细胞培养司徒镇强

2022-07-19

第一篇：细胞培养司徒镇强

细胞克隆培养论文

摘要：随着生命科学时代的带来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，引起了社会各界的广泛关注。克隆包含动物、植物等方面，动物克隆在畜牧业生产、医药生产、疾病治疗、生物学基础理论研究、以及动物转基因工程等诸多领域蕴藏着巨大的应用潜力。通过科学研究者的努力，哺乳动物的克隆技术在农业和生物制药等方面取得了进步，展示了克隆技术的应用价值和发展前景。

关键词：动物克隆技术

1、克隆技术含义: “克隆”，即无性细胞繁殖系，又称为一个细胞株或细胞系，细胞株与细胞系没有本质的区别。也可以理解为复制，拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，，但大多行为思想不同。无性繁殖的手段有很多种，包括孤雌生殖，胚胎切割和细胞核移植等等。而产生克隆动物的方法则称为动物克隆技术。

在《中国大百科全书·生物学者》中，对“克隆”的解释是：克隆又称无性繁殖细胞系和无性繁殖系，是一个细胞或个体以无性繁殖重复分裂或繁殖所产生的一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传结构。克隆技术同整个生物界的进程一样，是由低级到高级，有简单的复杂不断发展和进步的。它由单个细胞获得2个以上细胞、生物体，发展到生物体内的生物大分子的自我复制，在DNA复制酶的作用下，复制生成俩个一模一样的DNA分子。

2、动物克隆的进程：

1938年，国外就有人提出提出成年动物的细胞核入卵子法克隆哺乳动物的设想。

1978年，我国著名科学家童第周成功地进行看了克隆黑斑蛙的实验，他将黑斑蛙的红细胞核移入到事先去除了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵发育成了黑斑蛙的蝌蚪。

1996年，用成年哺乳动物体细胞克隆出的哺乳动物个体克隆羊多莉出世，开创了体细胞繁殖哺乳动物的成功先例。

2003年，克隆马出世，是世界上首例哺乳动物生下自己的克隆体。

2003年8月，中国科学家在世界上首次采用克隆技术培育出含人免DNA混合物胚胎。

2003年9月，沃斯宣布他已克隆出了含人，牛DNA的混合胚胎。

2008年1月7日，2头具有绿色荧光遗传特征的小猪在哈尔滨诞生。

3、动物克隆技术的应用：

动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学，遗产学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。

动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5%的动物携带外源基因外源基因整合动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的几率低难以遗传给下一代。Schnieke等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子IX的转基因羊比原核显微注射法要有效得多。其中，两者最显著的差异是体细胞克隆的中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出世后才能得知，而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性的制备雌性的转基因动物，有利于在母乳中表达外源基因。

克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培养出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏病、神经损伤等多种疾病。用这种方法培养出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善。目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。

动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短了育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。

4、动物克隆技术的不足及未来发展方向

动物克隆技术然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步的应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels等报道克隆羊的端粒较同年羊短。Renard等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。

导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支持是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累不少数据，但一些很基本的问题任亟需解决。

动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要做连续核移植等。

综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进步。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决将有助于人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。

5、结束语

要紧跟世界科技发展的潮流，充分利用克隆技术为人类带来巨大的利益，又要严格控制可能造成混乱的克隆人出现。

参考文献：

《生命伦理学》、《生命的化学》学院：呼和浩特职业学院

专业：生物技术及应用年级：12级

姓名：郝媛学号：12305060023

第二篇：细胞培养技术总结

血清使用问题的总结

一、血清灭活问题。

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗? 答：不是必须的，看做什么实验了。

2、问：四季青胎牛血清灭活是56℃30分钟吗?

答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

3、问：我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗?

答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。

4、问：我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗?因为血清中可能有些补体和抗体，是不是会影响转染?我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗?细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么?

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活!这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。

5、问：(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗?有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中;我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有关系吗?

