长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生（精选6篇）

篇1：长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

以长柄双花木当年生嫩梢上的.叶柄、嫩茎、嫩叶为外植体,对影响长柄双花木愈伤组织诱导和继代、分化主要因素进行研究.结果表明:在培养基MS+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L上,三种外植体均可诱导出愈伤组织,其中叶片愈伤组织诱导率最高.该培养基还可作为愈伤组织继代培养基,但继代培养周期不超过2周.愈伤组织接种在MS+BA 2 mg/L上分化不定芽,根的诱导在1/2MS+IBA 0.5 mg/L培养基上进行.

作 者：曾建军 肖宜安 孙敏 ZENG Jian-jun XIAO Yian SUN Min 作者单位：曾建军,肖宜安,ZENG Jian-jun,XIAO Yian(井冈山学院,生命科学学院,江西,吉安,343009)

孙敏,SUN Min(西南师范大学,生命科学学院,重庆,400715)

刊 名：广西植物 ISTIC PKU英文刊名：GUIHAIA年，卷(期)：26(6)分类号：Q943.1关键词：长柄双花木 愈伤组织 诱导 继代培养

篇2：长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

高羊茅胚性愈伤组织诱导及植株再生

对高羊茅2个品种(新秀和夜明珠2号)的再生技术进行了研究,建立了高频再生体系,为遗传转化奠定了基础.该试验以成熟的种子为外植体,诱导胚性愈伤组织.结果表明,2品种胚性愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+2,4-D5.0mg/L+6-BA0.1 mg/L;愈伤组织分化的最佳培养基:新秀为MS+6-BA 2.0ms/L,夜明珠2号为MS+6-BA 1.0mg/L;生根最佳培养基为MS+NAA 0.5 mg/L.

作 者：黎岚 李名扬 皮伟 作者单位：西南大学园艺园林学院,重庆,北碚,400716刊 名：畜牧与饲料科学英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY AND FEED SCIENCE年，卷(期)：200930(1)分类号：Q949.714.2关键词：高羊茅 胚性愈伤组织 再生体系

篇3：长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

1 材料与方法

1.1 材料

大穗结缕草种子及幼苗,种子采集于山东无棣汪子岛,并室内培养幼苗。

1.2 方法

1.2.1 培养条件

MS培养基,在光强1 500~2 000lx,16h光照/8h黑暗,(23±2)℃条件下进行培养。

1.2.2 两种外植体消毒方法的比较

取大穗结缕草种子和3月份大穗结缕草叶片为外植体,选择两种常见消毒方法消毒处理,方法1:70%酒精浸泡1min→无菌水冲洗3次→10%NaClO浸泡20min→无菌水冲洗3次;方法2:70%酒精浸泡45s→无菌水冲洗3次→0.1%HgCl2浸泡8min→无菌水冲洗3次,消毒处理后,接种至MS+2,4-D(2.0mg·L-1)+6-BA(0.2 mg·L-1)培养基。进行污染观察统计,每3d观察并统计污染情况,共统计5次。

1.2.3 外植体的选择

取大穗结缕草叶片、花和种子,经消毒处理后,接种至MS+2,4-D(2.0mg·L-1)+6-BA(0.2mg·L-1)培养基。30d后,观察愈伤组织生长状态,统计愈伤组织诱导率。

1.2.4 愈伤组织的诱导

外植体消毒后,接种于添加了不同浓度2,4-D(1.0、2.0、3.0mg·L-1)、TDZ(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、6-BA(0.1、0.2、0.3mg·L-1)的MS培养基中,30d后,观察记录愈伤组织诱导率和生长状态。筛选出诱导愈伤组织的最适2,4-D、TDZ和6-BA浓度。及时处理已污染外植体,并及时添补新的外植体。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒方法的比较

从表1可看出,外植体发生污染的时间有早晚之分,并且污染程度也存在差异。其中方法1处理的外植体(包括种子和叶片)污染发生较早,且污染外植体数目较多。两种方法处理后,均是外植体种子比外植体叶片污染发生早,污染程度大,可能的原因是种子胚处绒毛比较密集,附带的细菌等过多,导致消毒液对其消毒不彻底。将2种方法中未经污染的大穗结缕草种子,在培养20d后,长成嫩绿的小苗,并伴有白色的短根出现,继续培养后,小苗进一步生长并分蘖,小根增多且长度增加。

