牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

2024-04-27

牛蒡组织培养和高频植株再生的研究（共12篇）

篇1：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

黄花石蒜的组织培养和植株再生

1植物名称黄花石蒜(Lycoris aurea Herb.),又名忽地笑. 2材料类别鳞茎. 3培养条件(1)不定芽诱导培养基:MS+6-BA 10mg・L-1(单位下同)+NAA 0.5;(2)不定芽增殖培养基:MS+6-BA 5+NAA 0.5;(3)生根培养基:MS+IBA 2.上述培养基均加入3%蔗糖和0.8%琼脂,培养基灭菌前pH 5.8.培养温度为19～21℃,光照时间为12 h・d-1,光强为24～30μmol・m-2・s-1.

作者：王清彭菲肖艳 WANG Qing PENG Fei XIAO Yan 作者单位：湖南中医学院药学院,长沙,410004刊名：植物生理学通讯 ISTIC PKU英文刊名：PLANT PHYSIOLOGY COMMUNICATIONS年，卷(期)：200642(2)分类号：Q94关键词：

篇2：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

以小桐子(Jatropha curcas)的`胚芽、子叶、下胚轴、叶柄、叶片和茎段作为外植体,用不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)对其进行愈伤组织的诱导和植株再生的研究.结果表明:在MS培养基中加入5.0mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA对愈伤组织的诱导效果最好;加入5.0mg/L 6-BA和0.1 mg/LNAA对不定芽的诱导最为有效,加入0.1 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA有利于芽的生长;加入1.0 mg/L NAA的1/2 MS培养基对生根最为有利.

作者：秦虹宋松泉龙春林程红焱 QIN Hong SONG Song-Quan Long Chun-Lin CHENG Hong-Yan 作者单位：秦虹,QIN Hong(中国科学院西双版纳热带植物园,云南,勐腊,666303;云南农业大学园林园艺学院,云南,昆明,650201)

宋松泉,SONG Song-Quan(中国科学院西双版纳热带植物园,云南,勐腊,666303)

龙春林,Long Chun-Lin(中国科学院昆明植物研究所,云南,昆明,650204)

程红焱,CHENG Hong-Yan(中国科学院植物研究所,北京,100093)

篇3：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用的春蚕豆(vicia faba L.)品种为青海11号,是青海省农林科学院作物所选育的优质、高产大粒品种。供试基本培养基为N6,添加蔗糖、琼脂。生长调节剂为6-BA、NAA。

1.2 试验设计

试验设10个处理,即分别在培养基中添加0.50 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA(A)、0.05 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA(B)、0.10 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA(C)、0.05 mg/L NAA+1.5 mg/L6-BA(D)、0.08 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA(E)、0.05 mg/L NAA+2.4 mg/L 6-BA(F)、0.08 mg/L NAA+2.4 mg/L 6-BA(G)、0.10mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA(H)、0.06 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA(I)、0.10 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA(J)作为诱导分化培养基。每瓶接种4个茎段,每种培养基上接种外植体48个,8次重复。

1.3 试验实施

室内盆栽植株,剪取2~3节茎段,用自来水冲洗茎段10min,将洗净的茎段置于70%的酒精中灭菌30 s,再放入0.1%的升汞中灭菌8 min,取出后用无菌水漂洗4~5次。将消毒后的外植体切成单芽茎段,通过无菌操作,接种到培养基上。各培养基均添加3%蔗糖、1%琼脂,培养温度为(25±2)℃,光照为3 000 lx。20 d左右继代1次,30 d后统计结果。

2 结果与分析

2.1 不同生长调节物质诱导外植体分化的比较

外植体接种到诱导分化培养基上4 d后都有幼芽的萌发,只是分化的芽数不同。不同生长调节物质组合诱导芽分化的结果统计表明,在NAA浓度较低(0.05 mg/L)时,随着6-BA浓度的增加,平均分化芽数增加,但6-BA浓度为3.0mg/L时,平均分化芽数下降;在NAA浓度较高(0.10 mg/L)时,随着6-BA浓度的增加,平均分化芽数表现相同的变化趋势。在添加高浓度6-BA(3.0 mg/L)时,随着NAA浓度的增加,平均分化芽数在减少,当增至0.10 mg/L时,又大幅度下降;但在6-BA浓度较低(1.5 mg/L)时,平均芽数变化趋势相同,只是下降幅度略小(表1)。总的说来,6-BA浓度为2.0~3.0 mg/L,NAA浓度为0.05~0.08 mg/L,能分化出较多的小芽,并形成正常的植株。

2.2 不同糖浓度诱导外植体分化的比较

相同的培养基及生长调节物、不同糖浓度,对相同年龄的外植体诱导芽的情况是不同的(表2),5种糖浓度下以3%的平均分化芽数最多,达2.93个(均为接种后30 d统计),2%、4%、6%的平均分化芽数没有显著的差别;但高糖浓度下,>3个芽的平均芽分化率明显提高且芽生长健壮。考虑节约的原则,以3%的糖浓度为宜。

2.3 不同苗龄外植体再生能力的比较

幼嫩的外植体更容易诱导出芽的分化,分化能力随着外植体苗龄的增加而降低(表3),且随苗龄的增加,分化的小芽多为花芽,个别外植体有根的分化。

2.4 再生植株的生根

继代2~3次后,分化出的芽可以长高3~4 cm,2~3节,1.5~2.0片叶。将芽从基部切下,转入到不含任何生长调节物质的培养基上,20 d左右即可生根。

3 结论与讨论

6-BA和NAA是组织培养中广泛应用的生长调节物质[6],试验采用10个不同生长调节物质的组合,均能诱导芽的分化,其中以添加2.0~3.0 mg/L 6-BA、0.05~0.08 mg/L NAA的培养基的效果最佳,且越幼嫩的外植体诱导芽分化越容易。到目前为止,各种转基因技术的转化率都还相对较低,即使是用最广泛的农杆菌介导法,转化率一般也只有0.1%左右[7],这就要求受体系统必须具有较高的再生频率。在本文的研究的基础上,再稍加补充一些研究内容即可为今后的遗传转化研究提供一套可以利用的再生体系。

参考文献

[1]TEJKLOVA E,NOVAK FJ.Growth regulator action on faba bean(Viciafaba L.)shoot apices in vitro culture[J].Rostlinna-Vyroba,1984(30):543-553.

[2]THYNN M,WERNER D.Plantlet regeneration and somatic differentiationin faba bean(Vicia faba L.)from callus culture of various explants[J].Angewandte-Botanik,1987(61):5-6.

[3]SAYEGH A J.A protocol for faba bean(vicia faba l.)Micropropagationfrom seedlings[J].FABIS-Newletter,1988(21):12-13.

[4]GRIGA M,K LENOTICOVA H.Plant regeneration in callus Cultures offaba bean(Vicia faba L.)[J].Rostlinna-Vyroba,1994(40):697-709.

[5]GRIGA.Germplasm program-legume:annual report for 1994[R].Intern-ational Center for Agricultural Research in the Dru Area,1994:316.

[6]曹孜义,刘国民.实用植物组织培养技术教程[M].兰州:甘肃科学技术出版社,2001:15-17.

篇4：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

关键词：枣；嫩枝；茎段；组织培养；不定芽再生

中图分类号：S665.104⁺.3　文献标识号：A　文章编号：1001-4942(2012)01-0014-03

枣是鼠李科枣属多年生落叶木本果树，原产地中国。枣树适应性强，有“铁杆庄稼”之称。全国除西藏、东北等极寒冷地区尚无栽培外，其他省、自治区、直辖市均有枣树栽培。枣产业在农民脱贫致富、发展农村经济中发挥了重要作用。枣树品种的繁殖通常采用嫁接繁殖，繁殖效率低。采用组织培养的方法，进行工厂化快速育苗已在香蕉、苹果、樱桃砧木吉塞拉、草莓等品种上获得了成功。枣的组织培养研究虽然比其他果树起步晚，但枣树品种的组织培养研究已有一些成功报道。鲁枣1号是2009年山东省审定的极早熟鲜食枣新品种，采用常规嫁接繁殖方法短时间内不能满足生产上对该品种的需求，因此开展组织培养快速繁殖研究，对实现鲁枣1号品种的无性系快繁及优良品种资源的保存具有重要意义。

1.材料与方法

1.1试验材料

鲁枣1号正在生长的枣头嫩枝。

1.2试验方法

1.2.1芽的启动和增殖培养在生长季节，选取正在生长的枣头枝和二次枝，剪段，每段含有一个未萌发的主芽，流水冲洗30min，在超净工作台上先用70％酒精杀菌1min，然后用0.1％HgCl₂杀菌7min，最后用无菌水冲洗5～6次，接种到诱导培养基：MS+1mgL BA(单位，下同)+0.2 IBA+3％蔗糖上。芽萌发生长后分别转移到增殖培养基：(1)MS+2 BA+0.4 IAA+3％蔗糖和(2)WPM+2 BA+1 KT+0.1 NAA+3％蔗糖上进行继代增殖培养。启动培养4周时统计芽萌发率(萌发芽茎段数/接种总茎段数×100％)和不定芽再生率(产生不定芽茎段数/接种总茎段数×100％)。增殖培养6周时统计增殖倍数。

