养24 h。取出插入式培养皿,去除内层细胞,并对外层的细胞用2%多聚甲醛进行固定,经结晶紫染色后在200倍相差显微镜下对细胞进行计数。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,组间比较采用 χ2检验,以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清TNF-α 水平

应用ELISA法对两组孕妇的血清TNF-α 水平进行检测,结果显示,PIH患者血清TNF-α 水平为(2.28±0.48) μg/L,明显高于正常孕妇的(1.02±0.13)μg/L,差异有高度统计学意义(t=2.53,P < 0.01)。

2.2 循环EPC数量

应用流式细胞仪对两组孕妇外周血中CD34 和KDR双阳性的EPC数量进行检测,结果显示,PIH患者循环EPC含量为(0.014±0.003)%,明显低于正常孕妇的(0.021±0.007)%,差异有统计学意义(t=1.73,P <0.05)。 简单线性回归分析显示,PIH患者外周血中TNF-α 水平与循环EPC含量呈显著负相关(r=-0.73,P < 0.05)。

2.3 EPC培养及鉴定

外周血MNC培养7 d后生成的细胞,用Di I-ac LDL(红色荧光)和FITC-lectin(绿色荧光)进行双荧光标记。 在激光共聚焦显微镜下,细胞同时具有摄取Di Iac LDL ( 图1A, 封三), 和结合FITC -lectin ( 图1B, 封三)的能力。 图像重叠后可呈现为黄色荧光(图1C,封三)。

2.4 EPC增殖能力的变化

PIH患者循环EPC培养92 h后,经MTT法检测其增殖能力, 结果显示其在570 nm处的吸光度为(0.54±0.16),明显低于正常孕妇的(0.78±0.15), 差异有高度统计学意义(t=5.48,P < 0.01)。 并且,PIH患者循环EPC的增殖能力与外周血中TNF-α 水平呈显著负相关(r=-0.78,P < 0.05)。

2.5 EPC黏附能力的变化

PIH患者循环EPC的体外黏附能力检测显示,其每高倍视野的贴壁细胞数为(5.76±1.49)个,明显少于正常孕妇的(12.87±2.75)个,差异有高度统计学意义(t=2.73,P < 0.01)。 并且,PIH患者循环EPC的黏附能力与外周血中TNF-α 水平呈显著负相关(r=-0.82,P < 0.05)。

2.6 EPC迁移能力的变化

EPC培养24 h后, 对插入式培养皿外层的细胞进行计数显示,PIH患者循环EPC每高倍视野下迁移至外侧的细胞为(6.58±2.46)个,明显少于正常孕妇的(13.75±2.64)个,差异有统计学意义(t=3.72,P < 0.05)。并且,PIH患者循环EPC的迁移能力与外周血中TNF-α 水平呈显著负相关(r=-0.74,P < 0.05)。

3 讨论

PIH的发病机制与孕龄全身小动脉的广泛性收缩以及继发的内皮受损密切相关,主要原因是由于内皮细胞活化和损伤所导致的血管内皮舒张功能紊乱[8]。 血管内皮损伤发生后不能得到及时的修复或修复能力下降,造成内皮损伤和修复之间的动态平衡被打破,是造成血管内皮功能紊乱的主要原因。 EPC是血管内皮细胞前体, 大量研究表明,EPC在血管内皮的修复中发挥着很重要的作用,其状态的改变在一定程度上可以代表心血管疾病的严重程度和预后[9,10,11]。

妊娠期由于各种原因引发缺血缺氧进而造成血管内皮损伤时,胎盘可以通过促进血管内皮细胞分泌内皮细胞生长因子等细胞因子实现对骨髓EPC的动员,促进骨髓EPC的释放和归巢,实现对血管内皮的修复。当孕妇患有PIH并处于子痫前期,其循环EPC的数量与正常孕妇比较,会出现明显的下降[12],同时EPC的集落形成能力也会显著下降[13]。目前子痫前期患者EPC数量及集落形成能力下调的具体机制,及其在疾病过程中所发挥的作用尚不完全明确,然而基于EPC在血管损伤修复中的独特作用[14],可以推测,妊娠过程中各种原因导致EPC数量和功能下调,导致受损的血管内皮不能得到及时有效的修复,最终造成全身小血管的内皮舒张功能受损和子痫的发生[15,16,17,18,19]。