2.2 不同外植体对愈伤组织诱导的影响

由表2可看出,不同种类、不同季节的外植体材料对试验效果影响很大,取材时间和材料的选择是组织培养的关键技术之一。试验表明,以3、4月份大穗结缕草叶片为外植体,3d后叶片伤口变为褐色,5d后叶片整体变为黄色或者干枯。可能原因是叶片纤维化程度大,不仅自身细胞水分含量少,而且从外界(即培养基)获取水分的能力弱,导致细胞脱分化困难,不适于愈伤组织的发生。5月份大穗结缕草叶片虽然也生长愈伤组织,但是数量较少;花器官和种子胚较易于愈伤组织的生长,并且外植体干枯数目较少,愈伤组织状态较均匀,长势较好。但是结合外植体污染数目,初步认定大穗结缕草种子胚最为理想。

2.3 激素对愈伤组织诱导的影响

由表3可知,在所设计的24种愈伤组织诱导培养基中,MS培养基单独添加2.0 mg·L-12,4-D(2号培养基)时愈伤组织的诱导率达到40%,且愈伤组织生长状态最好。同时,在培养基中单独添加1.0 mg·L-1TDZ(8号培养基)或0.2mg·L-16-BA(5号培养基)对提高愈伤组织的诱导率也表现出明显的促进作用。因此,初步确定大穗结缕草愈伤组织诱导的理想2,4-D、TDZ和6-BA浓度分别为2.0、1.0和0.2mg·L-1。综合以上结果,初步确定大穗结缕草愈伤组织诱导的理想培养基为MS+2,4-D2.0 mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1+TDZ1.0 mg·L-1(16号培养基);分化不定芽的最佳培养基是MS+6-BA(0.2mg·L-1)(5号培养基)。

3 结论与讨论

3.1 大穗结缕草组织培养中外植体及消毒方法的选择

试验结果表明,不同消毒方法处理大穗结缕草不同的外植体,消毒效果不同,大穗结缕草种子胚虽然比较适合用来诱导愈伤组织,但消毒效果较差。为了减少种子胚的污染,在消毒处理之前用流动的自来水充分冲洗种子,在消毒处理过程中,不断进行搅拌,可以改善消毒效果。同时在接种前及时对接种用解剖刀进行消毒处理,从而减少了外植体的污染。其中,获取种子胚时,不对种子进行切割处理,只是进行挤碎处理,有效地降低了种子胚的污染率。本试验选择不同来源和不同时期的大穗结缕草器官叶片、种子胚等外植体进行了愈伤组织诱导研究,结果表明种子胚诱导率最高,其次是花器官,而叶片诱导率很低。所以初步确定,以胚、花序为外植体诱导愈伤组织较以叶片为外植体容易。

另一方面,3、4月份大穗结缕草叶片纤维化严重,含水量极低,5月份大穗结缕草叶片质地较嫩,柔软且含水量相对较高,同时试验结果表明前者诱导率为0,后者为20%,所以,同种植物不同时期的状态对愈伤组织的诱导影响很大。

在愈伤组织的诱导中,不同外植体或同一外植体的不同部位、不同发育时期的差异,本质上可能都是细胞生理生化状态不同的结果。因此,外植体的选择在大穗结缕草愈伤组织诱导及植株再生研究中处于关键环节。

3.2 大穗结缕草组织培养中培养基激素浓度的选择

实践理论证明,生长素含量与细胞分裂素含量之比值对愈伤组织的生长影响很大,比值适中,有利于维持愈伤组织的生长[10]。在组织培养中,细化各种激素的浓度梯度,同时参考生长素与细胞分裂素的比值,则可以更进一步地确定出愈伤组织诱导、继代、分化的最适激素的最适比例组合,从而达到建立大穗结缕草高频再生体系的目的。试验结果证明,以大穗结缕草种子胚为外植体,愈伤组织的诱导的最佳培养基是MS+2,4-D2.0mg·L-1+6-BA0.2 mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1;愈伤组织分化不定芽的最佳培养基是MS+6-BA0.2mg·L-1。

参考文献

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篇4：长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