1.2.2试管苗生根切取在增殖培养基上生长高度在2cm以上的健壮绿苗转移到生根培养基1/4MS+0.5 IBA+2％蔗糖上进行生根诱导，诱导培养3周时统计生根率(生根梢数/接种总梢数×100％)。

以上培养基均加琼脂6g/L，灭菌前调pH5.8。

1.3培养条件

培养室温度(25±2)℃，光照时间14h/d。

2.结果与分析

2.1茎段主芽的启动培养

茎段在启动培养基上培养10d后，主芽开始萌发(图1A)，培养15d，主芽伸长生长(图1B)，培养20d，主芽伸长生长成梢(图1C)。主芽萌发率为54.8％。

2.2不定芽再生

茎段在诱导培养基上培养10d后，茎段上部切口处(即培养基上面的切口)产生大量白色愈伤组织(图1A)，培养20d后，上部切口处可观察到不定芽产生(图1C和图2A)。不定芽再生率为23.8％。但产生不定芽的茎段其主芽不萌发，主芽萌发的茎段不产生不定芽，同一茎段上未观察到主芽萌发和不定芽发生同时存在的现象。

2.3试管苗增殖

把萌发的主芽和产生的不定芽切下转移到增殖培养基上进行继代增殖。以增殖培养基(1)上增殖生长较好(图2B)，表现为增殖倍数较高，增殖培养6周时，平均增殖倍数为3.4，绿苗生长健壮，表现为叶绿、大而伸展，而在增殖培养基(2)上，增殖倍数平均为2.8，苗生长较细弱，叶小不伸展，且叶片上产生少量愈伤组织。可见，鲁枣1号适宜的增殖培养基为MS+2mg/L BA+0.4mg/L IAA+3％蔗糖+6g/L琼脂。

2.4试管苗生根与移栽

试管绿苗在生根培养基上培养20d，生根率可达85％以上。生根培养40d，在室内打开瓶盖炼苗3d，取出生根苗用自来水洗净根部培养基，移栽入干净的河沙中，移栽后盖塑料薄膜保湿。隔3～5d浇一次水，4周后成活率达76％以上。

3.讨论

枣试管苗建立时，可以取度过休眠期的枝条，水培催芽，以萌发的芽为外植体经杀菌消毒后接种，也可以直接从田间大树上取正在生长的枣头嫩枝，剪段消毒后接种，以这两种方式建立枣试管苗，已在很多品种上获得了成功。本试验以正在生长的枣头嫩枝为试材，成功获得了鲁枣1号的试管苗，这和前人研究报道结果一致，但嫩枝茎段产生不定芽为首次发现。

同一茎段上不能既产生不定芽又能使主芽萌发，这可能是外源激素影响所致。培养基中加入的外源细胞分裂素由茎段吸收后向上运输，促进茎段顶端细胞产生脱分化，产生不定芽，不定芽生长产生的生长素向下运输，抑制茎段下面的主芽萌发。如果主芽萌发生长，主芽生长产生的生长素影响细胞分裂素的运输方向和在植物体中的分布，影响外源细胞分裂素向茎段顶端的运输，影响不定芽的产生。

本试验利用嫩枝茎段为试材，在启动培养基Ms+1mg/LBA+0.2mg/LIBA+3％蔗糖+6g/L琼脂上既可使茎段主芽萌发，也可诱导茎段产生不定芽，茎段总生芽率可达78.6％，表明以嫩枝茎段为外植体可获得较高的试管成苗率，是建立试管苗比较理想的外植体材料。

参考文献：

[1]马雪筠，周丽侬，陈俊秋.香蕉组织培养快速繁殖技术研究[J].广东农业科学，1989，1：22-24.

[2]王法照，牟文忠，杜鹏，等.苹果脱毒苗工厂化繁殖技术研究[J].烟台果树，1994，3：18-21.

[3]李江，范志强，孙仲序.大樱桃优质矮化砧木吉塞拉批量组培快繁系统优化的研究[J].烟台大学学报(自然科学与工程版)，2007，20(1)：26-30.

[4]朱文勇，赵玉军，郭黄萍，等.无毒草莓组织培养工厂化快速育苗技术研究[J].山西果树，1995，1：21-22.

[5]任东植，曲运琴，白莉，等.苹果枣工厂化脱毒快繁育苗技术研究[J].农业生物技术学报，2000，8(2)：160，172.

[6]李风杰.鲁北冬枣组培快繁技术研究[J].落叶果树，2006，4：6-8.

[7]孙清荣，孙洪雁，周广芳.孔府酥脆枣试管苗离体叶片不定梢诱导和再生[J].植物遗传资源与环境学报，2011，20(1)：83-85.

[8]罗晓芳，田砚亭，李云，等.金丝小枣组织培养快速繁殖的研究[J].北京林业大学学报，1996，18(2)：9-15.

篇5：花花柴的组织培养与植株再生

花花柴的组织培养与植株再生

1植物名称花花柴[Karelinia caspica(Pall.)Less.]. 2材料类别花花柴种子萌发形成的`幼嫩叶片. 3培养条件丛生芽诱导培养基:MS+6-BA 0.4mg・L-1(单位下同)+NAA 0.5;生根培养基:1/2MS+NAA 0.2.上述培养基均加入2.5%蔗糖和0.7%琼脂,pH 5.8～6.0.培养温度为23～26℃,光照时间为16 h・d-1,光强约34μmol・m-2・s-1.4生长与分化情况

作者：张霞曾幼玲叶锋张富春 ZHANG Xia ZENG You-Ling YE Feng ZHANG Fu-Chun 作者单位：新疆大学生命科学与技术学院,新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐,830046刊名：植物生理学通讯 ISTIC PKU英文刊名：PLANT PHYSIOLOGY COMMUNICATIONS年，卷(期)：200642(4)分类号：Q94关键词：

篇6：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

苦荞胚性愈伤组织诱导与植株再生研究

以苦荞子叶和下胚轴为外植体,进行了不同浓度激素组合的`MS和SH固体培养基对胚性愈伤组织诱导及植株再生的研究.结果发现,MS培养基比SH培养基更有利于胚性愈伤组织诱导;2,4-D是诱导愈伤组织的有效激素,KT能有效促进胚状体的形成;下胚轴和子叶都能有效诱导出胚性愈伤组织和再生植株.下胚轴在MS+1.5mg・L-1 2,4-D+1.5 mg・L-1BA培养基,子叶在MS+2 mg・L-12,4-D+0.5～1.5 mg・L-1 BA上能高效诱导出愈伤组织;愈伤组织在MS+2 mg・L-1 2,4-D+0.1 mg・L-1 KT培养基中继代,能有效诱导胚性愈伤组织;来自下胚轴的胚性愈伤组织在1/2 MS+2.0 mg・L-1 BA+0.5 mg・L-1 KT+0.1 mg・L-1 NAA培养基上能够高频再生出芽,来自子叶的胚性愈伤组织在1/2 MS+1.0 mg・L-1 BA+0.1 mg・L-1KT+0.1 mg・L-1 NAA培养基上芽诱导率较高;MS+1 mg・L-1NAA是适宜的再生苗生根培养基.

作者：李占旗徐子勤 LI Zhan-qi XU Zi-qin 作者单位：西北大学,生命科学学院,西安,710069刊名：西北植物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA BOTANICA BOREALI-OCCIDENTALIA SINICA年，卷(期)：26(6)分类号：Q813.1 S517关键词：苦荞下胚轴子叶胚性愈伤组织植株再生

篇7：中原牡丹组织培养及植株再生研究

近20多年来,许多国内外学者就牡丹的组织培养开展了相应的工作[3,4],在牡丹鳞芽诱导、愈伤组织诱导、体胚诱导以及对牡丹组织培养过程中外植体分化、生根条件、移栽环境等进行了大量的研究,并取得了一些成果,但还存在许多问题,如试管苗褐化严重、生根率低、根系质量差、移栽阶段成活率低等问题[5,6]。中原牡丹是中国牡丹中起源最早、分布最广泛、品种最多且变异最丰富的品种群[7]。该试验选用洛阳国家牡丹园6个中原品种的牡丹鳞芽作为外植体,通过研究无菌体系的建立、增殖培养和生根过程中的基本培养基、激素配比的影响,来探索适合牡丹组培苗生长、生根的最佳激素条件,以期提高组培苗生长质量及生根能力,为牡丹工厂化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自洛阳国家牡丹园的洛阳红、菱花湛露、乌龙捧盛、脂红、璎珞宝珠、如花似玉等中原牡丹品种的鳞芽。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理。

将牡丹鳞芽外层干枯鳞片用镊子轻轻剥去,然后置于烧杯中,加适量洗洁精,在流水下冲洗20 min,再用定性滤纸吸去鳞芽表面水分,放置到无菌操作台上,用0.1%Hg Cl2消毒8~12 min,无菌水反复冲洗4~5次,用镊子及手术刀小心取出鳞片里面的嫩芽,接种到相应培养基中。

