肺泡Ⅱ型上皮细胞分离培养研究进展

2023-02-26

肺泡是肺气体交换的基本单位。构成肺泡上皮的有3种细胞:肺泡Ⅰ (ATⅠ) 、Ⅱ (ATⅡ) 和少量Ⅲ (ATⅢ) 型细胞。其中ATⅡ能合成和分泌表面活性物质, 通过离子转运维持肺泡内外液体平衡, 并具有肺泡上皮干细胞的功能, 可分化为ATⅠ细胞。近年来发现, ATⅡ参与肺部免疫调节[1], 产生趋化因子MCP-1, 增强免疫功能。ATⅡ细胞的离体培养对研究肺生理病理以及肺病防治有重要意义。

1 肺泡Ⅱ型细胞的分离

一般采用以下方法: (1) 动物麻醉后肺动脉灌注去除血细胞, 气管灌洗去除肺泡巨噬细胞 (肺内灌注琼脂糖溶液, 可去除Clara细胞[1]。然后气管灌注酶液消化, 剪碎肺组织, 获得含有ATⅡ的悬液。 (2) 取下动物肺直接用缓冲液冲洗血细胞, 肺组织剪碎后酶消化, 得到含有ATⅡ的悬液。此法得到悬液中杂细胞较多。因酶会破坏细胞使其释放DNA物质, 易形成细胞团块, 消化液中加入适量DNaseⅠ, 可防止出现此现象。

消化细胞常用酶有3种:胰酶、胶原酶和弹性蛋白酶。胰酶是最早、最广泛应用于AT2Ⅱ分离的, 其消化效果主要与p H、温度、酶浓度及组织块的大小等因素有关。常用浓度为0.1%~0.5%, p H值8.0左右, 温度约37℃。酶的浓度越高, 消化时间越长, 分离效果越好, 但对细胞的损伤越大。胰酶可能改变细胞功能和代谢等方面的特征。如果将胰酶和EDTA (0.02%) 合用, 可在增强消化作用的同时减少细胞死亡数目。胶原酶仅对间质细胞有消化作用, 对上皮细胞影响不大, 一般将胰酶和胶原酶联合使用可获得较好效果。弹性蛋白酶可选择性地使肺泡上皮与基底膜脱落, 对细胞伤害较小且产量较高, 但是其价格昂贵, 活性不稳定, 有效作用时间短易降解。最近有学者使用Dispase酶分离AT2Ⅱ也获得成功, 此酶不易与细胞表面的蛋白质相互作用, 可保持细胞表面特性的完整性[2]。

2 ATⅡ的纯化

肺组织经酶消化后, 细胞悬液中混合有多种细胞, 常采用以下特殊方法纯化。 (1) 免疫吸附法。肺泡的巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞的细胞膜表面含有Ig G Fc受体, 它可与Ig G牢固结合, 而不含Fc受体的细胞则不能结合。此法可获得较高纯度细胞, 但较难清除ATⅠ和支气管上皮细胞。 (2) 免疫磁珠法。每种细胞表面都有特异性抗原, 以此与其他细胞进行区分。把相应的抗体连接到磁珠上, 和细胞一起培养, 根据抗原和抗体结合的特点, 带有抗体的磁珠就结合到相应的细胞上, 再用磁性分离器将和磁珠结合的细胞去除。 (3) 贴壁选择法。根据不同类型细胞贴壁时间不同的特点, 将细胞悬液培养一定时间, 可除去成纤维细胞和巨噬细胞。 (4) 密度梯度离心法。根据细胞沉降系数有差异, 在密度梯度离心中所处位置不同来分离细胞。常用分离液有聚蔗糖、白蛋白、泛影葡胺、Percoll等。为增加细胞的产量和纯度, 在离心前可让巨噬细胞和淋巴细胞吞噬一些较重或较轻的颗粒, 比如碳粒、胶体硫酸钡颗粒、碳氟化合物等, 以增加它们和ATⅡ之间的密度差异。 (5) 滤膜分离法。根据细胞的大小不同, 采取不同孔径的滤网来分离细胞。纯化ATⅡ可先用100um的尼龙网过滤, 再用4层厚的15um的尼龙网过滤, 有时为了更好的去除ATⅠ, 会在15um滤网的下面加一层10um的滤网。 (6) 流式细胞仪分离法。上皮细胞内含有丰富的脂类物质, 根据不同细胞之间的荧光差异, 用亲脂性荧光素标记筛选[3]。此法获得细胞纯度较高, 但产量和细胞活力较低, 较贵且耗时间。

3 ATⅡ的培养基及培养条件

培养ATⅡ细胞多选择DMEM培养基, 添加抗生素、谷氨酰胺、10%小牛血清。一般细胞的接种密度为 (1~3) ×106个/m L。在CO2恒温培养箱中培养, 温度37℃, CO2浓度5%, 时间以18~72h为好。如培养时间过长, ATⅡ的形态功能会发生变化, 失去其原有特性。

ATⅡ分离纯化目前灌注法分离细胞的应用最为广泛, 弹性蛋白酶和Dispase以其效率高、对细胞无损伤的特点被认为是分离ATⅡ细胞的首选。纯化方面免疫方法的发展非常迅速, 例如用大鼠Ig G选择吸附法, 用带有特异性抗体的磁珠与细胞共孵育即免疫磁珠法纯化细胞, 对细胞无损伤作用, 得到的细胞纯度较高, 因此其应用前景更加广阔。

摘要：综合介绍肺泡Ⅱ型细胞分离纯化和培养的不同方法及其优缺点、相关实验条件的和注意事项。

关键词：肺泡上皮细胞,分离纯化,灌注,免疫磁珠