关键词：籼稻；成熟胚；愈伤组织；再生植株

中图分类号：S511.2+10.43文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0045-03

利用转基因技术进行遗传改良是改善籼稻品质、提高抵抗病虫害能力、培育新品种的重要手段之一，而高效的再生体系是遗传转化成功的先决条件。近年来，研究者从幼穗、幼胚、花药等部位诱导出愈伤组织和再生植株，愈伤组织诱导率高、质量好，被广泛用于水稻的遗传转化、品种培育中[1]。但是，上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展。从胚性愈伤中首先获得再生植株的是在粳稻中[2]，在籼稻中由于受到许多因素的限制，比如品种具有倔强的对抗外来刺激的特性[3]和具有基因型专一性[4-5]，使从成熟胚中诱导胚性愈伤组织率和植株再生率很低，导致了籼稻遗传转化很困难。

籼稻KraDangNgah是泰国南部的当地品种，因营养价值很高且具有特殊香味而深受人们喜欢，但容易遭受病虫害的危害。到目前为止没有关于籼稻KraDangNgah再生体系的研究报道。本研究为了建立KraDangNgah再生体系，为遗传转化打好基础，以成熟胚作为试验材料，对其在不同激素及浓度配比条件下的出愈率、愈伤组织状态及再生率进行研究，以期获得状态较好的愈伤组织，建立高效的再生体系。

1材料与方法

1.1试验材料及种子灭菌

籼稻KraDangNgah（OryzasativaL.）种子由泰国宋卡王子大学自然资源学院提供。健康成熟的种子剥去外壳后浸入70%乙醇中1min进行表面消毒，然后放入20%次氯酸钠溶液中，滴入2～3滴Tween205min；最后在超净工作台中用无菌蒸馏水洗4～5次；再将种子放在无菌滤纸上吸干水分，备用。

1.2试验方法

1.2.1愈伤组织的诱导

灭菌的种子接种到愈伤组织诱导培养基上，即MS培养基+3%蔗糖+0.75%琼脂糖+1～4mg/L2，4-D，pH值调节到5.7。愈伤组织诱导在25～27℃、16h光照条件下培养30d后，调查诱导率及愈伤组织的状态，愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的种子数/接种的种子数×100%。然后将愈伤组织转接到继代培养基继代培养。

1.2.2愈伤组织诱导率的提高及优化

为了提高愈伤组织诱导率和质量，将灭菌种子接种到经“1.2.1”节试验筛选出的较好的愈伤组织诱导培养基中，同时加入其他激素[（1）1mg/L2，4-D+1.5mg/LTDZ；（2）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA；（3）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（4）2mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（5）4mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（6）4mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN]和1g/L水解酪蛋白（CH），愈傷组织诱导的培养条件如“1.2.1”节所述。经过30d培养后调查愈伤组织的大小、形态和诱导率，然后转接到继代培养基中。

1.2.3愈伤组织的继代培养

为了选取质量好的胚性愈伤组织，将从成熟胚中诱导出的愈伤组织转接到添加激素及浓度配比与愈伤组织诱导培养基相同或减半的MS培养基中，所有继代培养基中添加1g/LCH。培养30d后记录胚性愈伤组织的诱导率和褐化率，并在立体显微镜下鉴别胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，然后转接到再生培养基中。

1.2.4植株再生培养

选取好的胚性愈伤组织，转接到添加不同细胞分裂素及浓度配比的MS培养基中，30d后调查再生情况。

1.3数据统计

试验数据采用Execl和DPS统计软件对愈伤组织诱导率、褐化率和分化率进行统计分析。

2结果与分析

2.12，4-D浓度对愈伤组织诱导的影响

灭菌的水稻种子接种到含1～4mg/L2，4-D的MS培养上培养7d后，种子开始膨胀，逐渐开始出现白色愈伤。30d后统计愈伤组织情况见表1。结果表明，培养基中不添加2，4-D时，没有愈伤组织形成；当2，4-D的浓度从1mg/L增加到3mg/L时，诱导率从20.0%提高到33.9%，且愈伤组织的形态也随之变化，从紧密黄褐色、紧密黄色到颗粒状微黄色；当2，4-D的浓度增加到4mg/L时，诱导率又降低到31.2%，且形态变为黄色松散状，有的黏液化（图1），说明高浓度的2，4-D抑制愈伤组织的形成。本试验结果表明，单独使用2，4-D诱导愈伤组织的诱导率很低，不适宜籼稻KraDongNgah愈伤组织的诱导。