1.2.2 初代培养。

初代培养以改良MS培养基为基本培养基,附加不同浓度6-BA、KT、GA3、IAA的组合(表1),均添加0.6%琼脂和3%蔗糖。p H值5.8~6.0,温度(24±1)℃,光照时间12 h/d,光照强度2 000 lx。各处理接种30瓶,每瓶接种1个外植体。30 d后统计幼芽萌发及生长情况。

(mg/L)

1.2.3 继代培养。

诱导培养30 d后,植株高度达到4~5 cm时,将诱导苗用手术刀切去基部组织,转接入继代培养基,进行最佳继代培养基配方筛选。基本培养基为改良MS、蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L、PVP 0.4 g/L,p H值5.8。选择6-BA、KT、GA33种生长调节物质,2种浓度水平的正交试验(表2),每种处理转接30瓶,每瓶转接1株,30 d后观察统计长势与增殖系数。

(mg/L)

1.2.4 生根培养。

基本培养基为1/2MS、蔗糖30 g/L、琼脂5.5 g/L、PVP 0.4 g/L,p H值5.8。采用IBA、NAA、IAA 3种激素,3种浓度水平的正交试验设计(表3),将继代培养产生的分蘖芽接种到生根培养基中。35 d后统计生根率及生根质量,生根率计算公式如下:

1.2.5 培养条件。

培养条件为温度(24±1)℃,光照时间12 h/d,光照强度为2 000 lx。

(mg/L)

2 结果与分析

2.1 初代培养

由表4可知,9种培养基均能完成启动培养,但生长状况存在一定差异,随GA3浓度的增加,茎高逐渐加大;IAA浓度越大,基部越膨大;幼苗的玻璃化现象与6-BA浓度有一定的相关性。2、3、6号培养基的茎生长量适中,对继续培养有利,适宜作初代培养。其中,6号培养基最适合。而4、5、7号培养基叶柄较长,茎叶不太协调,不适宜作初代培养。

2.2 继代培养

由表5可知,2、3号培养基生长相对较差,1、4号培养基生长相对较好,但由于1号培养基增殖系数低,所以最佳增殖培养基为4号。试管苗随GA3浓度增加,茎叶生长变弱。

2.3 生根培养

由表6可知,6、7、9号培养基生根率相对较高,其中7号培养基生长情况基本正常,而且根直接从茎上长出。最佳生根培养基为1/2MS+IBA 4.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L。在一定IBA浓度范围内,IBA浓度越大,生根速度越快。

3 结论与讨论

该试验条件下,最佳初代培养基为MS+6-BA 0.5~1.0mg/L+KT 0.5 mg/L+IAA 0~0.5 mg/L+GA30.2~0.5 mg/L;最佳继代培养基为MS+6-BA 0.5~1.0 mg/L+KT 0.3 mg/L+GA30.2mg/L;最佳生根培养基为1/2MS+IBA 4.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L。

试验发现,改良MS培养基对中原牡丹品种均适合;6-BA对各品种芽增殖效果均较理想,适用浓度0.5~1.5 mg/L,增殖培养GA3浓度不宜超过0.5 mg/L,否则抑制下一步生根;1/2 MS添加IBA或NAA、IAA较适合生根培养,这与李玉龙等[8]认为试管苗生根所需生长素各类专一有差别,但与孔祥生等[9]用IBA诱导生根,生根质量及生根率均高一致。且3种生长素浓度和不宜超过5 mg/L,否则幼苗生长受到抑制。

采用牡丹鳞芽诱导完整植株的方法,可以不受季节和外界环境限制,在短时间内培育出大量再生植株[10];另外,采用牡丹鳞芽诱导方法进行快速繁殖,变异少,可用于牡丹种质资源的试管保存,具有其他繁殖方式不可取代的优越性,在牡丹种质资源保存及种苗生产上得到越来越广泛的应用。

参考文献

[1]王莲英.中国牡丹与芍药[M].北京:金盾出版社,2006.

[2]李萍,成仿云.牡丹组织培养技术的研究进展[J].北方园艺,2007(11):102-106.

[3]BOUZA L,JACQUES M,MIGINIAC E.Requirements for in vitro rootingof Paeonia suffruticosa Andr.cv.‘Mme de Vatry’[J].Scientia Horticultu-rae,1994,58(3):223-233.

[4]李志军,刘志国,李红梅.牡丹组培快繁技术研究[J].山东农业科学,2006(3):39-40.

[5]张桂花,王红梅,王连祥.牡丹组织培养技术研究[J].山东农业科学,2001(5):16-18.

[6]李艳敏,罗晓芳.牡丹离体培养与快速繁殖研究进展[J].西南林学院学报,2004,24(1):70-73.

[7]李嘉珏,张西方,赵孝庆,等.中国牡丹[M].北京:中国大百科全书出版社,2011.

[8]李玉龙,吴德玉,潘淑龙,等.牡丹试管苗繁殖技术的研究[J].科学通报,1984(8):500-502.

[9]孔祥生,张妙霞.牡丹离体快繁技术研究[J].北方园艺,1998,3(4):87-89.

篇8：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

关键词蜻蜓凤梨；叶片；组织培养；植株再生

分类号 TP391

Tissue Culture and Plant Regeneration of Aechmea fasciata Leaf

FU Yunliu XU Li LI Zhiying HUANG Bilan LI Kelie

（Institute of Tropical Crop Genetic Resources / Ministry of Agriculture Key Laboratory

of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China & Key Laboratory

of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation， CATAS，

Danzhou， Hainan 571737）

Abstract The regeneration system of Aechmea fasciata in vitro was studied with leaves as explants. The results showed the optimal medium for shoots induction was MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L with the induction frequency of 80%. The shoot multiplying medium was MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L. The elongation medium was MS+NAA 2.0 mg/L. The rooting medium was MS+NAA 2.0 mg/L+AC 0.5 g/L. The rooting frequency was 100%.

Keywords Aechmea fasciata ； leaf ； tissue culture ； plant regeneration

蜻蜓凤梨（Aechmea fasciata）为凤梨科光萼荷属植物，又名粉菠萝，其观赏期可达数月之久，由于花序粉红美丽，故商品名称之为“粉佳人”，原产于南美洲热带地区，自20世纪80年代初引入我国。其花形叶貌千姿百态，是很好的室内观赏植物，观赏价值和经济效益很高，市场前景广阔。蜻蜓凤梨传统的繁殖是利用其开花后母株产生的吸芽分株来实现，但由于生长不整齐、繁殖速度慢，后来逐渐被组织培养方法取代。目前我国对蜻蜓凤梨快速繁殖的研究已经起步，但以离体培养为手段进行的变异品种选育、种质资源创新等方面的研究有待开展[1]。已经报道的蜻蜓凤梨的离体培养均以其短缩茎[2-3]或试管苗的茎段、茎尖[4]为外植体进行组织培养，以叶片为外植体直接诱导分化芽的研究尚未见报道。蜻蜓凤梨开花量虽大，但在我国栽培的蜻蜓凤梨很难结实。因此，通过杂交培育蜻蜓凤梨的优良品种较难实现。随着分子生物学和基因工程的发展，利用转基因技术创新种质在多种植物上获得了成功[5-10]。尽管蜻蜓凤梨已经颇具观赏价值，但人们追求新、奇、特的心理使得有必要对蜻蜓凤梨进行创新。本研究以蜻蜓凤梨的无菌苗叶片为外植体，建立了高效的植株再生体系，为蜻蜓凤梨及其他凤梨科植物的品种改良奠定技术基础。

1 材料和方法

1.1 材料

蜻蜓凤梨试管苗，来源于中国热带农业科学院热带品种资源研究所快繁中心。

1.2 方法

1.2.1 丛生芽的诱导

取蜻蜓凤梨试管苗叶片，从叶基部往上切取3段，每段长约0.5 cm左右，接种于以MS为基本培养基添加不同种类不同浓度植物生长调节剂的诱导培养基上诱导不定芽的发生，40 d后统计结果。

1.2.2 增殖、壮苗、生根

待丛生芽长到2 cm左右时，转接于增殖培养基上，反复继代增殖6代后，转至壮苗培养基上，待苗长到5 cm左右时，单株切下，接种于生根培养基上。

1.3 培养基配方

1.3.1 诱导培养基

以MS为基本培养基，添加不同种类不同浓度的植物生长调节剂（表2）。

1.3.2 增殖、壮苗培养基

增殖培养基为MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；壮苗培养基为MS+NAA 2.0 mg/L。

1.3.3 生根培养基

生根培养基为 MS+NAA 2.0 mg/L+AC 0.5 g/L。

以上培养基均附加3%蔗糖、0.7%琼脂，pH值5.8～6.0，121℃灭菌20 min。培养温度（25±2）℃，光照时间12 h/d，光照强度30～40 μmol/m2/s。

1.4 统计分析

采用邓肯氏新复极差法（SSR）对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 蜻蜓凤梨无菌苗叶片不同部位的分化情况

