鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及生物学特性研究

鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及生物学特性研究（精选3篇）

篇1：鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及生物学特性研究

新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性

采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法获取新生猪骨骼肌卫星细胞,并进行体外原代和传代培养.观察细胞各个阶段的形态,通过生长曲线等手段研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用RT-PCR以及免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果显示两步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取.在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基下,细胞分化良好,可融合成肌管.本研究探讨了猪骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的`方法及其生物学特性,为建立猪骨骼肌卫星细胞系打下了一定的基础.

作 者：何波 郑嵘 熊远著 胡春艳 HE Bo ZHENG Rong XIONG Yuan-zhu HU Chun-yan 作者单位：华中农业大学,农业部猪遗传育种重点实验室,武汉,430070刊 名：畜牧兽医学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA年，卷(期)：37(6)分类号：S828.2关键词：猪 骨骼肌卫星细胞 培养 鉴定 两步消化

篇2：鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及生物学特性研究

目的:探讨人脑胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤干细胞的`培养方法,观察其体外增殖、分化等生物学特性.方法:应用改良神经干细胞培养基,11例人脑GBM标本中悬浮培养GBM的肿瘤细胞.采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞.通过免疫组化及电镜观察的方法,确定其干细胞特征;通过核型分析探讨该细胞的肿瘤性质;将确定的脑肿瘤干细胞(BTSCs)接种于不含生长因子的干细胞培养基,观察其在体外条件下分化的特点.结果:本组样本中10例(1例污染)获得具有连续克隆和增殖能力及干细胞特征的肿瘤细胞.结论:人脑GBM中存在具有自我更新和增殖潜能的BTSCs,在体外可将其分离、培养和纯化.

作 者：车晓明 崔大明 汪洋 施炜 刘天津 王柯 CHE Xiao-Ming CUI Da-Ming WANG Yang SHI Wei LIU Tian-Jing WANG Ke  作者单位：车晓明,崔大明,施炜,王柯,CHE Xiao-Ming,CUI Da-Ming,SHI Wei,WANG Ke(复旦大学附属华山医院神经外科,40)

汪洋,WANG Yang(复旦大学上海医学院解剖组胚学系,200032)

刘天津,LIU Tian-Jing(中国科学院细胞所,200032)

刊 名：中国临床神经科学  ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CLINICAL NEUROSCIENCES 年，卷(期)： 15(6) 分类号：Q189 R741 关键词：胶质母细胞瘤   脑肿瘤干细胞   神经干细胞   悬浮培养   无血清培养基  

篇3：鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及生物学特性研究

【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定

【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是来源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。

1.2 主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000 r/ min ，4 ℃，离心 5 min ，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。

1.4 兔 BMSCs 培养：1.4.1 原代 BMSCs 培养 向分离得到的细胞组织悬液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 L-DMEM 培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37 ℃，体积分数为 5 %的 CO2孵箱中培养。培养 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培养基换液。原代培养 5-7 天后，细胞融合可达 80 %以上。将原代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。

1.4.2 传代 BMSCs 培养 待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS 终止消化后将细胞悬液以 1:3 比例接种于新培养瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培养基 5ml 培养，每隔 2 天换液，约 3-4 天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鉴定

对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重悬，PBS 洗涤细胞 3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀释 1:100） 为一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗涤细胞 3 次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。

2 讨论

BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的贴壁性： 在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。

2.2 培养基最佳的酸碱度： 培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。

2.3 传代的注意事项

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数 ：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓间充质干细胞特异性标志物： 虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。

综上所述，对 BMSCs 的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的 BMSCs 的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔 BMSCs 的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。

參考文献

［1］ 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243

［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 陈建梅姚荣伟 李勇 张馥敏 江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308