答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80℃，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

你可以摸索一下，血清从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

问：(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗? 答：正常。

二、血清灭活时温度问题。

1、问：因为实验室水浴锅失控，血清灭活时，温度到了61.7℃，这血清还能用吗?

答：多长时间啊?短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时，还照样用。

2、问：我灭活胎牛血清时，用的电磁炉，定在了70℃，本来说调温度到56℃再放血清的，后来忘了，就把血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了，不知道这样对血清有没有影响?

答：常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不大，要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，此外，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

三、血清的制备方法问题。

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备过程?

答：自己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话，用静置析出方法就行。

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活，我想用大鼠的血，不知道要不要灭活?

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心，取上清，在无菌过滤，也可灭活，然后分装冻存，用时再配。

3、问：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤?

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。灭活一般不会对血清中的一些因子损伤的。

四、血清的保存问题。

1、问：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月还能用吗? 答：只有试试了，如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以，先少用点看看。养细胞系应该没问题，原代不行。

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室温下一晚行吗?100毫升培养瓶加多少培养基呢?

答：可以放4℃。4-5ml。

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用?相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝试。

答：需要长期保存的胎牛血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1个月。

五、FBS可否代替人AB型血清?

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清，但是我觉得很多代理商都没有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类，但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)。但是我又不能够TRY。因为细胞因子确实太贵了，所以咨询一下。谢谢! 答：你最好照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂)。细胞培养的影响因素很多，特别是培养基的成分。

六、血清和培养基的种类及品牌问题。

1、问：细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢?周围有人用PAA或Hyclone的，这两种跟Gibco或sigma出品的差别大吗? 答：如果是长得非常快得细胞如pa317，293，c6等恶性肿瘤细胞，一般得国产血清就可以，如果是原代培养的细胞，最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清，Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季青和甘肃民海(中美和资)不错。有些细胞(如：sf9，293还有其他一些元代细胞)，用Gibco的比其他两种好很多，会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣!另外，Gibco的还要看产地。

2、问：最近要订一瓶胎牛血清，实验室之前都在用小牛血清，没有买过胎牛血清。请问哪个公司的好一些?问过试剂公司，有两种：一种是PAA的(分普通级和优级)，一种是Hyclone的(只有普通级，而且是新西兰产的)。试剂公司推荐使用PAA优级的，但看好多文献都用Hyclone的，公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请问用的哪种胎牛血清比较好?

答：民海的效果还不错，要是不放心国产的，那就买进口的。进口的好多公司都有，新西兰产的效果一般。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

3、问：四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别?培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些? 答：用无支原体胎牛血清就可以啦。

4、问：SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清? 答：我一直用GIBCO的1640，你可以买含HEPES的1*10L的包装，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。请查阅：

七、培养基血清浓度问题。

问：在1640里加血清时加多了，90ml里加了20ml血清，约为18%，以前都是加10ml的，查了网上多建议用10%-15%，有关系吗?

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大，建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好，但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

八、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可以，效果是否有保证?这样确实能节省不少血清的。答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。 10%的FBS完全培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊，难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗，还有，我的BRDU只用到48小时就不用了，因为担心其损伤太大，可以持续用多久呢?

答：我用10%FBS终止的，然后差速1h，然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu，心肌细胞还是比较多和稳定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就会有搏动。

九、牛血清污染噬菌体的问题。

1、问：有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染，以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够除去噬菌体?

2、问：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌体，它对细胞培养到底有什么影响? 暂无回答。

十、问：MTT加药的时候加不加血清?加药时要用无血清的培养基吗? 答：我的药就是用含血清的培养基稀释的，不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用，无形中对细胞造了一个serum-free的模型，细胞在提内本来就是有血清供应，如果该药物都不能对抗，那该药物就没有什么临床价值了，这是我的理解。十

一、AB血清的制备问题。

问：本人想从人的外周血中分离AB血清的，用于B淋巴细胞的培养。谢谢大家给点建议。人的血，来之不易啊。答：是AB血型人的血清吗?这种血清即没有抗A型抗原抗体，也没有抗B型抗原抗体。分离血清时将采集的血液注入试管中，待血液凝固后离心分离血清。可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固，减少凝固时间。离心可在2500～3000rpm，10min，足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可。分离血清的量可按采集血液的50%左右计算，因为红细胞占总血液的50%左右。当然整个过程要注意无菌操作。十

二、PC12细胞培养所用血清问题。

问：我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞，需要灭活的马血清，可现在买血清很困难，好像是海关有封锁，代理商这么说的，我原定购买的Gibco的horse surum，现在无法买到了，好容易找到一个目前可以进血清的公司Hyclone，有一种Donor Equine serum是马血清吗?