蜻蜓凤梨试管苗的叶片切段，接种到诱导培养基上，10 d后，大部分带叶基的叶片切段在叶基一端发生瘤状突起，20 d后分化出芽（图1 A，1B）。其中带叶基的叶片切段分化率高达83.3%，而其他切段则不分化或很难分化，说明叶片的不同部位的分化能力存在极显著差异（表1）。因此，采用蜻蜓凤梨的试管苗叶片进行诱导不定芽，以带叶基的叶片切段做外植体效果较为理想。

nlc202309041321

2.2 不同激素组合对蜻蜓凤梨叶片基部诱导分化不定芽的影响

从表2中可以看出，诱导蜻蜓凤梨叶片产生不定芽较理想的培养基为MS+BA 5.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L，诱导率高达80%。只加IBA时，叶片切口处长根，不能分化出芽。本研究结果表明，生长素IBA与细胞分裂素6-BA配合使用，对蜻蜓凤梨叶片诱导不定芽效果明显，其不定芽分化率高。

2.3 增殖、壮苗与生根

将叶片分化的不定芽转入增殖培养基。经增殖得到的丛生芽可反复继代，其增殖系数为2～3。增殖约6代后转接至壮苗培养基上。当不定芽长至5 cm左右时单株切下，接于生根培养基上培养，15 d后便开始发根，生根率为100%（图1D）。约30 d后，待小苗高7 cm左右时即可炼苗移栽。

2.4 炼苗、移栽

参照徐立等[2]的方法，将生根良好的瓶苗打开瓶盖，室内炼苗3 d后，取出小苗，洗干净根部培养基，移植到育苗盘中。栽培基质配比为园田土∶椰糠∶河沙∶牛粪=4∶1∶1∶1。移栽前浇透水，移栽后再浇足定根水，用塑料薄膜和遮阴网进行遮荫保湿，15 d 后逐渐去掉塑料薄膜并及时浇水，小苗存活率为95%左右。

3 讨论与结论

在蜻蜓凤梨叶片诱导不定芽的研究中，能直接分化不定芽的基本是叶片的基部，而叶片中部和叶尖很难分化不定芽。叶片不同部位分化不定芽的能力存在明显差异，这可能与叶基部是叶片的生长部位，其分生组织活跃，或者该部位内源激素浓度较易分化成芽有关，而中部和顶部的叶段为成熟的组织，所含内源激素可能不适合分化芽，因此在与基部叶段相同的外源激素水平下较难诱导。

本研究以MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L为增殖培养基，增殖效果较好，但在该培养基上芽比较细弱，不易长高，需转到壮苗培养基MS+NAA 2.0 mg/L上经壮苗培养后，再切起单芽进行生根培养获得完整植株。

参考文献

[1] 傅新生，孟娇武，刘金. 现代花卉[M]. 北京：北京中国青年出版社，2003：75-76.

[2] 徐立，李志英，李克烈，等. 蜻蜓凤梨的组织培养和快速繁殖[J]. 园艺学报，2000，27（4）：303-304.

[3] 刘国民，李传代，邱榆. 粉菠萝组培快繁的研究[J].海南大学学报（自然科学版），2005，2（33）：250-256.

[4] 黎建玲，蒋波，何小燕，等. 蜻蜓凤梨快速繁殖的研究[J]. 玉林师范学院学报（自然科学），2006，27（3）：101-104.

[5] 魏俊杰. 转基因技术在玉米育种中的应用[J]. 农业网络信息，2010（7）：41-43

[6] 高越峰，荆玉祥，沈世华，等. 高赖氨酸蛋白基因导入水稻及可育转基因水稻植株的获得[J]. 植物学报，2001（5）：506-511.

[7] 陆瑞菊，黄剑华，王亦菲，等. 几丁质酶基因在番茄上的转化[J]. 上海农业学报，2000，16（4）：18-20.

[8] 魏艳丽，黄玉杰，李红梅，等. 棉花转基因技术研究[J]. 山东科学，2008，21（3）：38-41

[9] 蒋黎明. 菠萝（台农16号）遗传转化体系的建立以及白藜芦醇合成酶基因转化菠萝的研究[D]. 中国农业科学院，2007.

[10] Firoozabady E.， Heckert M.， Gutterson N. Transformation and regeneration of pineapple. Plant Cell， Tissue and Organ Culture[J]. 2006（84）： 1-16.

篇9：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

1 材料与方法

1.1 材料

选择保加利亚尖椒(Capsicum annuum L.Bulgaria pointed pepper)为试验材料,种子购于内蒙古赤峰县赤研种业有限公司。

1.2 辣椒植株再生体系建立

1.2.1 无菌苗的培养。

将精选种子阳光下曝晒2~4h,50℃温水中浸泡2~3h,70%乙醇消毒30~50s,无菌水清洗2~3次后用50%(体积比)次氯酸钠(活性氯3.75%)[2]消毒13min,无菌水冲洗5~6遍,播种于MB培养基,置于暗处萌发。待胚根露出后转入人工气候箱中培育壮苗。培养条件:白天26℃,夜晚20℃,光照14h/d,光强2 000~2 500Lx。

1.2.2 不定芽的诱导与伸长。

自播种次日开始计算苗龄。取16d苗龄的幼苗子叶,近轴面朝上接种于诱芽培养基中。暗处理5d后转入人工气候箱培养,每8d更换新鲜培养基,20d后统计不定芽诱导情况。从带芽的子叶切出0.3cm的芽段,接种到伸长培养基上进行培养。以芽伸长率为依据,确定伸长培养基的激素组合。待不定芽发生茎伸长并长至约2cm高后切下幼苗。

1.2.3 幼苗的生根与移栽。

将伸长的幼芽自基部切下,插入生根培养基上进行培养。通过添加不同浓度的IAA和NAA组合来筛选最佳培养基,20d后统计不定芽的生根情况,确定最适的生根培养基。待苗长出4~5条粗壮的不定根后,即可开瓶炼苗48h,移栽前将苗根部的残余培养基洗净。开瓶炼苗初期注意保湿,然后移植到灭菌土中,用灭菌水保湿。

2 结果与分析

2.1 6-BA和IAA的浓度及组合对不定芽诱导的影响

在MB+AgNO35.0mg/L+PD 5.0mL/L的基础培养基中添加不同6-BA和IAA组合,试验结果见表1。当激素组合为6-BA 3.5~5.0mg/L、IAA 0.5~1.0mg/L时,芽分化率最高达100%。诱导得到的不定芽芽点清晰,长度达0.5cm以上,呈墨绿色,长势好。同时,该组合得到的芽容易伸长,伸长后茎粗壮且容易诱导不定根,得到的再生苗生命力强。其他激素组合下虽然有较高的诱芽率,但得到的不定芽多表现为叶片卷曲或异常膨大的畸形芽。畸形芽难以伸长且生根效果很差。在此基础了进一步研究了6-BA和IAA组合的诱芽效果,发现6-BA 3.5mg/L+IAA 0.5mg/L为辣椒诱芽的最佳组合。

2.2 不定芽的伸长

辣椒植株再生研究中,最大的困难在于芽的伸长,而芽的伸长是诱导生根的前提。MB+GA31.0 mg/L作培养基时芽伸长可达83%。芽伸长阶段,每7~8d更换新鲜培养基,以满足芽迅速伸长所需的环境条件,伸长效果更加明显。

2.3 辣椒植株生根与栽培

不定芽伸长到2cm左右即可切下,移入生根培养基进行不定根的诱导。生根培养基IAA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L生根效果最理想(见表2)。生出的根呈白色、粗壮且侧根多。同时苗自身抽生碧绿的真叶,小苗移栽到无菌土后成活率达90%以上。即1/2MS+PD 5.0mL/L+IAA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L是最适合的生根培养基。

3 讨论

本试验建立的辣椒子叶高效植株再生体系中,外植体接种于分化培养基后,7~10d出现愈伤组织及芽点,20d后芽分化完成,分化率高达100%;不定芽转入伸长培养基,10d左右开始伸长,20d左右可长至2～3cm,芽伸长率最高为83%;切取伸长芽进行生根诱导,20d左右形成发达根系,生根率高达100%。从不定芽诱导开始至完整植株的获得,历时60d左右,与Sripichift等[3]报道的7个月及曹冬孙等[4]报道的3个月相比,成苗周期大为缩短。

注:表2中数据为诱导根20d后统计数据,A表示不定芽生根率(%),B表示根的生长情况。-表示差,+表示一般,++表示较好,+++表示好,++++表示很好。

摘要：以保加利亚尖椒为试验材料,探索子叶离体组织培养与植株再生体系的建立。结果表明:诱芽率达到100%,不定芽伸长率达83%,生根率达到100%,从不定芽诱导到完整植株获得仅需约60d。

关键词：辣椒,子叶,再生植株

参考文献

[1]余小林,李乃坚,黄自然,等.辣椒子叶离体培养和植株再生体系的建立[J].园艺学报,2000,27(1):42-46.

[2]黎定军,张宝玺,赵开军,等.辣椒子叶高效植株再生体系的建立[J].园艺学报,2002,29(1):25-29.

