紫莓愈伤组织形态结构与体细胞胚发生的关系

2022-09-11

在现有植物快速繁殖技术中, 体细胞胚胎发生技术是较为有效的途径, 为基因表达和转基因技术等基础研究和应用基础研究、细胞诱变育种提供了较好的技术平台。植物体细胞胚胎发生及其机理研究的不断深入, 有助于在理论和实践上更深入地理解高等植物胚胎发生过程中的形态建成、组织分化及植株再生[1]。

目前, 对愈伤组织的诱导已有大量的研究[2,3,4,5,6,7,8,9,10], 并创造出许多既快速又高效的测定技术。但是对愈伤组织研究的成果多体现在外植体的选择与离体培养条件调整和优化方面[11,12], 较少见到对其进行离体形态解剖结构与单细胞胚发生关系方面的研究。本研究通过对3种愈伤组织和球型胚前体的形态、细胞大小, 液泡数量及种类, 叶绿体的结构及分布, 细胞核的形态、位置等方面的研究, 分析愈伤组织结构与体细胞胚发生的关系, 为愈伤组织的选择培养、体细胞胚的诱导和单克隆细胞系的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫莓 (Ribes nigrum L.) 植株, 从加拿大引进, 由天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 试验方法

愈伤组织的诱导用紫莓植株茎段作为外植体, 接种到1/8MS+3.0 mg/L 2, 4-D+20 g/L蔗糖培养基上, 进行稀软型愈伤组织的诱导;接种到1/4MS+1.0 mg/L 2, 4-D+20 g/L蔗糖培养基上诱导硬块型愈伤组织;松散型愈伤组织与球形胚前体采用苗博瑛的方法诱导[13]。愈伤组织培养条件为:温度20~23℃, 每天24 h光照, 光照强度2000 lx。愈伤组织通过徒手制片, 在Leica DM2000显微镜下观察, 其中每个处理观察10个切片 (重复10次) , 每个切片观察3个视野, 每个视野观察和测定3个细胞。细胞的大小用Auto CAD软件与测微尺进行测量, 并用公式计算细胞体积;其中稀软型愈伤组织细胞按圆柱体计算, 细胞体积为V=πr2h, 松散型与硬块型愈伤组织细胞按照球体计算, 细胞体积为V= (4/3) πr3。数据采用Excel 2007和SPSS Statistics进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同类型愈伤组织和胚前体细胞的形态结构比较

图1和表1显示, 稀软型愈伤组织、硬块型愈伤组织、松散型愈伤组织与球形胚前体4种组织形态结构差异较大。稀软型愈伤组织细胞呈长条形, 长宽比为 (7∶1) ~ (8∶1) , 其他3种组织细胞均呈圆球形。硬块型愈伤组织中部分分化出类似导管的细胞 (呈长条形, 长宽比为4∶1) 。稀软型愈伤组织细胞间隙最大, 硬块型愈伤组织细胞间隙最小, 其余2种居中。稀软型愈伤组织质地粘稠且颜色最浅, 松散型愈伤组织与球形胚前体均为较松软的组织, 硬块型愈伤组织质地最坚硬且颜色最深 (深绿色) 。松散型愈伤组织与球形胚前体的细胞形态结构和质地基本相同。

2.2 不同类型愈伤组织和胚前体细胞大小比较

观察测定结果显示, 4种组织细胞差异较大, 其中稀软型愈伤组织的细胞最大, 为65.42μm3, 是松散型愈伤组织细胞的3.5倍, 是硬块型愈伤组织细胞的3.6倍, 是球形胚前体的21倍。松散型和硬块愈伤组织细胞体积居中, 松散型愈伤组织细胞体积为18.79μm3, 大于硬块型愈伤组织细胞, 是硬块型愈伤组织细胞的1倍, 是球形胚前体的6倍;硬块型愈伤组织细胞体积为17.92μm3, 是球形胚前体的6倍。球形胚前体细胞体积最小, 仅为3.11μm3。

2.3 不同类型愈伤组织和胚前体细胞液泡数量比较

图2表明, 4种组织细胞中液泡的数量和大小差异较大。稀软型细胞的液泡数量最多, 变化也较大;其愈伤组织中具有1个中央大液泡的细胞占13.33%, 具有2~4个较大液泡的细胞占26.67%, 具有5~8个较大液泡的细胞占46.67%, 具有8个以上液泡的细胞占13.33%。松散型愈伤组织细胞中液泡较小, 数量多为2~4个, 占整个细胞总数的86.67%。硬块型愈伤组织细胞以具有1个中央大液泡的细胞为主, 占细胞总数的96.67%, 具有2~4个较大液泡仅有3.33%。球形胚前体以具有1个中央大液泡的细胞为主, 占细胞总数的93.33%, 具有2~4个较大液泡有6.66%。

细胞的分化程度可以从液泡的数量上反映, 液泡数量较多的较只有1个中央大液泡的分化程度低, 因此, 3种愈伤组织细胞中细胞分化程度为松散型和稀软型低于球形胚前体, 球形胚前体细胞分化程度低于硬块型愈伤组织。