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是这个。我当时是在鼎国(重庆办事处)买的，100ml大概140元，具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜。另外：我买了以后灭活的。十

三、血清或培养基产生了颜色或沉淀的问题：

1、问：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分钟灭活后出现了白色少量絮状沉淀，是不是污染?还能不能再用?血清的生产日期是2006年7月(现在是2007年6月11日)。

答：应该问题不大。你可以取少量血清放入培养皿中，37℃过夜培养看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

2、问：我用MTT法测细胞的增殖，用DMSO裂解细胞，发现把DMSO加入到孔中就会形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培养基，由于没有离板子的离心机，所以没有去除培养基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培养基没有看到有这种情况。该怎么解决?

答：为什么要用离心机离心呢?难倒你养的是悬浮细胞吗?如果是贴壁细胞的话直接将MTT倒掉，再加DMSO即可，我们就是这么做的，效果很好!并且测细胞的增殖的话如果不去掉MTT就加DMSO的话误差应该很大!有时不一定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的时间或以及其他成分有关!

3、问：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解冻后没有混匀直接分装，结果使得前面的几管是清亮的，后面就带有棕色的，不知有没有影响?估计有什么影响?前面的成分好还是棕色的成分好啊?

答：肯定有。最好还是重新混合重新分装，我觉得有效成分会集中在棕颜色部分。

问：(2)为什么会出现棕色呢?

答：血清中的棕色多一些可能是因为红蛋白的含量高些的缘故吧。问：(3)血清灭活之后可以存放吗?我的是前天灭活的，但是没有加到培养基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用吗?还是再次灭活啊? 答：当然可以，如果多的话，分装后最好放在-20℃，下次用时再解冻，也不用再灭活。最好用一管拿一管，少许血清可以放在4℃。分装时还要注意不要装得太满，以免溢出污染。

十四、问：悬浮细胞培养时能否加血清?如果加了会有什么结果?为什么悬浮细胞培养时就不能加血清?

答：血清是细胞培养基中重要的培养成份之一，对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时，我们通常会加入10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。一般说来，牛血清包括以下成分：生长因子(如激素，白细胞介素等)，他们可以促进细胞生长;贴附因子，他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培养的细胞除外);蛋白质(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作为营养物质，又可以中止胰酶的作用;还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。因此，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，血清是必不可少的。除非因实验要求无血清培养时，例如：为使细胞同步化时，我们会采用无血清培养的。单纯的说悬浮细胞培养不能加血清就没有太多的道理了。十

五、Gibico的胎牛血清内是否含糖?

问：我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖对我实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问，回答我糖浓度少于5μg/ml，因此基本可认为是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科，结果却是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。难道是检测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗?(另起茶水验尿事件?)检验科没有给我回答。答：应该是不含糖的。请参照gibco的网站：http:///content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差，我想可能是样本不一样，需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

十六、关于中和消化液需要的血清量。

问：用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和。具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少?