2.2NAA、6-BA、KN和TDZ对愈伤组织诱导率的影响

nlc202309041730

灭菌的种子接种到添加不同种类激素和浓度配比的MS培养基上后，3～4d后就开始膨胀，7d后愈伤组织形成，这些愈伤组织随着培养时间延长不断增生，30d后调查愈伤组织诱导率和形态，结果（表2）表明，培养基中加NAA、6-BA、KN可以显著提高诱导率，最高可以达到56.3%；此外还可以改进愈伤组织质量。从外形上看，这些愈伤组织量大、比较致密、较硬，呈颗粒状结构较多，易于分化，在立体显微镜下观察呈胚性愈伤组织（图2、图3）。而在只有2，4-D的培养基上生长的愈伤组织比较松软，有的黏液化，有的有水泡，一般不易于分化（图1）。当在MS培养基中加入1mg/L2，4-D和1.5mg/LTDZ时，形成极少的愈伤组织（诱导率23.3%），其形态特征为紧密、硬且为白色，与其他激素浓度配比诱导愈伤组织较难增生。因此，2，4-D和NAA这2种细胞分裂素结合6-BA和KN2种生长素可以获得最高的愈伤组织诱导率和最好质量的愈伤组织，比单独使用2，4-D更能有效提高愈伤组织诱导率。

当MS培养基中加入2mg/L2，4-D和其他生长素、细胞分裂素时，形成大量的愈伤组织，形态学特征为致密、呈白色、带有一些绿点，这些绿点最终发育成芽，经过立体显微镜观察为胚性愈伤组织（图2）；当MS培养基中加入4mg/L2，4-D和其他生长素、细胞分裂素时，诱导的愈伤组织形态学特征为有些紧密、颜色从黄到白、比较小且有些褐化，只有少数的愈伤组织发展成胚性（图3）。进一步证明，2mg/L2，4-D配合其他植物激素更适合愈伤组织的诱导。因此MS+2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN是最好的愈伤组织诱导培养基。

2.3不同激素浓度及配比对胚性愈伤组织的影响

继代培养3周后，发现诱导培养基和继代培养基对愈伤组织的褐化和胚性愈伤组织的发育影响很大。结果（表4）表明，愈伤组织转接到只添加2，4-D的MS培养基上褐化很严重，随着2，4-D浓度增加，褐化率从100%减少到0，但其胚性愈伤的增殖很慢，表现出分化越来越困难。培养基中添加1mg/L或2mg/L2，4-D配合其他激素，褐化率比单独使用2，4-D低，为0～27.2%。当培养基中添加1mg/L2，4-D、0.5mg/LNAA、0.25～0.50mg/L6-BA和0.25mg/LKN时，愈伤组织没有褐化且出现更多绿芽（图4），表明激素浓度减半更能促进胚性愈伤组织的发育和分化。说明NAA、6-BA

和KN能有效抑制愈伤组织的褐化，促进胚性愈伤发育，从而提高分化能力。因此，这种培养基最适宜于愈伤组织继代和分化培养。

2.4不同配比的生长素和细胞分裂素对植株再生的影响

当胚性愈伤组织转接到表5中激素配比的培养基后，其分化和再生情况如表5所示。结果发现，与其他激素相比，TDZ可以加快胚性愈伤组织的分化，缩短再生时间，但分化率和再生率较低（图4），分别为29.6%、21.5%。NAA、6-BA和KN配合使用显著提高了分化率，达45.8%～75.5%，说明不同配比的细胞分裂素和生长素对植株再生有显著影响，当细胞分裂素高于生长素时，促进植株的再生。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN是最适宜愈伤组织分化和再生的激素配比。

3讨论与结论

籼稻的组织培养因品种不同，培养条件差异较大[6]，愈伤组织的质量是影响籼稻再生频率的关键因素，而2，4-D浓度对愈伤组织的数量及质量影响均较大。一般认为水稻愈伤组织诱导必须在培养基中添加2，4-D，以提高内源ABA的水平，促进胚性能力表达[7]，但仅添加2，4-D往往出愈率较低，特别是籼稻。本研究结果也表明，在诱导培养基中仅使用2，4-D时，诱导率比较低，说明籼稻HomKraDong具有基因型专一性。相同的结果在2010年被Zuraida等报道[8]。