[3]SRIPICHIFT P.In vitro shoot-forming capacity of cotyledon explants inred pepper(Capsicum annuum L.cv.yatsufusa)[J].Japanese Journal of Breeding,1987(37):133-142.

篇10：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

关键词：马铃薯；外植体处理；组织培养；青海省；植株再生

中图分类号： S532.043 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0052-02

收稿日期：2013-08-21

作者简介：蒲秀琴（1978—），女，青海乐都人，助理研究员，从事马铃薯脱毒及组培研究。Tel：（0971）5310507；E-mail：qhpuxiuqin@163.com。马铃薯（Solanum tuberosum L.）属茄科茄属植物，起源于南美洲安第斯山脉一带，是世界上仅次于水稻、小麦、玉米的第4大作物，兼有粮菜的特性，世界年产量达3亿t。国际马铃薯中心（CIP）的研究表明，世界范围内对马铃薯的需求量到2020年将有望增长20%，超过水稻、小麦、玉米的增长，届时发展中国家对马铃薯的需求量将是2000年的2倍[1]。由于马铃薯是无性繁殖作物，依靠薯块维持品种的特性，并且正是这种特性导致病毒的积累，因此在培育脱毒马铃薯品种时首先要通过外植体的组培来繁殖脱毒苗。此外，一些珍贵的马铃薯品种在继代培养时由于各种原因容易被污染，其中较轻微的污染也可以通过外植体组培来挽救。近几年来，虽然中外研究人员在马铃薯离体培养及试管苗生根研究方面取得了一定的进展，但是初接种污染率高、外植体分化较难、离体培养物褐化退化现象严重、增殖系数低等问题一直未能得到很好的解决[1-5]。本试验以青海省主栽马铃薯品种的当年生带腋芽茎段为材料，研究了从初培继代增殖到生根各阶段的培养基成分及培养条件，试图建立一套较完整的马铃薯无菌培养体系，以期为青海省主栽马铃薯品种的组培工作提供参考[6-9]。

1材料与方法

1.1试验材料

外植体的采集工作在腋芽萌动到枝条停止生长期内均可以，采集时间一般以本地6月初到7月初为宜，取材不宜过晚，否则植株在大田中容易染病，不利于外植体消毒。本试验中的外植体材料取自青海省农林科学院生物技术研究所的试验田，供试品种为青薯2号、青薯9号、费乌瑞它。具体的取材时间在晴天中午，因为此时的枝条暴露在强烈阳光下，有利于杀菌。选取当年生半木质化的新梢，特别注意枝上应有饱满的芽；去掉顶部的嫩枝及枝上的叶片，因为叶片一方面占据了很大空间，另一方面容易携带病菌。将枝条剪成3～4 cm带芽的茎段后，先用洗洁精水漂洗10 min左右，再用自来水冲洗至洗洁精基本清除，然后泡在无菌水中备用。

1.2试验方法

在超净工作台上，先将外植体用70%乙醇处理20 s，然后分别用浓度为0.05%、0.075%、0.10%的氯化汞浸泡4、6、8 min，并在小型摇床上摇晃，使得氯化汞与外植体充分接触浸泡，最后用无菌水清洗4～5次并剪掉一小截茎段下部，以避免氯化汞渗入而影响营养吸收。试验用基本培养基为MS培养基。将处理好的外植体分别接种于MS基本培养基中培养18 d，观察灭菌效果并统计，将成活的茎段转接到6种添加了不同植物激素的MS诱导培养基上。诱导培养基的配方分别为：MS+3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；MS+4 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；MS+2.25 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；MS+1 mg/L 6- BA+1 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA；MS+1.75 mg/L ZT+1 mg/L IAA；MS+2 mg/L ZT+1 mg/L IAA。

在光照强度2 000 lx、光照时间16 h、培养温度25 ℃的条件下培养，将诱导产生的愈伤组织转接到配方为MS+0.3 mg/L GA3的分化培养基中，分别调查愈伤组织的产生情况与芽分化情况。

1.3数据统计

2结果与分析

2.1外植体处理

外植体无菌体系的建立对于整个试验过程是非常重要的，将青海省主栽的3个基因型马铃薯外植体茎段进行9种处理。由表1、表2、表3可知，外植体青薯2号用70%乙醇处理 30 s、0.100%的氯化汞处理8 min的灭菌效果最佳；外植体青薯9号茎段用70%乙醇处理30 s、0.100%氯化汞处理 5 min 的灭菌效果最佳；外植体费乌瑞它茎段用70%乙醇处理30 s、0.125%氯化汞处理8 min的灭菌效果最佳。其中青薯9号的灭菌效果最好，无菌率最高的达到了81.3%，0100%氯化汞处理5 min的褐化率为25.0%。在研究中发现，有些茎段在处理时即使出现褐化死亡，却仍然有真菌污染，说明在采样时带有真菌孢子，而氯化汞对真菌孢子的消毒效果不好。将消毒灭菌的马铃薯外植体接种到初培培养基上的结果表明，在茎段的腋芽处均能萌发出绿色不定芽，因而有足够的材料用于继代培养，初培试验比较成功。

3小结与讨论

马铃薯的初代培养是组织培养中最关键的一步。马铃薯枝条长期暴露在田间，容易孳生各种各样的细菌，有的细菌甚至能长入组织内部，因此外植体即使经过细致的表面灭菌，仍然会发生污染。此外，马铃薯富含酚类物质，因此克服污染和褐化这两大难题是马铃薯初代培养成功的关键。在整个消毒灭菌过程中，HgCl2的滅菌浓度和时间是最重要的，不同的基

因型要选择最佳的处理组合。

植物激素种类和基因型对马铃薯外植体植株的再生有一定的影响，从试验结果可以看出：不同基因型外植体的平均分化率差距很大，变化范围为16.89%～28.22%，这说明在选择转化受体时应该考虑高再生率的基因型。同一基因型的外植体在不同的激素作用下分化率也有差别，配方为MS+ 1 mg/L 6-BA+1 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA的培养基分化诱导率较高，而配方为MS+1.75 mg/L ZT+1 mg/L IAA的培养基分化诱导率较低。

nlc202309021336

本试验建立了一套较完整的关于青海省主栽马铃薯品种的组培快繁体系，以期有助于这些品种的大规模推广种植。

参考文献：

[1]谢开云，屈冬玉. 中国马铃薯育种进程[C]//中国马铃薯年会论文集. 哈尔滨：哈尔滨工程大学出版社，2002：5-9.

[2]Cassells A C，Goetz E M，Austin S. Phenotypic variation in plants produced from lateral buds，stem explants and single-cell-derived callus of potato[J]. Potato Research，1983，26（4）：367-372.

[3]Higgins E S，Hulme J S，Shields R. Early events in transformation of potato by Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Science，1992，82（1）：109-118.

[4]Dale P J，Hampson K K. An assessment of morphogenic and transformation efficiency in a rrange of varieties of potato （Solanum tuberosum L.）[J]. Euphytica，1995，85（1/3）：101-108.

[5]王萍，王罡，季静. 马铃薯两个基因型不同外植体的组织培养与植株再生[J]. 中国马铃薯，2006，20（6）：326-328.

[6]秦敏，郜刚. 马铃薯再生体系的建立及其遗传分析[J]. 中国马铃薯，2005，19（5）：270-273.

[7]双宝，李文芙，李文滨，等. 马铃薯优化再生系统的建立[J]. 马铃薯杂志，1995，9（3）：134-138.

[8]高华援，王楠，王庆峰，等. 马铃薯组织培养中常见的污染問题及解决办法[J]. 吉林农业科学，2007，32（2）：28-30.

[9]张永成，张凤军. 马铃薯不同基因型幼芽茎外植体的组织培养[J]. 农业科技通讯，2009（6）：44-46.

篇11：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

1 材料与方法

1.1 材料

大穗结缕草种子及幼苗,种子采集于山东无棣汪子岛,并室内培养幼苗。

1.2 方法

1.2.1 培养条件

MS培养基,在光强1 500~2 000lx,16h光照/8h黑暗,(23±2)℃条件下进行培养。

1.2.2 两种外植体消毒方法的比较

取大穗结缕草种子和3月份大穗结缕草叶片为外植体,选择两种常见消毒方法消毒处理,方法1:70%酒精浸泡1min→无菌水冲洗3次→10%NaClO浸泡20min→无菌水冲洗3次;方法2:70%酒精浸泡45s→无菌水冲洗3次→0.1%HgCl2浸泡8min→无菌水冲洗3次,消毒处理后,接种至MS+2,4-D(2.0mg·L-1)+6-BA(0.2 mg·L-1)培养基。进行污染观察统计,每3d观察并统计污染情况,共统计5次。

1.2.3 外植体的选择

取大穗结缕草叶片、花和种子,经消毒处理后,接种至MS+2,4-D(2.0mg·L-1)+6-BA(0.2mg·L-1)培养基。30d后,观察愈伤组织生长状态,统计愈伤组织诱导率。