答：做了很久的试验，真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来，这个应该也没有固定的比值。血清的品种都是不同的，成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系?我们消化细胞的时候，如果是传代，细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培，这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养，我一般都使用全培进行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2，一般我养细胞的时候，会用国产的比较便宜的血清配制全培，专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧，再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉，血清便宜，离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点，仅供参考。

十七、血清中的悬浮物问题。

1、问：发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点，培养液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以为是胶原虫。本打算换液，换液前特意看了下前些天配的培养液，肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多)，于是放在镜下观察，新鲜培养液中有一些悬浮的小颗粒，不多。(培养液是R1640+20%牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的小牛血清拿出观察，肉眼可见

5、6个白色小小球状的物质，在血清瓶稍靠下的部位悬浮。镜下观察，也有少量的不知什么物质的东西漂浮。小牛血清是Hyclone新西兰的，标签上写已经经过2μm滤膜过滤处理。根据上述培养液的情况，是否说明培养液已被污染?如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物，哪怕是极少量的?根据上述血清的描述，是不是说明血清也存在问题，还能用吗?补充：细胞培养以来生长状态就不好。买血清的时候厂家说明不用灭活，所以未灭活。

答：(1)血清应该-20℃保存，解冻血清时，请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物。 (2)血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白在血清解冻后，也会存在于血清中，亦可造成沉淀物。 (3)若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清，再放回冷冻，若存放于4℃时，请勿超过一个月，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(5)排出了血清的原因，在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见，如果细胞死的太多，影响较大建议更换培养液。

2、问：今天在配培养液时，发现血清里面有小碎片样的漂浮物，血清仍然清亮，不浑浊。不知道是什么，问了实验室的学长，说仍然可以用，但还是不放心，没有用血清。求助园子的各位达人，这可能是血清出了什么问题?我的血清用了一个月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培养液配置时Votex不够，当时是清亮的，但过一段时间会析出来;(2)真菌污染。十

八、污染和过滤的问题。

1、问：怀疑血清染菌，想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤?对血清性质有多大影响?有做过的么?

答：可以过滤的，血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌。想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦，只要放置于37℃过夜就可以了，如果有微生物污染会变浑浊的，如果还是澄清的就说明没有问题的。实验室中血清很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤，一般而言如果制备1-2瓶培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清。如果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中，使用0.22微米的大滤膜一起过滤。

2、问：我怀疑我用的完全1640培养液被污染了，准备重新过滤消毒，过滤后是否需要补充胎牛血清?如需又如何补充?

答：完全1640培养液被污染了，如果是支原体的话，过滤没有作用，支原体可以通过滤膜。我们用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分装100-200ml，现用现配因为血清比1640要贵，如果你想过滤的话，建议你加原比例血清，因为血清不会很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因。

3、问：加好了血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗? 答：建议不要用了。在加了双抗的情况下已经污染，那么细菌污染的可能性会较小了。一般的过滤除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问：我准备把使用的完全1640培养液重新过滤一遍，不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜，过滤后是否还需要补充胎牛血清?如需又如何补充?

答：可以透过，但是随着液体量的增多会很慢，如果不加压会比较麻烦，还有最好用低蛋白吸附的，不然损失是比较大的。十

九、更换无血清培养基后细胞大量死亡的问题。

问：我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞，在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的，转染效率也可以接受。但是寒假一回来就发生了怪事：细胞在有血清的培养基中长的好好的，一换无血清的培养基就死亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来。但是原来我换无血清培养基，就算放那里10个小时都是没问题的啊。已经换了不同批次的培养基，甚至吸管什么的都换过了，但是就是不行，是怎么回事?

答：(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺，或者重新配液，转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境，建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂质体的毒性很大，如果有质粒参与对细胞损伤更大，如果Lipofectamine2000在常温放置过，对细胞更大，假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度，湿度。二

十、完全培养液的相关定义。

问：“完全培养液一词”，是指加了血清的培养液吗?我在做含药血清的实验，涉及到血清添加量的问题。所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答：原液是指配置后过滤除菌。不完全培养液是指不含有血清的原液，其他成分已补充。完全培养液是指不完全培养液加入血清后称完全培养液。二十

一、血清相关知识总结。使用胎牛血清的注意事项：

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里常会遇到的问题，仅供大家参考：

1、保存血清最好的方法：建议血清应保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损：

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、何谓热灭活：

一般是以 56℃ ， 30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有 : 溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于胎牛血清的灭活：有必要做热灭活吗? 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量!