田文忠在提高籼稻愈伤组织诱导率的研究中指出，在诱导培养基或继代培养基中加入KN和NAA能显著改善愈伤组织的质量，提高分化率[9]。本研究证实了这一点，当MS培养基中加入2，4-D配合NAA、6-BA和KN能够显著提高诱导率和改善愈伤组织的质量，说明细胞分裂素KN和6-BA可以改善愈伤组织的质量并促其分化。因此本研究以2mg/L2，4-D、1.0mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN为最适宜的愈伤组织诱导培养基。

Zuraida等對籼稻MR219的研究结果表明，细胞分裂素6-BA和生长素NAA均对籼稻的分化培养有极显著的影响[8，10]。本研究在分化培养基中加入6-BA浓度在1.0～1.5mg/L时，能够显著提高分化率；NAA是一种生长素，浓度过低则生长缓慢，浓度过高则在基部产生大量的愈伤组织且分化率下降，当NAA和KN配合使用时可以改进愈伤组织质量。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN浓度配比适合籼稻幼苗分化。本研究初步建立起了籼稻Kra

DangNgah的再生体系，为遗传转化奠定了基础。

参考文献：

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篇5：长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为玉米优良品种湘农3号, 由湖南农业大学农学院罗红宾教授提供。

1.2 试验方法

(1) 外植体的制备。选取授粉9~12 d后的玉米幼穗, 剥去苞叶, 用无菌刀片挑取出幼胚, 置于烧杯中用0.1%HgCl2溶液消毒10 min, 无菌水冲洗数次后备用。

(2) 培养基的配制。基本培养基为MS, 各种培养基的生长调节剂种类和浓度见表1~3, 所有培养基中蔗糖浓度均为30 g/L, 琼脂脂浓度均为7 g/L。

(3) 愈伤组织诱导及继代。将幼胚盾片朝上接种于表1所列的诱导培养基上, 每个三角瓶中接种5个幼胚, 每个处理3瓶, 各重复2次, 28℃暗培养, 20 d后统计出愈率并在继代培养时切去不定根, 将愈伤组织进行继代培养。

(4) 植株再生。继代20 d后将生长状况良好的胚性愈伤组织转入表2所列的分化培养基诱导芽分化, 20 d后统计绿芽分化率。待绿芽长至2~3 cm时将分化植株转入MS培养基进行壮苗培养, 15 d后将生长健壮的试管苗转入表3所列培养基中进行生根培养, 并于25 d后统计生根状况。待植株长至10 cm左右、根系发达时进行炼苗。

(5) 培养条件。培养室温度为25~28℃, 湿度为75%~80%, 光照强度为1 500 lx, 光照时间为14 h/d。

2 结果与分析

2.1 对玉米幼胚愈伤组织诱导的影响

玉米幼胚外植体较易获得愈伤组织。表1中的9组不同植物生长调节剂组合和浓度配比培养基均可诱导出愈伤组织, 但各培养基中外植体出愈率及愈伤生长状况有差异。当2, 4-D浓度为2.0 mg/L或2.5 mg/L时出愈率较高, 且诱导出的愈伤组织呈淡黄色, 结构松散, 有明显的颗粒状 (图1) , 是理想的胚性愈伤组织类型。另外, 继代培养结果表明, 该类型的愈伤组织经几次继代培养后生长状况仍保持良好, 几乎没有褐化现象。而其他植物生长调节剂组合培养基愈伤组织继代后均表现出不同程度的褐化现象。试验表明, 玉米湘农3号幼胚愈伤诱导植物生长调节剂组合以浓度为2, 4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L, 其出愈率可达66.7%。

注:表中数据为接种20 d后统计的结果。“+”的数量表示愈伤组织生长状况, 主要描述了愈伤组织的大小及质地。数量越多, 表示愈伤组织生长状况越好。

2.2 对玉米幼胚愈伤组织分化的影响

将上述培养基诱导产生的胚性愈伤组织转移至分化培养基进行不定芽分化培养, 接种10 d左右即可见愈伤组织表面有绿芽点出现 (图2) 。接种20 d左右不定芽形成 (图3) , 统计不定芽分化率 (表2) 。试验结果表明, 当KT浓度为1mg/L时, 分化培养基中添加一定浓度的IBA对愈伤组织的分化有影响, 且IBA的浓度亦会影响不定芽的生长状况, 在IBA浓度为0.5~0.7 mg/L时, 不定芽生长状况良好, 颜色保持翠绿。试验结果表明, 愈伤分化培养基MS+KT 1 mg/L+IBA 0.5mg/L适宜玉米湘农3号幼胚愈伤组织分化不定芽。

