Smac和MDM2蛋白在子宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义

Smac (the second mitochondria-derived activator of caspase, 第2个线粒体衍生的半胱天冬酶激活蛋白) 是一种由线粒体释放到细胞质的重要的凋亡调节因子, Smac蛋白可与凋亡抑制蛋白IAP (inhibitor of apoptosis protein, 凋亡抑制蛋白) 结合, 使其丧失抑制Caspase (Cysteine aspartic acic specific protease含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶) 活性的作用, 因此, smac蛋白在细胞凋亡的途径中有着极其重要的作用[1~2]。MDM2 (murine double minute 2) 是一种癌基因, 它是P53调控网络中下游的靶基因, 作为重要的调节因子参与细胞周期的调控和细胞的凋亡的过程, 不仅与胚胎发育及组织分化有关, 而且参与肿瘤的发生、发展和转移。本研究旨在探讨smac蛋白和MDM2蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达及其意义。

注:△VS★, P<0.05;△VS★★, P<0.05

1 资料与方法

1.1 一般材料

收取兰州大学第一医院和兰州市中医医院2003~2005年活检和手术切除宫颈鳞状细胞癌 (均未进行过放化疗) 的石蜡包埋标本共60例。年龄26~74岁, 平均59.7岁。肿瘤直径<3cm的39例, ≥3cm的21例。分化程度:高分化12例, 中分化30例, 低分化18例。有盆腔淋巴结转移者28例, 未转移者32例。及宫颈鳞状上皮内瘤变病例45例, 其中低级别鳞状上皮内瘤变 (CIN I) 20例, 高级别鳞状上皮内瘤变 (CIN II-III) 25例。另选取的15例正常宫颈鳞状上皮作对照 (选自因子宫肌瘤行子宫切除术的宫颈上皮组织) 。

1.2 方法

自制60例宫颈鳞癌的组织芯片。免疫组化采用S-P法, 染色步骤按明书进行, 鼠抗人Smac单克隆抗体 (实验滴度1:150) 购自美国epitomics公司, MDM2单克隆抗体及SP试剂盒购自福州迈新公司 (即用型) 。以已知阳性切片做阳性对照。以PBS代替一抗作空白对照。严格按SP试剂盒的说明书操作, DAB显色。

1.3 结果判断

Smac、MDM2阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色, smac和MDM2定位于细胞浆。 (图1、2) 采用二级计分法, 即以染色强度与阳性细胞的百分比的乘积做为半定量标准。染色强度:0分为无色;1分为黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色 (深浅与背景色相对比) 。阳性细胞所占的百分比:1分为阳性细胞≤10%;2分为阳性细胞11%~50%;3分为51%~75%;4分为>76%。染色强度与阳性细胞所占的百分比的乘积0~3分为阴性 (-) ;>3分为免疫反应阳性 (+) 。

1.4 统计处理

应用SPSS 11.0版本统计学软件对结果进行分析。计量资料用配对χ2检验, 当理论频数<5时, 采用精确概率法。相关分析采用Spearman等级相关分析。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同宫颈组织Smac和MDM2蛋白的表达

Smac蛋白在正常宫颈组织、宫颈低、高级别鳞状上皮内瘤变及宫颈鳞癌中的阳性率分别为100% (15/15) 、85% (17/20) 、72% (18/25及65% (39/60) 。MDM2蛋白在正常宫颈组织、宫颈低、高级别鳞状上皮内瘤变及宫颈鳞癌中的阳性率分别为0 (0/15) 、10% (2/20) 、22.4% (6/25) 及61.7% (37/60) 。如表1所示, Smac和MDM2蛋白的表达在正常宫颈对照组和CIN II-III及与宫颈鳞癌之间均有统计学差异 (2=5.091;2=7.2 9 2;P=0.0 0 7;2=4.2 3 5;P=0.0 4 0;2=1 8.2 5 7;P=0.0 0 0) 。

2.2 Smac蛋白和MDM2蛋白的表达与宫颈鳞状细胞癌临床病理指标的关系

如表2所示, 宫颈鳞癌中Smac和MDM2蛋白表达在淋巴结有无转移及组织分化组中, 差异有统计学意义 (P<0.05) , Smac蛋白表达低的分化程度低, 淋巴结转移早, 组织分化低及淋巴结转移组的肿瘤组织中, MDM2蛋白过表达。两蛋白的表达与患者的年龄及肿瘤的大小均无明显的相关 (P>0.05) 。

2.3 Smac蛋白和MDM2蛋白的表达之间的关系

宫颈鳞癌中, smac蛋白和MDM2蛋白两者共同阳性18例, 共阴性2例, 经Spearman等级相关分析证实, Smac蛋白和MDM2蛋白的表达之间存在负相关性 (r=-0.435, P<0.001) 。