1.2.4 愈伤组织的诱导

外植体消毒后,接种于添加了不同浓度2,4-D(1.0、2.0、3.0mg·L-1)、TDZ(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、6-BA(0.1、0.2、0.3mg·L-1)的MS培养基中,30d后,观察记录愈伤组织诱导率和生长状态。筛选出诱导愈伤组织的最适2,4-D、TDZ和6-BA浓度。及时处理已污染外植体,并及时添补新的外植体。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒方法的比较

从表1可看出,外植体发生污染的时间有早晚之分,并且污染程度也存在差异。其中方法1处理的外植体(包括种子和叶片)污染发生较早,且污染外植体数目较多。两种方法处理后,均是外植体种子比外植体叶片污染发生早,污染程度大,可能的原因是种子胚处绒毛比较密集,附带的细菌等过多,导致消毒液对其消毒不彻底。将2种方法中未经污染的大穗结缕草种子,在培养20d后,长成嫩绿的小苗,并伴有白色的短根出现,继续培养后,小苗进一步生长并分蘖,小根增多且长度增加。

2.2 不同外植体对愈伤组织诱导的影响

由表2可看出,不同种类、不同季节的外植体材料对试验效果影响很大,取材时间和材料的选择是组织培养的关键技术之一。试验表明,以3、4月份大穗结缕草叶片为外植体,3d后叶片伤口变为褐色,5d后叶片整体变为黄色或者干枯。可能原因是叶片纤维化程度大,不仅自身细胞水分含量少,而且从外界(即培养基)获取水分的能力弱,导致细胞脱分化困难,不适于愈伤组织的发生。5月份大穗结缕草叶片虽然也生长愈伤组织,但是数量较少;花器官和种子胚较易于愈伤组织的生长,并且外植体干枯数目较少,愈伤组织状态较均匀,长势较好。但是结合外植体污染数目,初步认定大穗结缕草种子胚最为理想。

2.3 激素对愈伤组织诱导的影响

由表3可知,在所设计的24种愈伤组织诱导培养基中,MS培养基单独添加2.0 mg·L-12,4-D(2号培养基)时愈伤组织的诱导率达到40%,且愈伤组织生长状态最好。同时,在培养基中单独添加1.0 mg·L-1TDZ(8号培养基)或0.2mg·L-16-BA(5号培养基)对提高愈伤组织的诱导率也表现出明显的促进作用。因此,初步确定大穗结缕草愈伤组织诱导的理想2,4-D、TDZ和6-BA浓度分别为2.0、1.0和0.2mg·L-1。综合以上结果,初步确定大穗结缕草愈伤组织诱导的理想培养基为MS+2,4-D2.0 mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1+TDZ1.0 mg·L-1(16号培养基);分化不定芽的最佳培养基是MS+6-BA(0.2mg·L-1)(5号培养基)。

3 结论与讨论

3.1 大穗结缕草组织培养中外植体及消毒方法的选择

试验结果表明,不同消毒方法处理大穗结缕草不同的外植体,消毒效果不同,大穗结缕草种子胚虽然比较适合用来诱导愈伤组织,但消毒效果较差。为了减少种子胚的污染,在消毒处理之前用流动的自来水充分冲洗种子,在消毒处理过程中,不断进行搅拌,可以改善消毒效果。同时在接种前及时对接种用解剖刀进行消毒处理,从而减少了外植体的污染。其中,获取种子胚时,不对种子进行切割处理,只是进行挤碎处理,有效地降低了种子胚的污染率。本试验选择不同来源和不同时期的大穗结缕草器官叶片、种子胚等外植体进行了愈伤组织诱导研究,结果表明种子胚诱导率最高,其次是花器官,而叶片诱导率很低。所以初步确定,以胚、花序为外植体诱导愈伤组织较以叶片为外植体容易。

另一方面,3、4月份大穗结缕草叶片纤维化严重,含水量极低,5月份大穗结缕草叶片质地较嫩,柔软且含水量相对较高,同时试验结果表明前者诱导率为0,后者为20%,所以,同种植物不同时期的状态对愈伤组织的诱导影响很大。

在愈伤组织的诱导中,不同外植体或同一外植体的不同部位、不同发育时期的差异,本质上可能都是细胞生理生化状态不同的结果。因此,外植体的选择在大穗结缕草愈伤组织诱导及植株再生研究中处于关键环节。

3.2 大穗结缕草组织培养中培养基激素浓度的选择

实践理论证明,生长素含量与细胞分裂素含量之比值对愈伤组织的生长影响很大,比值适中,有利于维持愈伤组织的生长[10]。在组织培养中,细化各种激素的浓度梯度,同时参考生长素与细胞分裂素的比值,则可以更进一步地确定出愈伤组织诱导、继代、分化的最适激素的最适比例组合,从而达到建立大穗结缕草高频再生体系的目的。试验结果证明,以大穗结缕草种子胚为外植体,愈伤组织的诱导的最佳培养基是MS+2,4-D2.0mg·L-1+6-BA0.2 mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1;愈伤组织分化不定芽的最佳培养基是MS+6-BA0.2mg·L-1。

参考文献

[1]中国植物志编委会.中国植物志:第10卷,第1册[M].北京:科学出版社,1990:125-131.

[2]AL-Kharyi J M,Huang F H,Thompson L F,et al.In vitro plant regeneration of zoysia grass(Zoysia japonica Steud.)[J].In Vitro Celluar&Developmental Biology,1987,233:3.

[3]柴明良,郭达初,钮友民,等.三种结缕草试管繁殖研究[J].科技通报,1993,9(6):411-414.

[4]樊晓莉,包满珠.组织培养获得日本结缕草绿色期延长株系[J].园艺学报,2005(3):467.

[5]Kitamura F.Studies on the horticultural classification and development of Japanese lawn grasses[J].Blu.Kemigawa Arboretum,1970(3):1-60.

[6]董令善,田有风.胶州市结缕草资源及其开发利用的探讨[J].中国草地,1992(1):6-8.

[7]赵丽萍,石东里,刘俊华.大穗结缕草幼苗耐盐生理机制及耐盐能力研究[J].西北植物学报,2009(7):1421-1425.

[8]石东里,赵丽萍,姚志刚.大穗结缕草萌发期耐盐能力试验[J].湖北农业科学,2007(5):782-783,844.

[9]石东里,赵丽萍,姚志刚.大穗结缕草种子打破休眠的处理技术研究[J].安徽农业科学,2007(35):11384-11385.

篇12：牛蒡组织培养和高频植株再生的研究

关键词：大白菜；游离小孢子培养；胚状体；培养基；植株再生；生长调节剂；活性炭

大白菜 [Brassica campestris ssp.pekinensis(Lour.)Olsson]是原产于我国的一种重要蔬菜作物，属于十字花科芸薹属芸薹种大白菜亚种。大白菜在我国秋、冬季蔬菜生产与供应中居主导地位，是我国栽培面积最大、产量最高的蔬菜作物。大白菜为异花授粉植物，杂种优势明显，目前杂交种亲本系的选育主要采用常规自交方法，此法所需年限较长，要育成纯合的可利用亲本需要5～7年。近年来常规育种的不足在实际工作中日渐明显，各国学者开始寻找育种的新途径和新方法。游离小孢子培养(isolatedmicrospore culture，IMC)技术是一种新兴的生物技术。它具有单细胞、单倍体和较高胚胎发生率及较高同步性等特点，通过这种途径可以迅速获得双单倍体(doubled haploid，DH)纯合植株，2-3年内便可获得基因型完全纯合的自交系，这就大大加快了育种进程。20世纪80年代末期，日本学者Sato等首次在大白菜春性早熟类型上培养得到小孢子胚和再生植株：90年代初期，我国学者率先在国内开展了大白菜小孢子培养。此后，国内外学者在小孢子胚影响因素和发生机制、小孢子植株再生和加倍机制及实践应用等方面做了大量的探索，并取得了许多重要研究进展，有必要进行综述和探讨。

1影响游离小孢子胚胎发生的因素

1.1供试材料对小孢子胚胎发生的影响

1.1.1基因型基因型是影响小孢子胚胎发生率的关键性因素。基因型对白菜小孢子胚胎发生能力的决定作用体现在2个方面：(1)基因型的反应范围。曹鸣庆等、栗根义等、蒋武生等等众多学者认为大白菜是具有较强游离小孢子胚胎发生能力的栽培植物种，能成胚的基因型分别为94.12％、92.31％和87.50％：徐艳辉等的试验结果相反，据其报道能成胚的基因型比率较低，为18.92％。(2)胚胎发生频率(产胚率)的差异。曹鸣庆等、栗根义等、蒋武生等、徐艳辉等、张凤兰等、方淑桂等、周英等、耿建峰等、胡齐赞等、张亚丽等、付文婷等认为不同基因型大白菜胚状体发生能力有明显差异：四倍体大白菜基因型对小孢子胚胎发生能力有显著影响。研究表明小孢子胚胎发生能力同其他遗传性状一样。是一种受基因调控的遗传特性，基因型是影响小孢子胚胎发生启动与否的内在因素。

小孢子胚胎的发生能力还与植株类型有一定的相关性。刘凡等报道叠抱类型大白菜产胚率高于合抱类型，早熟类型产胚率高于中、晚熟类型；方淑桂等㈣报道拧抱炮弹型品种不但比叠抱型品种胚诱导率高，且胚产量也高。

