膈下逐瘀汤对大鼠纤维化肝组织CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表达的影响

肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理基础, 也是进一步向肝硬化发展的中间环节[1]。结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF) 是近年来发现的一种重要的促纤维化细胞因子, 不仅可以直接刺激成纤维细胞增殖和促进细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 合成, 还可以专一介导化生长因子-β (transforma-tion growth factor beta, TGF-β) 的促纤维化作用, 其异常表达在肝纤维化的发生发展中起关键作用[2]。血小板衍生生长因子 (platelet_derived growth factor, PDGF) 是结缔组织来源细胞的主要有丝分裂原, 可调控成纤维细胞的分化增殖, 具有诱导胶原和其他细胞外基质成分合成的功能。有研究表明, PDGF与组织纤维化的关系密切[3]。中药复方的作用特点是多种成分和多个靶点的整体调节, 在防治肝纤维化的效果上往往明显优于单味药物或单一成分。膈下逐瘀汤作为治疗膈下瘀血证的代表方剂, 对肝纤维化的预防、治疗具有良好临床基础[4]。因此, 本课题组利用实时荧光定量PCR和免疫组化技术, 观察了膈下逐瘀汤对大鼠肝纤维化肝组织中CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表达的影响, 旨在探讨膈下逐瘀汤防治肝纤维化的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 药物

膈下逐瘀汤取自《医林改错》原方。由五当归

9g、灵脂6g、红花9g、桃仁9g、川芎6g、乌药6g、丹皮6g、赤芍6g、甘草9g、延胡索3g、枳壳5g、香附5g组成。方药按传统水煎成剂并浓缩, 4℃冰箱保存。四氯化碳 (CCl4分析纯, 北京北化精细化学品有限责任公司) 。

1.1.2 实验动物及分组

实验动物及分组雄性SD大鼠6 0只, 清洁级, 体重 (200±10) g, 北京维通利华实验动物技术有限公司购买, 许可证编号SCXK (京) 2002-0003。将SD大鼠随机分为空白对照组、肝纤维化模型组和膈下逐瘀汤组共3组。

1.1.3 仪器及试剂

2700型PCR System扩增仪为Applied Biosystems公司产品, UV-2550型紫外分光光度计为日本岛津产品, ABI 7300荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。RNA抽提试剂RNAiso和SYBR (r) ExScript (tm) RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司。引物由TAKARA公司设计和合成, 其序列如下:GAPDH引物序列:forward 5′-GACAACTTTGGCATCGTG-GA-3′;reverse 5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。CTGF引物序列:CTGF引物序列:forward, 5′-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3′;reverse, 5′-AGCCCGGTAGGTCTTCACAC-TG-3′;Rabbit Anti-PDGF-A和SABC免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。DAB显色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 肝纤维化模型的建立[5]和药物干预

模型组用40%CCl4 (精制橄榄油配制) 皮下注射法, 剂量为2mL/kg体重, 每周2次, 共12周。空白对照组以生理盐水代替CCl4皮下注射, 膈下逐瘀汤组按7.0g·kg-1·d-1灌胃给予膈下逐瘀汤, 每天1次, 连续12周。空白对照组和模型组给予等体积蒸馏水, 给药方法同模型组。

1.2.2 大鼠肝脏组织CTGF mRNA表达水平检测

治疗结束后第2天, 每组随机取5只大鼠, 戊巴比妥钠麻醉取肝脏后处死。用RNAiso Reagent (TaKaRa公司) 提取肝组织总RNA, 利用紫外分光光度分析及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的含量、纯度及完整性。按SYBR (r) ExScript (tm) RT-PCR试剂盒方法将肝组织RNA逆转录成cDNA, cDNA中取1个样本进行梯度稀释作为绘制标准曲线的样本, 与其余样本同时进行PCR反应。PCR反应采用SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) kit试剂, 反应体系为20μL。热循环:95℃预变性10s, 共1个循环。95℃变性5s, 60℃退火31s, 40个循环。分别扩增GAPGH和CTGF, 每个样本作2个复孔, 获得到2组Ct平均值。用基于2-△△Ct方法进行相对定量分析[6]。△△Ct= (Ct目的基因-Ct管家基因) 实验组- (Ct目的基因-Ct管家基因) 对照组。

1.2.3 大鼠肝组织PDGF-A蛋白质表达水平检测

治疗结束后第2d, 每组都随机选出6只大鼠取肝组织, 用4%多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 切片。采用SABC法进行免疫组化染色, 石蜡切片脱蜡水化, 经0.3%H2O2室温25min灭活内源性酶, 微波炉加热抗原修复。用5%BSA封闭液室温封闭20min, 加PDGF-A抗体4℃冰箱过夜, 滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃20min, 滴加试剂SABC 37℃20min, 以上各步骤间均用0.02M PBS漂洗3次, DAB显色后苏木精淡染胞核, 常规脱水、透明、封片, 光镜下观察, 棕色着色处为阳性, 对照组用未免疫的兔血清代替一抗, 其他步骤相同。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统, 对每个统计场PDGF-A阳性细胞的积分光密度 (IOD) 进行测量。