6、血清相关知识：如何避免沉淀物的产生?

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作 : (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。 (2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 (4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

第三篇：动物细胞培养、计数、冷冻和复苏

实验报告

由于本次实验分三天进行，日期分别为10月31日(周一)、11月2日(周三)、11月4日(周五)，实验内容分别为动物细胞培养、结束，动物细胞冷冻以及最后的动物细胞的复苏，又因为冷冻和复苏可视为连续环节，故本报告分成两个部分来记录本次实验，具体内容如下：

I. 动物细胞的培养和计数

一、实验目的

由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。

本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项;用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。

二、基本原理

动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。

体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10-50代左右即退化死亡;由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。

体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。

动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血清;对于培养环境的适应性也比微生物差，其对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培养过程中一般需严格监控;动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长，它们对环境的影响又比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节pH。

动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病毒或细胞均可导致动物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境都有可能含有污染物。因为动

物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随时取样进行细胞计数。最简单、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。计数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为1.0mm2，点样后其厚度为0.1mm，这样每个方格的体积即为1.0×10-4ml，细胞数的计算公式为：

四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。

细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整，细胞被染上蓝色，存活率为：活细胞数÷总细胞数×100%。

三、仪器、材料和试剂

1. 超净工作台

2. 倒置显微镜

3. 二氧化碳培养箱：设定二氧化碳浓度为5%。

4. 培养基：DMEM培养基，除菌过滤;自制无血清培养基，0.22μm滤膜除

菌过滤。

5. 血清：Hyclone新生小牛血清。

6. PBS缓冲液，0.22μm滤膜除菌过滤。

7. 胰酶：溶于PBS缓冲液，浓度0.25%，0.22μm滤膜除菌过滤。

8. 玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121℃湿热灭菌，30分钟。

9. 血球计数板

10. 移液枪

11. 台盼蓝染色液：0.4克台盼蓝溶于100ml PBS缓冲液，过滤待用。

四、实验步骤

1. 贴附型细胞传代培养

(1) 倒掉将要传代的细胞培养瓶中的培养基;

(2) 用10ml无菌PBS洗涤，倒掉;

(3) 加入2ml胰酶溶液(0.25%)，进行消化;

(4) 显微镜下观察，直至所有细胞由铺展状态收缩为圆球形;

(5) 倒掉胰酶;

(6) 按稀释要求加入新鲜培养基，吹打分散，分装入玻璃方瓶，置于二氧化碳培养

箱。

2. 悬浮细胞传代培养

按贴附型细胞传代培养步骤(6)操作即可。

3. 细胞计数

(1) 将干净的盖玻片覆盖在血球计数板正中央，压紧使它们之间不留空隙;

(2) 待计数样品如果需要，用PBS进行稀释;

(3) 取0.5ml稀释后的样品，加入0.5ml台盼蓝染色液(0.4%)，用滴管轻轻吹打混

合;

(4) 用滴管将细胞悬浮液沿盖玻片两侧缓缓滴入血球计数板的两个平台上，直至平

台上完全充满细胞悬浮液，

(5) 显微镜下计数，并按上述公式计算细胞密度;

五、实验结果

通过倒置显微镜的观察计数，得出的结果是，在平台1上四个大方格得到的活细胞总数为206个，死细胞总数为0个，在平台2上四个大方格得到的活细胞总数为210个，死细胞总数为1个。

根据细胞数的计算公式：

四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。

可得到细胞总数为：

平台1:(206+0)×1×104÷4=5.15×105 细胞数/mL

平台2:(210+1)×1×104÷4=5.275×105 细胞数/mL

所以平台1上活细胞比率即细胞存活率为100%，平台2上活细胞比率即细胞存活率为1÷211=0.474%

六、讨论与分析

本次实验根据老师提供的讲义可明显发现几处需要注意的地方：

1.胰酶消化的程度必须掌握好，消化不足则细胞结团，无法分散，这将严重影响传代后细胞的生长，消化过量则会使细胞严重受损;