1.1.2生长环境供体植株生长的温度条件是影响小孢子培养的关键因子。一般从发育健壮的植株上取花蕾进行培养效果较好。现蕾开花期植株处于昼夜温度10～25℃条件下胚状体产量较高。日照长度对小孢子产胚量也有一定影响，长日照(14-18h)和低温(15～20℃)条件下植株胚状体发生数量及植株再生率高。方淑桂等研究表明，供体植株采蕾期的气温条件是小孢子胚胎发生的关键因素，采蕾前3d气温在14℃/24℃(夜/昼)最适宜小孢子发育。因此，在无人工气候室的情况下，小孢子培养工作尽量在春季(3-4月份)进行，以避开秋季日照短、温度高对小孢子培养不利的环境条件。

1.1.3 生理状况供体植株的花序龄对胚胎发生的影响不同。申书兴等研究表明。无论是二倍体品种还是四倍体品种，株龄对小孢子胚胎发生率影响显著，盛花期是小孢子培养的适宜时期。方淑桂等研究表明，盛花期的花蕾和供体植株营养状况良好，有利于胚胎发生及植株再生。轩正英等研究表明，株龄对胚诱导率有一定影响。盛花期和末花期产胚率最高。周英等研究表明盛花期出胚率高于初花期和末花期，张亚丽、王秀英等也得到了同样结果，王秀英等还进一步指出下午取蕾优于上午。

1.2小孢子发育时期及密度对胚状体形成的影响

1.2.1发育时期选择合适的花粉发育时期是提高诱导频率的重要因素。胚胎发生的激发启动，大致发生在单核中期至单核靠边期这一短暂的发育过程中。与二倍体植株相似，四倍体大白菜的小孢子发育时期对胚胎发生率也有显著影响。单核靠边期小孢子占多数时胚胎产量最高。所以，选取合适的花粉发育时期对胚状体的诱导非常重要。曹鸣庆等研究发现。蕾长与小孢子发育进程密切相关。CCll基因型大白菜花蕾长2.0-2.5mm时，处于单核中期的小孢子占41.7％，处于单核靠边期的小孢子占58.3％，此时产胚量最高。邹金美通过细胞学观察发现，当花蕾长2.0～3.0mm，花瓣与花药长度比为1/2～4/5时，50％-70％的小孢子处于单核靠边期，最适合进行花药和游离小孢子培养。花蕾大小还与栽培条件有关，如温室栽培的F₁，代材料，花蕾大小6～7mm时小孢子仍处于单核晚期，但生长在大田的植株合适花蕾仅2-4mm。因此，细胞学观察与植物学结合确定合适的取材是必要和切实可行的。

1.2.2接种浓度接种浓度是小孢子培养能否成功的一个至关重要的因素。过高和过低均不利于胚的发育。过高时，会消耗大量营养物质，并且释放许多有害物质，影响胚的发育；小孢子发育需要群体效应，过低同样不利于小孢子胚胎的生长发育。一般认为小孢子密度2×10⁴～4×10²个·mL^-1最合适，而最近的研究表明1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1最为合适。

1.3培养基成分对小孢子胚胎发生的影响

1.3.1基本培养基培养基是诱导胚胎发生的基础，其不仅影响小孢子细胞的分裂，而且对胚状体产生再生植株的过程也有深刻影响。栗根义等曾用改良的Lichter培养液。日本学者Sato等采用了大量元素减半的NLN(Nitsch and Nitsch)培养基，张凤兰等采用了BM培养基。近年来，绝大多数学者采用最适宜的NLN基本培养基，大大提高了培养效果。大白菜四倍体材料的小孢子培养也采用了NLN基本培养基。

1.3.2蔗糖小孢子培养过程中普遍采用蔗糖作为碳源，其不但提供能量还维持细胞的渗透压。蒋武生等在不加任何激素的试验中比较了不同蔗糖浓

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度的NLN培养基的培养效果，结果表明蔗糖含量为13％时培养效果较好。也有人选择10％和17％蔗糖浓度，高浓度蔗糖可保持小孢子活力，而低浓度蔗糖能促进小孢子分裂及其进一步发育。

1.3.3外源激素外源激素对胚形成和植株再生的影响至今没有取得一致的结果。轩正英等研究表明，6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄基嘌呤)能明显促进胚状体的发生，质量浓度0.05mg·L^-1时胚产量最高；张亚丽等和付文婷等研究认为6-BA对胚状体的发生和发育有促进作用，适宜质量浓度为0.2mg·L^-1；韩阳等研究认为6-BA的最适宜质量浓度为0.4mg·L^-1。

徐艳辉等报道，BA(Benzylaminopurine，苄氨基腺嘌呤)对小孢子胚胎发生有一定的促进作用，最佳质量浓度为0.2mg·L^-1；但对难成胚的基因型作用不大。韩阳等研究认为，NAA(1-naphthlcetic acid，α-萘乙酸)质量浓度在0.10-1.00mg·L^-1时对大白菜小孢子胚的发生有抑制作用，且浓度越高，其抑制作用越大。另外，在四倍体大白菜小孢子培养中发现，BA在0.2mg·L^-1水平下，NAA为0～1.0mg·L^-1时小孢子胚都有较高的发生频率，但NAA高于2.0mg·L^-1时会出现抑制作用。在0.5mg·L^-1NAA水平下，BA为0.05～0.20mg·L^-1时小孢子产胚率高；BA超过0.40mg·L^-1时出现抑制作用。

蒋武生等[司研究表明0.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA对小孢子胚胎发生具有抑制作用。韩阳等研究认为较低浓度的细胞分裂素能促进胚状体的发生，6-BA的作用大于ZT(zeatin，玉米素)，ZT的最适宜质量浓度为0.2Mg·L^-1；2,4-D(2,4-D butyl ester，2，4-D丁酯)对小孢子胚的形成有强烈的抑制作用。

1.3.4活性炭适量的活性炭可以加快离体培养进程，提高小孢子胚产量、子叶形胚率及胚状体发育的同步性，但活性炭浓度不尽一致。徐艳辉等同报道，0.01-0.02mg·mL^-1的活性炭可明显促进小孢子胚状体形成。申书兴等研究发现添加0.05-0.10mg·L^-1的活性炭对二倍体及四倍体大白菜小孢子胚生率和发育同步性均有明显促进作用。孙丹等研究表明。在培养基中添加0.10mg·mL^-1活性炭能增加大多数品种的胚产量。原因可能是适量活性炭吸附了小孢子胚所产生的有害物质。蒋武生等研究表明，0.50g·L^-1的活性炭有利于小孢子胚诱导和形成。刘凡等研究也发现，1.40mg·mL^-1活性炭质量浓度下。原来一些无胚状体形成的材料有胚形成。仅有较少胚状体形成的材料产生了较多胚状体；但个别材料无论如何也得不到胚或者只能得到1至数个不正常的胚。韩阳等研究发现，高浓度的活性炭对小孢子胚发生表现出抑制作用。

1.4培养方法对小孢子胚胎发生的影响

1.4.1低温(冷击)预处理培养前的花蕾低温预处理对小孢子胚胎发生有一定影响。Sato等报道冷击预处理花蕾能提高大白菜小孢子胚发生率。轩正英等研究表明，花序在4℃下处理1-2d时，小孢子诱导率可明显提高。路翠玲等研究也得到了同样结果，并发现未经低温处理或处理时间过长，其胚状体诱导率较低。耿建峰等研究表明低温处理0-5d范围内小孢子胚诱导率差异不大，超过5d则明显降低。

1.4.2高温(热激)预处理

当大白菜小孢子接种到培养基上时，需要高温来启动和诱导改变小孢子发育的定向过程。即从配子体发育过程转变为孢子体发育过程。栗根义等认为35℃高温预处理对大白菜游离小孢子胚状体诱导很重要，其作用机制可能是改变小孢子发育途径，阻止小孢子向成熟花粉粒方向发展，促进其沿胚胎发育途径发展，最后形成小孢子胚。

姜立荣等研究认为，35℃高温诱导下小孢子第1次细胞分裂方式多种多样，但对称分裂方式占优势。刘公社等应用FDA和DAPI荧光显微技术，观察了高温处理对小孢子培养的影响，研究表明，33℃高温预处理24h，然后转入25℃条件下培养。小孢子成活率虽在第1天急剧下降，但随后仍保持一定水平：膨胀后的小孢子多呈圆球形，以类似于胚胎细胞的对称分裂方式为主：小孢子经多次分裂形成紧密多细胞团，最终形成胚状体。李菲等研究表明小孢子主要发育途径为B途径，33℃高温预处理24h后单倍体小孢子体积膨大，染色体发生自然加倍，从而激发小孢子进入孢子体发育途径。

赵冰等研究表明33℃高温预处理24h，不同基因型材料出胚量存在明显差别，诱导效率越高的基因型对高温反应越敏感，出胚量也越多。蒋武生等研究发现，较易诱导的基因33℃高温处理24h的效果最好，对于难诱导的基因型处理48h后胚诱导率高。刘公社等咖研究认为小孢子培养的高温预处理时间因基因型而异，一般在24-48h有效：若以分裂频率为评价指标。小孢子接受高温处理的敏感期位于开始培养的12h内：若以胚胎发生为评价指标，敏感期位于开始培养的24h内。