注:表中数据为接种20 d后统计的结果。“+”的数量表示试管苗生长状况, 数量越多表示试管苗生长状况越好。

2.3 不同植物生长调节剂组合对再生苗生根的影响

将生长健壮的无根试管苗转移至表3所列培养基上进行生根试验, 25 d后统计再生植株的生根情况 (图4) 、根的数量及粗细等。玉米湘农3号无根试管苗在9组不同植物生长调节剂组合和浓度配比的培养基中均可诱导根的分化。相比较而言, 培养基中添加6-BA 0.1 mg/L与NAA 0.6 mg/L组合生根效果最佳 (表3) 。该培养基不仅生根数量多, 且根的生长状况良好, 部分植株甚至出现了气生根。因此, 生根的最佳培养基配方为MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

3 讨论

在玉米幼胚的离体组织培养中, 愈伤组织的诱导受多种因素影响, 其中影响较大的因素是不同的基因型、不同的外植体以及培养基中生长调节剂的浓度及配比[2,3,4,5]。在玉米幼胚愈伤组织的诱导过程中, 2, 4-D的浓度对玉米愈伤组织诱导的影响极大[6,7], 适宜的2, 4-D浓度可以诱导出高质量的愈伤组织。龚娜等[8]认为, 在玉米幼胚愈伤诱导培养基中2, 4-D适宜的浓度范围为2~3 mg/L。以上研究结果与该试验结果基本一致。同时, 该试验的结果也证明在使用2, 4-D进行玉米愈伤组织诱导时, 添加适当浓度的NAA能更好地诱导出胚性愈伤组织。

注:表中数据为接种25 d的数据。

在愈伤组织分化芽的过程中, 细胞分裂素能明显促进芽的形成, 但高浓度的6-BA容易导致试管苗变异[9], 龚娜等[8]的试验还表明, 分化培养基中6-BA添加浓度过高时愈伤组织容易直接长根, 从而影响愈伤组织分化成苗的质量。因此, 该试验中采用KT作为愈伤分化的细胞分裂素, 同时添加了不同浓度的IBA, 比较不同培养基植物生长调节剂组合和浓度对芽分化的影响, 获得了比较满意的结果。此外, 生根试验比较了6-BA与NAA不同浓度配比对玉米湘农3号的影响, 结果表明适宜浓度的6-BA及NAA配比对生根有促进作用。

通过探讨不同植物生长调节剂配比对湘农3号玉米幼胚愈伤组织诱导及植株再生的影响, 初步构建了其愈伤组织诱导及植株再生体系。后续试验中有待对基础培养基和外源激素组合进行进一步优化, 从而为其遗传转化奠定基础。

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篇6：长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生

关键词：青稞；成熟胚；出愈率；愈伤诱导；植株再生

中图分类号： S512.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0044-03

随着生物技术的不断发展，以幼胚、花药、分生组织等为外植体，通过细胞和基因工程技术定向改良大麦品种的研究，已经取得了良好进展[1-5]。但这些培养方法都受到大麦生长季节的限制，一年中取材时间有限，易受环境影响等不足。利用大麦种子的成熟胚为外植体，则具有取材方便、不受生长季节限制、能够长年大量供应等优点，近年来，受到了越来越多的研究者青睐[6-8]。青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.），属禾本科大麦属，在植物学上属于栽培大麦的变种，因其籽粒内外稃与颖果分离，籽粒裸露，故称裸大麦，是青藏高原藏族人民的主粮，然而，青稞在其分子育种基础性工作的青稞成熟胚研究报道较少。

本试验选取青海省种植面积最大的青稞品种肚里黄为材料，以成熟胚为外植体，研究成熟胚不同处理方式以及不同培养条件对其愈伤组织诱导及其植株再生的影响，从而建立高效的青稞成熟胚再生体系，为青稞的遗传转化和品质改良等分子育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试品种