3 讨论

肿瘤的发生是一个多因素多步骤的过程, Smac的主要作用是拮抗IAP的抑制凋亡作用, 其在人体组织中广泛表达, 但在肿瘤组织中表达降低或缺失[3]。Yoo等[4]用免疫组化分析不同癌组织中Smac的表达, 结果显示癌中表达率为62%, 低于对照组, 同时也显示出Smac蛋白在不同癌组织中的表达不同, 提示smac蛋白的低表达将会抑制凋亡, 与肿瘤的发生密切相关, 我们的实验中, 在正常宫颈、宫颈鳞状上皮内瘤变到宫颈癌的分组病例中, 发现Smac蛋白的表达呈现下降趋势, 且其表达在正常宫颈组、CIN II-III及与宫颈鳞癌之间有统计学差异, 推测宫颈癌的发生与smac蛋白的缺失和降低有关。另外, Mizutani等[5]用Western blot检测78例新鲜肾细胞癌标木的Smac蛋白表达, 发现与正常肾组织相比, 有82%的肾细胞癌组织Smac蛋白表达低, 另有18%表达缺失。我们的实验也符合这一结论, 在宫颈鳞癌中, Smac和MDM2蛋白表达在淋巴结有无转移及组织学分化分组中, 显示均有统计学差异。表明Smac蛋白的表达失衡与宫颈癌的发展及恶性程度相关。

MDM2是1992年克隆成功的一种新基因, 研究显示, MDM2在人的各种组织中有广泛表达, 并在多种肿瘤中都发现有MDM2基因的过表达。本研究结果提示, 随着子宫颈鳞癌分化程度的下降, MDM2蛋白的表达升高, 差异有统计学意义, 并且在CIN分组中MDM2蛋白表达亦有统计学差异, 这与Dellas等[6]的研究相吻合。

Smac和MDM2基因都与细胞凋亡的调节有关, 更有意思的是smac基因位于12号染色体长臂, MDM2基因也位于此染色体的长臂, 其序列在进化上是保守的, 它们所编码的蛋白质都与肿瘤的发生、发展密切相关, 那么这两者之间又有何关联呢, 有研究显示[7], Smac是P53下游的一个调节基因, 而MDM2位于P53的上游并对其具有负性调节功能, 我们的实验结果与以上的结论相符, 宫颈鳞癌中, Smac蛋白和MDM2蛋白的表达之间存在负相关性。这种位于同一染色体上并相互调节的基因在肿瘤发生发展中究竟怎样发挥其作用, 尚需进一步研究。

摘要：目的探讨Smac和MDM2蛋白的表达与宫颈鳞癌临床病理参数之间的关系, 以了解其在宫颈癌的发生、发展、转移中的作用及意义。方法用免疫组织化学方法, 检测60例宫颈鳞癌和45例宫颈上皮内瘤变 (CIN) 及15例正常宫颈组织中smac和MDM2蛋白的表达, 并分析其表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级及淋巴结转移间的关系。结果Smac蛋白在正常宫颈、低级别宫颈上皮内瘤变 (CINⅠ) 、高级别宫颈上皮内瘤变 (CINⅡ-Ⅲ) 及宫颈鳞癌组织中的阳性表达率分别为100% (15/15) 、85% (17/20) 、72% (18/25) 及65% (39/60) 。MDM2蛋白在正常宫颈、子宫颈低、高级别鳞状上皮内瘤变及宫颈鳞癌中的阳性表达率分别为0 (0/15) 、10% (2/20) 、22.4% (6/25) 及61.7% (37/60) ;Smac和MDM2蛋白的表达在正常宫颈对照组和CINII-III及与宫颈鳞癌之间均有统计学差异 (P<0.05) 。宫颈鳞癌中Smac和MDM2蛋白表达在淋巴结有无转移及组织分化分组中, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;Smac蛋白和MDM2蛋白的表达之间存在负相关性 (r=-0.435, P<0.001) 。结论Smac和MDM2这2种蛋白互相调控, 其表达与宫颈癌的发生、发展等有关。

关键词：Smac,MDM2,子宫颈鳞状细胞癌

参考文献

[1] Eric Daugas, Santos A.Mitochondrion-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis[J].The FASEB Journal, 2000, 14:729～739.蛋白表达差异性研究[J].肿瘤防治研究, 2000, 27 (6) :483～484.

[2] Kerr J FR, Apoptosis:a basic biology phenomenon with wide Rang-ing implication in tissue kinetics[J].Br J Cancer, 1972, 26:269～257.

[3] Du C, Fang M, Li Y, et al.Smac a mitochondrial protein that pro-motes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition[J].Cell, 2000, 102 (1) :33～42.

[4] Yoo NJ, Kim HS, Kim SY, et al.Immunohistochemical analy-sis of Smac/DIABLO expression in human carcinomas and sarco mas[J].APMIS, 2003, 111 (3) :382.

[5] Mizutani Y, Nakanishi H, Yamamoto K, et al.Downregulation of Smac/DIABLO exprssion in renal cell carcinoma and its prognostic significance[J].Clin Oncol, 2005, 23 (3) :448～454.

[6] Dellas A, Scheetheiss E, Almendral A, et al.Altered expression of MDM2and its association with p53protein status, tumor-cell-proliferation rate and prognosis in cervicalneoplasia[J].Cancer, 1997, 74 (3) :421～425.

[7] 凌萧鸣, 郑英.宫颈上皮内瘤样病变及鳞癌中p53与MDM2蛋白表达差异性研究[J].肿瘤防治研究, 2000, 27 (6) :483～484.