1.4.3振荡培养游离小孢子培养靠固体和液体培养2种方式。一般液体培养基营养物质容易被小孢子吸收，但由于透气不良，会有褐色胚产生。申书兴等在小孢子培养14d后进行摇床培养(60r·min^-1震荡培养)7d，结果表明，摇床培养改善了培养基通气性，促进了原胚迅速发育成子叶形胚，促进子叶形胚率和胚状体发育的同步性及小孢子胚直接成苗。赵俊等报道80r·min^-1低频振荡极大地提高了出胚数量。

2影响小孢子胚植株再生的因素

2.1胚状体发育阶段

在早期的研究中小孢子植株成苗率很低。只有5％-10％。小孢子胚再生受基因型影响，再生能力强的基因型易形成小孢子植株，但同一基因型处于不同发育阶段的小孢子胚成苗率差异很大，子叶期胚具有迅速再生成苗的能力。鱼雷期胚则较难成苗，处于球形期和心形期的胚则发育停滞。曹鸣庆等研究表明心形期至鱼雷期的胚胎移植后半数以上发育为幼苗，其中5％～10％为白化苗。韩阳等研究发现成熟的子叶形胚成苗率可达20％，子叶已扩大的萌发胚成苗率更高，在90％以上；发育早期的胚较难成苗，尤其是心形胚和球形胚成苗率均为0。

2.2小孢子胚在液体培养基中滞留时间长短

成熟的小孢子胚在培养基中滞留时间长短对植

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株再生影响甚大。刘凡等研究表明停留14d和21d的小孢子胚转移至MS₀培养56d时成苗率分别达到85％和81.6％。停留28d和35d时最终成苗率只有63.3％和42.7％，大大低于前两者。

2.3固体培养基中水分含量

增加琼脂含量降低培养基中的含水量，可提高胚状体再生植株率。韩阳等研究表明。小孢子胚成熟后需要较干燥的生长环境，及时将成熟的子叶期胚转入相对干燥的培养环境对植株再生有利。当培养基中琼脂含量是1.2％时，最有利于小孢子胚成苗，再生株率为50.5％。刘凡等以含琼脂1.2％的MS₀培养基处理的死胚数量最少，植株成苗率最高，达到85.8％。申书兴等在四倍体材料小孢子培养中发现，培养基水分状况与成苗率有关，适宜胚状体成苗的培养基是B5附加3％蔗糖和1.2％琼脂。蒋武生等报道，B5+0.2mg·L^-16-BA+3％蔗糖+1％琼脂有利于小孢子胚长成植株。

2.4活性炭

刘凡等研究发现经活性炭处理获得的胚状体在光照下转绿、萌发、成苗等方面。都不及未经活性炭处理获得的小孢子胚。原因可能在于活性炭的吸附作用无选择性，当超过适宜浓度后，在吸附培养基中有害物质的同时，也吸附了生长调节剂、铁盐、维生素等与胚生长和分化密切相关的必要物质。因此活性炭浓度不宜太高，否则会起负作用。韩阳等研究表明，添加活性炭比不含活性炭成苗率高20％～122.5％，其中200mg·L^-1活性炭最有利于小孢子胚的成苗。

3小孢子胚继代、生根和移栽

蒋武生等研究表明，小孢子胚可在B5+0.20mg·L^-16-BA+0.02mg·L^-1NAA继代培养基上每25～30d继代1次。再将高度为3-5cm的健壮苗转移到Ms+0.10mg·L^-1NAA生根培养基上形成完整植株，植株4～5片叶时。移入盛有园田土的营养钵中7d后生根，10～15d后成活，成活率可达95％。付文婷等也有近似报道，B5+0.20mg·L^-16-BA+0.02mg·L^-1NAA有利于小孢子胚发育成植株，1/2MS+0.1mg·L^-1NAA适宜小孢子植株生根。徐艳辉等研究表明，2个基因型的小孢子胚在MS+0.8％琼脂+3％蔗糖+0.1mg·L^-1KT(Kinetin，激动素)+0.5mg·L^-1BA上的成活率分别为82％和92.5％。继代培养后的小孢子植株在1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.1mg·L^-1NAA生根培养基上生根良好，已生根的小孢子植株移到1/2壤土+1/2粪土的盆中便可生长。张亚丽等研究表明，B5+0.1mg·L^-1GA³(GibberellinA₃，赤霉素)是小孢子胚芽分化的最佳培养基，1/2MS+0.1mg·L^-1NAA为小孢子植株最适宜生根培养基。周英等研究表明，MS+0.10mg·L^-1NAA为小孢子植株生根最适宜培养基，

赵岫云等研究表明，小孢子植株再生能力的遗传符合加性一显性模式。主要受核基因控制，基因作用以加性效应为主。植株再生能力由隐性基因控制，狭义遗传力为70.6％。这为改良小孢子植株再生能力差的材料提供了一条有意义的途径，可选用植株再生能力强的材料与之杂交，提高后代植株再生能力，从而获得更多的小孢子再生植株。

4小孢子植株加倍技术

由小孢子培养所得到的植株只有通过染色体加倍成为二倍体才能应用于育种实践。小孢子再生植株中出现DH植株的频率不完全相同，但总体趋势是频率较高。曹鸣庆等研究由小孢子培养产生的小孢子植株中自然加倍率在50％～70％。张凤兰等研究了春秋两季小孢子再生植株自然加倍率不等，多数品种在70％，还认为由该游离小孢子培养得到的再生植株无需人工加倍处理，有自然加倍成为二倍体的特点。这一研究结果为该技术在育种工作上的有效利用提供了广阔前景。李菲等研究表明，小孢子胚再生植株具有较高的自然加倍率，并且与热激诱导激发小孢子单核自然加倍为二倍体密切相关。如需人工加倍，主要用0.2～4.0mg·g^-1秋水仙碱处理单倍体植株。

5问题与展望

综上所述，游离小孢子培养这一具有重要理论意义和实践价值的生物技术越来越被科研工作者所重视，并得到广泛应用。但还存在着许多理论和实际问题，如在适宜条件下，大多数基因型可获得小孢子胚，但也有少数基因型不能获得小孢子胚及再生植株，这一领域所取得的进展尚未达到随意操作雄配子的程度，在启动机理、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的理论研究还十分欠缺。

利用该技术能够在较宽的基因型范围内以较高的胚状体发生率获得小孢子胚和再生植株，但远远没有达到建立起完善的、高频的再生体系的程度。小孢子植株具有自然加倍成为二倍体的特点，在遗传和g种研究方面具有十分诱人的应用前景，但关于小孢子胚自然加倍机制尚待进一步探讨。

今后应加强理论研究和实验技术两方面的工作，建立能稳定、高效地获得纯合二倍体的游离小孢子培养体系，使之与传统育种技术有机结合成为大白菜育种的一个重要组成部分。

参考文献

[1]Sato T，Nishio T，Hirai M.Plant regeneration from isolated microsporeculture of Chinese cabbage(Brassica campestris ssp.Pekinensis)[J].Plant Cell Rep，1989，8：486-488.

[2]曹鸣庆，李岩，蒋涛，等.大白菜和小白菜游离小孢子培养试验简报[J].华北农学报，1992，7(2)：119-120.

[3]曹鸣庆，李岩，刘凡.基因型及供体植株生长环境对大白菜游离小孢子胚胎发生的影响[J].华北农学报，1993，8(4)：106.

[4]粟根义，高睦，赵秀山.大白菜游离小孢子培养[J].园艺学报，1993，20(2)：167-170.

[5]栗根义，高睦枪，赵秀山.高温预处理对大白菜游离小孢子培养的效果(简报)[J].实验生物学报，1993，26(2)：165-166.

[6]蒋武生，原玉香，张晓伟，等.提高大白菜游离小孢子胚诱导率的研究[J].华北农学报，2005，20(6)：34-37.

[7]徐艳辉，冯辉，张凯.大白菜游离小孢子培养中若干因素对胚状体诱导和植株再生影响[J].北方园艺，2001，(3)：6-8.

nlc202309020825

[8]张凤兰，钉贯靖久，吉川宏昭.环境条件对白菜小孢子培养的影响[J].华北农学报，1994，9(1)：95-100.

[9]方淑桂，陈文辉，曾小玲，等.大白菜游离小孢子培养若干因素探讨[J].福建农业学报，2004，19(4)：243-246.

[10]周英，冯辉，王超楠，等.大白菜小孢子胚诱导和植株再生[J].沈阳农业大学学报，2006，37(6)：816-820.

[11]耿建峰，侯喜林，张晓伟，等.影响白菜游离小孢子培养关键因素分析[J].园艺学报，2007，34(1)：111-116.

[2]胡齐赞，龚亚明，韦顺恋，等，大白菜花药和游离小孢子培养比较研究[J].浙江农业学报，2007，19(5)：352-355.