供试品种为肚里黄，是20世纪60年代从甘肃省甘南州引进的青稞农家品种。目前，肚里黄在青海省青稞种植区均有大面积种植。肚里黄种子由青海省农林科学院作物所青稞研究室提供。

1.2 培养基

愈伤组织诱导分别以MS、N6及B5大量+MS微量的3种培养基添加2 mg/L 2，4-D，分别添加不同浓度的2，4-D（2、4、6、8、10 mg/L），并设置不同的碳源（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖）。继代培养基以MS培养基，不添加2，4-D。分化培养基以MS培养基为基础培养基，添加KT和6-BA的不同組合。所有培养基均添加6 g/L植物凝胶，121 ℃下高温灭菌20 min后使用。

1.3 种子处理及组织培养方法

1.3.1 种子处理和灭菌 选取当年收获、籽粒饱满、大小一致的青稞种子，置75%乙醇中浸泡2～3 min；无菌水冲洗3～4次；再浸于5%次氯酸钠中15 min；无菌水冲洗3～4次；无菌水浸泡12～18 h；接种前用5%次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗3～4次后备用。

1.3.2 成熟胚的处理及初始愈伤组织的诱导 在超净工作台上将已灭菌的种子放在无菌滤纸上吸水后分别按照王兴珍等采用的3种方式[6]处理：（1）沿胚轴完全切开（纵全切），接种半胚；（2）垂直胚轴完全横切开（横切），只接种有胚芽的50%；（3）将胚完全刮碎（刮碎），悬浮于愈伤培养基上。于培养箱中（25±1） ℃，黑暗条件下诱导愈伤组织。

1.3.3 愈伤组织的继代和分化培养 将初始愈伤组织转接到继代培养基上，25 ℃、光强450 lx下培养，每隔 7 d 继代1次，诱导胚性愈伤组织；再将胚性愈伤组织转移到分化培养基上，25 ℃、光强450 lx下分化出植株。

1.4 统计与分析

接种1周后统计不同处理下的出愈率，待胚性愈伤组织转入分化培养基上2周后，统计分化的绿点数和绿苗数。所有试验结果采用Excel数据处理系统进行统计分析、差异显著性比较。

出愈率=诱导出愈伤组织的胚数/接种胚数×100%；

绿点数=分化出绿点的愈伤数/接种的愈伤数×100%；

再生苗数=分化出绿苗的愈伤数/接种的愈伤数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同成熟胚切割方式对成熟胚愈伤组织诱导的影响

以肚里黄种子为材料，研究3种不同的成熟胚切割方式对愈伤组织诱导率的影响。结果表明，不同种子处理方式对愈伤组织的诱导率有极显著影响。从图1可以看出，胚刮碎处理的出愈率显著高于其他2种处理。胚刮碎处理后的愈伤组织胚萌发较少，而且脱分化效果最佳，形成的愈伤组织呈淡黄色，质地紧密，表明玻璃化不明显。胚轴纵切和横切时，会出现大量萌发的胚芽，且愈伤组织玻璃化严重。因此，本试验均以刮碎的成熟胚进行接种诱导愈伤组织。

2.2 诱导愈伤培养基的优化

2.2.1 不同基础培养基对成熟胚诱导愈伤组织的影响 不同基础培养基（MS、B5、N6）对成熟胚诱导愈伤组织的影响见图2。从图2可以看出，不同培养基对肚里黄成熟胚出愈率的影响达到极显著水平。其中以MS为基础培养基时，肚里黄的出愈率最高，达71.1%；在N6基础培养基上的出愈率可达62.1%；而在B5基础培养基上的出愈率只有46.4%。研究结果表明，与其他2种培养基相比，MS培养基更适合作为青稞品种肚里黄成熟胚诱导愈伤组织的基础培养基。

2.2.2 不同碳源对愈伤组织诱导的影响 在MS基础培养基的基础上，比较3种不同的碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖）对肚里黄愈伤组织诱导的影响。从图3可以看出，3种不同的碳源对肚里黄出愈率的影响达到显著水平，其中以麦芽糖为碳源时，出愈率最高，为82.3%，其次是以蔗糖为碳源；而以葡萄糖为碳源时，出愈率最低，为70.0%。表明以MS为基础培养基，麦芽糖为碳源时，青稞品种肚里黄出愈率得到大幅提高，因此，麦芽糖可代替葡萄糖作为青稞成熟胚愈伤组织诱导的碳源。