2.在将细胞悬浮液滴加到血球计数板上时注意不能过量以至于细胞悬浮液溢出平台，同时不能出现气泡;

3.对于稀释比例，应掌握在每个大方格内含25-50个细胞为合适;

4.对于每个大方格中刚好压在边线上的细胞，应当只计入两条边线上的细胞而忽略另两条边线上的细胞，例如将上侧和左侧边线上的细胞计入，那么下边和右边边线上的细胞则不能计入，不论细胞是大半在方格内还是小半在方格内。

稀释实验时，存在不少问题，老师也在事后指出了，因为是垂直式超净工作台，所以在其中进行实验时，要时刻注意需要保持无菌的试剂瓶瓶口位置，不能有遮住瓶口的操作，否则就会有导致染菌的危险，另外，从注意事项2也同时可看出事先没有做好量的粗略估计也可能在实验过程当中造成意外的失误。

计数实验时可能由于对倒置显微镜不太熟练的原因，在计数上花费了不少的时间，这需要在以后的操作实验中不断练习，也同时可能是因为这个原因，计数可能存在一定的偏差，这也必须在今后的实验中注意。另外，从注意事项1和4中，可以看出消化的程度还有计数的方法都将影响到最后的实验结果与准确性，消化的程度更会直接影响细胞的存活率。

II.细胞的冷冻和复苏

一、实验目的

细胞在体外长期传代中并不是稳定不变的，它们常常会发生各种变异，表现在形态、生长特性、细胞的结构甚至细胞核型也会发生变异，这些变异往往会导致目标产物的丢失，细胞功能的丧失以及生物安全性方面的问题。因此，在构建好细胞株后需要建立一个细胞库，用低温冷冻的方法将细胞保存起来，以便随时有新鲜的细胞可供使用，确保研究或生产所用的细胞在一定的时间内具有结构和功能的稳定性和一致性。

本实验的目的是让学生学习和了解细胞冻存、复苏的目的和基本操作方法。

二、基本原理

在动物细胞的组成成分中90%以上是水，而水在冷冻过程中会形成冰晶，由于动物细胞没有细胞壁，冰晶会使细胞膜发生破裂而导致细胞死亡，因此要维持冷冻和复苏过程中细胞的存活率，必须在冷冻液中加入冷冻保护剂。常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜(DMSO)和甘油，其中二甲基亚砜因为其对细胞具有良好的保护性和较低的毒副作用二成为首选。

在冷冻和复苏过程中影响细胞存活率的因素主要是保护剂浓度和温度下降速率，实际操作中二甲基亚砜的浓度通常为5-10%，一般来说，冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成;在复苏过程中对细胞产生伤害的原因主要是解冻过程所形成的局部渗透压波动，通常采用的方法是快速解冻。

三、仪器、材料和试剂

1. 程序降温仪

2. 超净工作台

3. 离心机

4. 液氮罐

5. 冻存液：10%DMSO+10%小牛血清+80%培养液

6. 冻存管(无菌)

7. 离心管

8. 细胞培养操作用具包括方瓶、移液管、培养基等，无菌。

四、实验步骤

1. 冷冻过程

(1) 准备好分散良好的细胞悬浮液并用台盼蓝染色计数;

(2) 离心并将细胞重新悬浮在冻存液中，使细胞密度达到6×106活细胞/ml;

(3) 将细胞分装在冻存管中，每支1ml，旋紧冻存管盖子;

(4) 静置30分钟，使冻存液和细胞内的DMSO浓度达到平衡;

(5) 将冻存管置于程序降温仪内，设置降温速率1℃/min，-40℃后5℃/min，降温至-

100℃停止;

(6) 将冻存管置于液氮罐(-196℃)，长期保存。

2. 复苏过程

(1) 准备好玻璃方瓶、移液管、离心管等(无菌)，新鲜培养基;

(2) 将冻存管从液氮罐中取出，立即置于40℃水浴中，直至冻存管内细胞悬浮液完全融

解，此过程约1-2分钟;