2.4 不同类型愈伤组织和胚前体细胞叶绿体数量

图3表明, 4种组织细胞中叶绿体的数量和结构差异较大。在4×40倍显微镜下, 3种愈伤组织细胞的叶绿体数量为:稀软型和松散型愈伤组织细胞中叶绿体数量少, 硬块型愈伤组织细胞中叶绿体数量多, 球型胚前体中叶绿体数量较多。

叶绿体的主要功能是进行光合作用, 合成有机物供植物呼吸和生长发育利用。叶绿体的数量和结构共同反映了细胞或组织的代谢类型。硬块型愈伤组织的叶绿体数量最多, 说明其细胞的分化方向为成熟组织中的同化组织细胞, 分化程度较高。

2.5 不同类型愈伤组织和胚前体细胞壁比较

4种组织细胞多数为薄壁细胞, 差别不显著。但是, 硬块型愈伤组织中部分已经分化出厚壁细胞如类似导管的细胞 (图4) 。这种类似导管的细胞数量与硬块型愈伤组织的培养时间呈正比, 导管分子的类型有环纹、螺纹、梯纹、网纹和孔纹, 其类型也与培养时间有关。稀软型和松散型愈伤组织细胞均属薄壁细胞。

稀软型和松散型愈伤组织没有观察到细胞分化, 二者均属于具有胚性细胞特征的愈伤组织, 而硬块型愈伤组织已经出现了细胞的分化, 形成了具有输导组织——成熟的组织。

2.6 不同类型愈伤组织和胚前体的细胞核位置比较

观察表明, 4种类型组织的细胞核位置差异较大。稀软型和松散型愈伤组织细胞的细胞核大多数位于细胞中央, 其数量分别占全部细胞的88.89%和96.67%, 即只有少量的细胞核位于边缘;硬块型愈伤组织细胞中的薄壁细胞和球型胚前体细胞的细胞核大多数位于细胞的边缘, 其数量分别占全部细胞的93.33%和91.70%, 即只有少量的细胞核位于细胞中央;硬块型愈伤组织中的导管细胞中没有细胞核。

当细胞液泡化程度较高时, 细胞核消失或细胞中形成一个大液泡, 将细胞核挤到细胞边缘。因此, 硬块型愈伤组织分化程度最高, 球形胚前体细胞其次。

3 结论与讨论

本实验观察发现, 稀软型组织细胞较大、组织排列疏松、胞间隙大, 组织质地为粘稠状, 细胞液泡化程度较低, 叶绿体较少。松散型愈伤组织和胚前体细胞形态结构相近, 细胞较小、薄壁、细胞排列较疏松, 质地较软;但前者叶绿体较少, 后者叶绿体较多;前者液泡化程度相对较低。硬块型愈伤与上述3种组织最大的不同点是分化出了导管组织, 这是其组织质地较硬的原因, 其中细胞核消失, 硬块型愈伤的其他细胞没有分化, 与松散型愈伤组织细胞类似。

尽管球形胚前体为分化不久的细胞, 体积较小, 但就每一个细胞而言, 液泡占据了整个细胞, 细胞核与细胞质被挤到细胞边缘。因此, 球形胚前体为薄壁细胞, 整体的分化程度高于稀软型和松散型愈伤组织。

苗红梅等[14,15,16]对芝麻愈伤组织的诱导研究表明, 胚性愈伤的诱导能力最高。本研究发现, 松散型愈伤组织是诱导球形胚前体的良好材料。

4种组织的发育过程如图5所示。

实践操作时, 建议在组织培养的过程中选择松散型愈伤组织, 舍弃稀软型愈伤组织。筛选出松散型愈伤组织后, 通过控制诱导条件, 使之向球形胚前体的方向发展, 而防止硬块型愈伤发展的形成。

总之, 松散型愈伤组织继续诱导可以形成硬块型愈伤组织或球形胚前体, 关键在于控制诱导条件, 让松散型愈伤组织向球形胚前体方向发展。松散型愈伤组织最适用于体细胞胚的诱导。

摘要：为了了解紫莓不同愈伤组织与胚性愈伤组织形态结构的差异, 为体细胞胚的诱导提供依据, 以紫莓茎段为试材, 通过对4种愈伤组织的培养和其细胞形态、结构的观察研究发现:稀软型愈伤组织细胞最大, 是松散型和硬块型愈伤组织细胞的3.53.6倍, 是球形胚前体的21倍;稀软型愈伤组织细胞中46.67%的细胞具有58个较大液泡, 松散型86.67%的细胞具有24个液泡, 硬块型96.67%的细胞具有1个中央大液泡;稀软型组织中的叶绿体数最少, 其次是松散型, 球型胚前体和硬块型组织中的叶绿体数最多。总之, 稀软型组织细胞较大、组织排列疏松、质地粘稠、细胞液泡化程度较低, 叶绿体较少。松散型愈伤组织和胚前体细胞形态结构相近, 细胞较小、壁薄、细胞排列较疏松, 质地较软;但前者叶绿体较少, 后者叶绿体较多;前者液泡化程度相对较低。硬块型愈伤与上述3种组织不同的是分化出了导管组织, 这使其组织质地变硬。本研究发现松散型愈伤组织是诱导球形胚前体的良好材料。

关键词：紫莓,组织培养,愈伤组织,诱导,形态结构,球形胚前体,体细胞胚