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2.2.3 不同2，4-D浓度对愈伤组织诱导的影响 通过添加不同浓度的2，4-D研究肚里黄成熟胚愈伤诱导的情况。从表1可以看出，在2，4-D 浓度2～8 mg/L浓度范围内，随着2，4-D浓度的升高，肚里黄的出愈率随之升高。在 2，4-D 浓度为8 mg/L时，出愈率达到最高，为96.7%，随着2，4-D浓度的进一步升高，即10 mg/L时，反而抑制了愈伤组织的诱导。培养基中2，4-D的升高显著降低了成熟胚的直接萌发出芽率，且愈伤组织质量明显优于低浓度的愈伤组织，表明一定浓度2，4-D的添加对愈伤组织诱导存在促进作用，也可显著抑制胚胎的直接发生并有效改善愈伤质量。

2.3 不同分化培养基对成熟胚诱导愈伤组织的影响

挑选质地紧密的胚性愈伤组织，以MS为基本培养基，添加不同种类及浓度的激素，研究对成熟胚愈伤组织分化的影响。从表2可以看出，不同激素配比对肚里黄愈伤组织的分化有明显影响。在培养基中添加1.5 mg/L 6-BA和 1.5 mg/L KT时，绿苗分化率最高，达到44.5%。在0～1.5 mg/L 6-BA的培养基上，绿苗分化率是随着6-BA浓度的升高而提高，而当6-BA浓度为2.0 mg/L时，分化率反而降低；当6-BA浓度在同一水平时，随着KT浓度的升高，其出愈率随之提高，表明激素在一定范围内可以促进绿苗的分化，较高激素浓度会抑制肚里黄成熟胚愈伤组织的分化。

3 讨论与结论

青稞愈伤组织的诱导与植株再生是建立青稞遗传转化体系的前提。而以成熟胚为外植体，取材方便、不受生长季节限制，可以常年大量供应。研究结果表明，成熟胚作为外植体诱导愈伤组织时，诱导愈伤的同时，伴随有胚发芽现象[6，8-9]。因此，通过成熟胚的不同处理方式及诱导条件的优化，成熟胚也可以得到较好的愈伤组织。本研究与前人研究结果一致，認为刮碎的成熟胚可以抑制胚发芽现象，并可以形成良好的愈伤组织。此外，添加外源激素可以促进愈伤组织诱导和分化再生[10-12]。尤其是2，4-D不仅能够提高成熟胚的出愈率，而且可以抑制胚发芽现象，改善愈伤组织的质量，因此，被认为是影响成熟胚培养的主要因素之一[11，13-14]。在大麦成熟胚愈伤组织诱导培养中，王卉等的研究结果表明，在1～8 mg/L的范围内，2，4-D浓度对大麦成熟胚愈伤组织的出愈率影响较小，浓度间差异不明显[15]。而潘向群等对不同基因型和2，4-D浓度的互作研究发现，不同基因型的大麦成熟胚高频率诱导愈伤所需2，4-D浓度是不同的。本研究结果表明，青稞品种肚里黄，1～8 mg/L的2，4-D浓度范围内，肚里黄成熟胚的出愈率随着2，4-D浓度升高而逐渐升高，而且显著降低了成熟胚的直接萌发出芽率。此外，外源激素对愈伤组织的分化有明显的影响，众多研究表明，6-BA和KT的添加有利于芽的分化[16-18]，本研究结果与之一致，随着6-BA和KT浓度的升高，其愈伤组织分化率随之提高，在1.5 mg/L 6-BA和1.5 mg/L KT时，肚里黄绿苗率最高，达44.5%。

本研究结果表明，成熟胚的处理方式、基础培养基、碳源和激素的种类和配比对青稞成熟胚愈伤组织的诱导及分化具有一定的影响。本试验在刮碎的成熟胚接种以麦芽糖代替葡萄糖作为碳源MS基础培养基上，并添加6 mg/L的2，4-D，不仅明显抑制了胚芽的萌发，而且提高了肚里黄成熟胚的出愈率。通过肚里黄成熟胚愈伤组织诱导及分化过程中的各项参数条件进行优化，使得其愈伤组织诱导率及绿苗分化率分别达到96.7%、44.5%，结果表明，肚里黄成熟胚可以作为较好的遗传转化受体材料。

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