(3) 在超净工作台内将冻存管内细胞悬浮液移至离心管，加入10ml新鲜培养基，离心

(5min，1500rpm);

倒掉上清液，将细胞重新悬浮于10ml新鲜培养基中，移至玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。

五、实验讨论

因为冷冻和复苏的实验没有相关需要记录的数据，所以本部分跳过了实验结果这一节，直接进行讨论。这两次实验的注意事项为：

1. 涉及和液氮相关的操作，应戴好防护手套以防冻伤;

2. 冻存管盖子必须旋紧，否则液氮容易渗入冻存管内，这样不仅可能导致污染，而且

将严重损伤细胞。

可能由于老师考虑到实验过程中的危险性，并没有让我们进行有关于液氮的实验操作步骤，但这两项注意还是值得我思考和借鉴的。这两次实验的重点是冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成;在复苏过程中采用快速解冻，减少解冻过程所形成的局部渗透压波动对细胞产生伤害。如不注意这两点，会对细胞冻存和复苏后细胞的存活率带来影响。

其实这两次实验的主要内容基本都与垂直超净工作台有关，个人认为老师的用意也是在此，让我们了解实验室中动物细胞不论用在何处，无菌首先是第一位的，因为要考虑到动物细胞的生长周期较长，所以保持无菌操作的必要性就变得尤为重要。

最后，感谢老师提供的讲义，让我们省下不少寻找资料和预习实验的时间，也同时感谢老师一个星期的指导。

第四篇：细胞培养在分子生物学中的应用

随着社会的进步，科学的发展，生物技术已经得到了很大的改进，下面我就从心肌细胞培养，植物体细胞培养再生技术体系，马立克氏病病毒分子生物学诊断技术研究，三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究，细菌与放线菌的16S rDNA、真菌26S rDNA D1/D2区及ITS区的分子鉴定体系，载体构建技术体系及其基因靶点的定点诱变和靶序列缺失、改造技术体系6个方面来研究细胞培养在分子生物学中的应用，以阐述细胞培养的重要性。

1.心肌细胞培养

培养心肌细胞能提供单个细胞的同源集落，在记录腔内可视并容易控制。培养方便，定量、重复性好，均一性不受神经体液因素，在分子生物学技术研究成熟心肌细胞(如Ikur分子基础的研究中应用广泛;

心肌细胞位于心肌内膜内。一般认为，正常成年心脏的心肌细胞不再分裂。因此，心肌细胞最初多采用动物或人的胚胎心脏以及刚出生动物的心脏，如乳鼠以及其他刚出生动物的心脏或动物、人的胚胎心脏，这就是ECM。但ECM与ACM相比，在功能和结构上均有差异：ECM用途存在一定的局限性，ACM更适宜做电生理和细胞膜离子通道的研究单个因素干预实验方面更具有代表性

[3-5]

[1,2]

;ACM在进行

。

2.植物体细胞培养再生技术体系

棉花是重要的经济作物之一，棉花生产对于我国棉农收入和国民经济的发展具有重要的意义。随着基因工程和分子生物学的发展，转基因技术正广泛地应用于现代植物育种中。然而，建立高效而稳定的植物体细胞培养再生技术体系是植物遗传转化和植物基因工程的基础。此外，棉属野生种中具有陆地棉栽培种所缺少的许多优良性状，通过棉种间的体细胞杂交技术获取种间杂种转育野生棉的优良性状是一条行之有效的技术途径，而建立一套适合这些野生棉种的体细胞胚胎发生和植株再生体系是体细胞杂交创造种间杂种的基础和先决条件。本研究在前人工作的基础上，以四倍体野生棉种毛棉(G.tomentosum Nutt& Seem)为材料，四倍体陆地棉(G.hirsutum L.)珂字棉201为对照，研究野生棉种毛棉体细胞培养过程中的影响因素，以建立适合于四倍体野生棉的体细胞培养体系。