由于PIH患者血管内皮损伤发生后会造成炎症细胞的激活和TNF-α的大量产生[1,2],而在川崎病这类血管相关性疾病中,血清TNF-α与循环EPC数量之间的负性相关已经得到确认。由此可以推测PIH患者体内可能也存在类似的现象。基于以上考虑,本研究分别对PIH患者和正常孕妇的血清TNF-α水平和循环EPC数量进行了检测。同时,对其循环EPC的体外功能进行了检测,并深入地分析血清TNF-α水平与循环EPC数量和功能之间的相关性,以便进一步探讨PIH发生的可能机制。研究结果显示,患有PIH的孕妇,其血清TNF-α水平较正常孕妇存在明显的升高,而循环EPC数量则显著低于正常孕妇,且二者之间存在显著的负相关。这一结果提示,在PIH发生时,体内产生的包括TNF-α在内的大量炎症细胞因子能够显著影响EPC的动员和归巢,加之血管内皮损伤造成的循环EPC的大量消耗,造成循环EPC数量显著降低,从而无法有效实现对受损血管内皮的修复。此外,本研究采用体外培养的方式扩增循环EPC,并对其功能指标进行了检测,以观察PIH患者血清TNF-α水平与循环EPC功能改变之间是否存在一定的相关性。研究结果表明,PIH患者和正常孕妇外周血MNC均能够在体外实现EPC的培养和扩增,并具有摄取ac LDL和结合lectin的能力[20]。而PIH患者循环EPC的体外功能指标和正常孕妇进行比较都存在显著下调。并且PIH患者循环EPC的体外增殖、黏附和迁移能力均与其血清TNF-α水平呈显著负相关。

综上所述,本研究认为,妊娠期间由于各种原因导致血管内皮细胞受损,从而诱发局部炎性反应的发生。 在大量炎症细胞因子的作用下,导致循环EPC数量和功能的显著下调,使其对血管内皮损伤修复的能力明显弱化,从而造成受损的血管内皮得不到及时有效的修复,导致其舒张功能受损,最终造成PIH的发生。 然而在这一病理生理过程中的具体细胞途径还有待于进一步的研究。

A：EPC 摄取 Di I-ac LDL（红色荧光）；B：EPC 结合 FITC-lectin（绿色荧光）；C：图像重叠后显示，EPC 同时具有摄取 Di I-ac LDL 和结合 FITC-lectin 的能力（黄色荧光）；EPC：内皮祖细胞

摘要：目的 研究妊娠高血压综合征患者血清TNF-α与循环内皮祖细胞(EPC)水平的相关性。方法 选择2014年9月2015年8月在华北石油总医院住院的12例妊娠高血压综合征孕妇作为研究对象,选择同期入院的12例正常孕妇作为对照。检测所有孕妇的血清TNF-α和循环EPC数量。同时,分离外周血单个核细胞在体外进行诱导培养获得EPC,并对其增殖、黏附和迁移能力进行检测。结果 妊娠高血压综合征孕妇血清TNF-α水平较正常孕妇明显升高(t=2.53,P<0.01),而循环EPC数量则较正常孕妇显著降低(t=1.73,P<0.05),并且妊娠高血压综合征孕妇血清TNF-α水平与循环EPC数量呈显著负相关(r=-0.73,P<0.05)。妊娠高血压综合征孕妇循环EPC的体外增殖、黏附和迁移能力与正常孕妇比较,都存在一定程度的下调(均P<0.05)。并且,妊娠高血压综合征孕妇循环EPC的体外增殖、黏附和迁移能力均与其血清TNF-α水平呈显著负相关(均P<0.05)。结论 妊娠高血压综合征的发生与血管内皮受损和炎性反应所导致的循环EPC数量和功能的下调存在明显的相关性。