1.2.4 统计方法

数据资料用表示, 采用SPSS 14.0统计分析软件, 所有数据进行正态性和方差齐性检验, 组间差异采用单因素方差分析, 组间两两比较用SNK检验法。 (x-±s)

2 结果

2.1膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝脏组织CTGF mRNA表达的影响 (图1和表1)

注:与模型对照组比较, *P<0.05

2.2 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝组织PDGF-A蛋白的影响

各组大鼠肝组织均见PDGF-A阳性细胞 (图2) , 通过Motic Med6.0数码医学图像分析系统分析各组IOD (图3) 。

3 讨论

慢性肝病在我国的发病率很高, 日益威胁我国人民的健康, 其中肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同途径。在对慢性乙型肝炎等原发疾病尚无有效病因治疗方法的情况下, 减缓或阻止肝纤维化进程是很重要的治疗对策。肝纤维化属中医“积聚”范畴, 中医药在防治肝纤维化方面积累了大量的临床经验, 利用中药多成分和多靶点的特点, 从疗效确切的药方中寻找新的治疗效果好、毒副作用较小的抗肝纤维化药物, 是我们国家创制自主知识产权新药物的捷径。膈下逐瘀汤出自清代医家王清任的《医林改错》, 临床应用比较广泛, 对肝纤维化的治疗有良好的效果。

目前认为, 肝纤维化是可以逆转的, 在纤维化过程中肝星状细胞 (hepatic stellate cell, HSC) 活化起着重要的作用, 而HSC活化主要涉及一系列细胞因子的作用[7]。其中PDGF是目前已知的HSC最强丝裂原, 也是HSC迁移最有力的促进因子, 对HSC的活化、增殖和迁移均有明显的促进作用。PDGF能够促进活化HSC产生胶原, 尤其是Ⅰ型和Ⅲ性胶原, PDGF还可以抑制胶原酶活性, 减少细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 的降解[8]。在肝纤维化的发生、发展过程中, PDGF的表达明显高于正常肝组织, 其活性随肝纤维化程度加重而升高, 尤其在肝星状细胞 (hepatic stellate cell, HSC) 内的表达量与肝纤维化程度呈显着正相关[9]。CTGF为PDGF的下游因子, 是一种富含半胱氨酸的多肽, 其主要生物学效应为促进细胞增殖, 参与细胞转分化过程和ECM的产生, 诱导黏附、参与组织的创伤修复。在正常状态下表达水平很低, 且其作用限于结缔组织, 因此, 阻断CTGF表达或抑制其活性, 将有望成为一种更特异、更有效的长期防治肝纤维化的手段[10]。

本课题组分别采用SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR法和免疫组织化学染色法检测各组大鼠肝组织CTGFm RNA和PDGF-A的表达, 结果显示, 各组均有CTGF m RNA和PDGF-A的表达。模型对照组与空白对照组相比CTGF m RNA和PDGF-A的表达显著增加;膈下逐瘀汤干预组与模型对照组相比CTGF m RNA和PDGF-A的表达则降低, 因此, 我们认为膈下逐瘀汤可调控肝组织CTGF mRNA和PDGF-A蛋白分子的表达, 从而延缓甚至抑制肝纤维化的进程。

注:与模型组比较:*P<0.05

摘要：目的 观察膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝脏组织结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF) mRNA和血小板衍生生长因子 (plateletderived growth factor, PDGF) -A蛋白表达的影响。方法 Sprague-Dawley (SD) 大鼠60只随机分为空白对照组 (n=20) 、模型对照组 (n=20) 和膈下逐瘀汤组 (n=20) , 共3组。用40%四氯化碳 (carbon tetrachloride, CCl4) 复制大鼠肝纤维化模型, 膈下逐瘀汤干预12周后处死大鼠。采用实时荧光定量PCR法检测大鼠肝组织CTGFmRNA的表达, 免疫组化染色法检测PDGF-A蛋白表达。结果 模型组CTGFmRNA2-ΔΔCt值 (3.59±0.52) 和PDGF-A积分光密度 (IOD) 值 (23.38±1.55) , 显著高于正常对照组 (分别为1.02±0.23和15.02±1.34) (P<0.05) , 表明模型组CTGF mRNA和PDGF-A蛋白表达上调。与模型组比较, 膈下逐瘀汤组CTGF mRNA2-ΔΔCt值 (1.62±0.25) 和PDGF-A IOD值 (18.04±0.83) 显著降低 (P<0.05) , 表明CTGFmRNA表达下调。结论 膈下逐瘀汤可能通过下调CTGF mRNA和PDGF-A蛋白的表达而发挥抗肝纤维化作用。

关键词：膈下逐瘀汤,肝纤维化,结缔组织生长因子,血小板衍生生长因子

参考文献

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