[6]3.马立克氏病病毒分子生物学诊断技术研究

通过与SDS-蛋白酶K法、高纯度PCR模板提取试剂盒(宝灵曼公司产品)、NP<,40>-蛋白酶K法比较,研究小组建立了用TLS(三乙醇胺月桂酸硫酸盐)代替传统的SDS-蛋白酶K提取DNA的方法,对细胞培养物、血液样品提取DNA,经琼脂糖凝胶电泳、PCR检测,结果表明,TLS法是一种快速、简便的提取高质量DNA的方法.利用地高辛标记马立克病病毒(MDV)GA株BamHI-L及其六个亚片段制备核酸探针,与MDV1型(京-

1、MD<,11/75c)、MDV2型(SB-1)、MDV3型(Fc-126)的核酸进行分子杂交,结果表明L片段是MDV1病毒特异的,与MDV

2、MDV3的核酸无同源性,这与Ono等(1992)的报道:在非严格杂交条件下,MDV2 BamHI-F片段与MDV BamHI-L片段有同源性的结论不同.根据BamHI-L片段的核酸序列设计了针对pstI亚片段的寡核苷酸引物,建立了用0.3U Taq酶的10μl反应体系的微量PCR方法,通过对病毒感染细胞培养物DNA和京-1株接种鸡血液DNA的扩增,结果表明,该引物介导的微量PCR是MDV1特异的,MDV2(SB-1)、MDV3(Fc-126)及正常细胞DNA都没有任何扩增产物.敏感性试验表明微量PCR能从0.1pg京-1株感染细胞DNA中检测到MDV DNA,早期感染样品检测结果表明,微量PCR能从京-1株接种鸡的血液中于第5天检出MDV DNA.PCR产物的RFLP结构表明:京-1株和MD<,11/75c>株的产物在 BgII、TaqI、xbaI酶切位点上没有变化.

4.三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究

三羟异黄酮对肝癌的抑制作用研究,通过细胞培养发现其可诱导肝癌细胞凋亡。通过体外细胞培养和分子生物学技术,检测人肝癌细胞SMMC-7721凋亡过程中相关蛋白基因的表达,可以探讨三羟异黄酮诱导肝癌细胞凋亡的分子机制. 方法:应用体外人肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养技术,采用MTT法观察三羟异黄酮对肝癌细胞的增殖抑制作用,选择合适的实验剂量.HE染色观察凋亡细胞的形态学表现,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA Ladder.采用细胞免疫组化检测三羟异黄酮诱导人肝癌细胞凋亡过程中相关蛋白p

53、Caspase-

3、Survivin的表达,采用RT-PCR法检测Caspase-

3、Survivin在基因水平的表达。

[7]5.细菌与放线菌的16S rDNA、真菌26S rDNA D1/D2区及ITS区的分子鉴定体系

细菌(包含放线菌)基因组有5S、16S和23S三种rDNA.16S rDNA大小在1500bp左右，其所代表的信息量适中，是进行分类研究的理想靶位。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rDNA把序列，并进行后续的DNA测序，与Genbank中已知序列进行同源性比较后判定细菌种类，可将细菌划分到属或种。真菌基因组中编码核糖体RNA的基因为26S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。利用rDNA的保守序列设计引物，对未知真菌的26S rDNA D1/D2区域序列或ITS区进行PCR扩增，测序后与Genbank中已知序列进行同源性比较，可将真菌划分到属或种。我公司具备完整的细菌和真菌分子鉴定成熟方案和技术操作体系，已顺利完成近万株海洋细菌与放线菌、霉菌、酵母和来源于土壤的微生物、植株体内生菌的分子鉴定工作。

6.载体构建技术体系及其基因靶点的定点诱变和靶序列缺失、改造技术体系

载体是外源基因导入宿主菌的必需媒介。依据目的基因的来源，灵活选择不同的克隆方法，包括从基因组中分离目的基因，由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行克隆和PCR体外扩增目的片段进行克隆等。同时，根据需要对特定的基因靶点进行定点诱变和靶序列缺失、改造。

【参考文献】

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hypertrophic

grouth

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