兔骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定

骨髓基质干细胞 (Marrow stromal cells, MSC) 是在骨髓中存在的一类具有多向分化潜能的细胞总称, 可以向成骨系细胞、成软骨系细胞、成纤维系细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等转化[1], 因其取材方便、损伤小、体外繁殖能力强的特点, 已成为组织工程种子细胞的首选[2]。本实验目的在于建立兔MSC的体外培养体系, 观察MSC的形态和生长情况, 检测其表面标志, 为以MSC为基础的骨组织工程提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

新西兰大白兔 (福建医科大学大学动物中心) ;DMEM培养基 (Gibco公司) ;胎牛血清 (Hyclon公司) ;0.25%胰酶加EDTA (Gibco公司) ;Percoll分离液 (Sigma公司) ;超净工作台 (DCM-1300, 苏州) ;自动台式离心机 (LD25-2, 北京) ;CO2孵箱 (Thermo forma 311, 美国) ;倒置显微镜 (Olympus) ;透射电镜 (HU-12A, 日立公司) ;细胞培养板、培养瓶 (Sigma公司) ;荧光标记CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC单克隆抗体 (美国PharMingen公司) ;流式细胞仪 (Beckman counter Epics XL, 美国BD公司) 。

1.2 方法

1.2.1 兔MSC的原代培养

新西兰大白兔 (福建医科大学动物实验中心提供) , 6周龄, 体重约1.5kg, 雌雄不限。3%戊巴比妥钠静脉麻醉, 于无菌条件下在双侧坐骨棘处用18号骨髓穿刺针接5m L注射器, 内含肝素钠0.2mL (100U/mL) , 各抽吸骨髓液2mL, 抽吸完毕迅速将注射器内液体均匀混合, 注入培养皿, 用1m L注射器反复吹打培养皿中的骨髓液约5min, 置入离心管, 1000r/min离心10min, 弃去脂肪和上清, 用PBS重悬制成细胞悬液, 小心加入至2倍体积1.073g/m L的Percoll分离液上层, 室温下以2000r/min离心25min。收集中间乳白色的有核细胞层, 再用PBS洗涤2次, 加入适量的含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液, 置于离心管中, 1000 r/min离心15min。弃上清液, 加入3mL含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液, 反复吹打, 稀释成细胞悬液, 以1.0×104/cm2接种于50cm2培养瓶中。于37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中培养, 3d后首次半量换液, 将未贴壁的细胞全部弃掉, 以后每2~3d全量换液1次。

1.2.2 兔MSC的传代

在原代培养的细胞接近铺满培养瓶底时, 用0.25%胰蛋白酶消化, 倒置显微镜观察, 待50%细胞变为圆形时, 将胰酶倒掉, 加入含20%胎牛血清的DMEM培养液中止消化, 再以1×104/cm2传代培养。

1.2.3 细胞形态观察

每天在倒置相差显微镜下观察MSC原代和传代细胞的生长情况及形态特征, 并适时拍照。

1.2.4 细胞超微结构观察

细胞在培养皿中增殖满单层后, 0.25%胰蛋白酶消化, 移入离心管, 1000r/min离心5min, 洗涤细胞2次, 末次离心后弃上清, 取样行透射电镜观察。

1.2.5 流式细胞仪检测兔MSC的表面标志

取第3代MSC用PBS重新悬浮后, 调整细胞浓度1×106/cm2, 取100μL细胞悬液与CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC单抗室温避光孵育30min后, 用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 MSC的生长情况及形态学特点

骨髓细胞经密度梯度离心后, 接种于50cm2的培养瓶, 倒置显微镜下观察培养液中存在大量大小不一的圆形细胞;24h后可见多数贴壁的圆形细胞中散在有少数多角形或短梭形细胞, 有数个突起类似成纤维细胞;3~4d后梭形细胞和多角形细胞显著增多;5~6d后形成细胞集落方式生长, 数量明显增多, 呈现长梭形、纺锤形, 细胞轮廓清晰, 排列较紧密;7~9d后, 细胞的生长明显加速, 逐步形成大小不一、分散的细胞集落, 呈放射状向四周扩展, 细胞呈漩涡状或平行排列 (图1) ;第10~12天, 贴壁单层生长的细胞铺满整个培养瓶底, 放射状或漩涡状生长方式更趋明显, 非贴壁细胞通过换液己逐渐被清除, 基本完成原代单层生长。传代细胞的细胞贴壁时间和增殖速度比原代培养要快, 大约2h开始贴壁, 培养约8~11d互相接触形成单层。传代细胞分裂相多见, 胞体大, 细胞边界不清楚, 胞浆内颗粒多, 显示细胞功能活跃, 处于活跃的基质合成状态。传代至第10代后, 细胞增殖速度减慢, 细胞形态出现多样性, 逐渐呈老化现象。

2.2 MSC透射电镜观察

透射电镜示:细胞胞体较大, 表面有微绒毛, 核大而不规则, 核内以常染色质为主, 核仁可见, 部分细胞内有多个核仁。胞浆内见中等量线粒体, 其体积较小, 密度较高, 可见中等量粗面内质网、部分粗面内质网束状扩张, 可见少量高尔基复合体, 有些细胞内可见较多次级溶酶体, 细胞间未见连接 (图2) 。

2.3 MSC的表面抗原鉴定

经流式细胞仪检测第3代细胞样本 (图3) , CD34、CD45、CD29、CD90分别为0.79%、0.18%、96.8%、84.2%。CD34、CD45基本不表达, 证实这些细胞是非造血干细胞;CD29、CD90表达阳性, 表明分离的细胞具有MSC的特征。

(1) CD34检测为阴性; (2) CD45检测为阴性; (3) CD29检测为阳性; (4) CD90检测为阳性。

3 讨论

MSC是一种存在于骨髓的非造血干细胞, 骨髓中绝大多数是造血干细胞, MSC的数量较少, 一般认为MSC只占骨髓有核细胞的1/104~1/105[3~4], 为了得到组织工程学需要的单一细胞, 人们尝试用各种方法分离、纯化MSC。目前用于分离MSC的方法主要有贴壁筛选法和密度梯度离心法[5]。贴壁筛选法是根据MSC贴壁生长, 而造血系细胞等因无法贴壁, 则随培养液的更换而被清除[6]。但是, 由此获得的MSC纯度不高, 混合有较多的杂细胞, 比如成纤维细胞、脂肪前体细胞等, 所以体外培养特性不稳定[7]。密度梯度离心法是利用MSC与骨髓中其他细胞的密度不同, 用特定密度的淋巴细胞分离液将MSC分离出来。这种方法应用梯度离心分离细胞, 骨髓中的细胞按密度差别得以分离, 所以可快速获得大量的高纯度细胞[8]。本实验用密度梯度离心法来分离培养MSC取得较好的效果。

目前尚没有十分理想的方法来鉴定MSC, 主要通过细胞形态学特征如呈纺锤形、贴壁、成集落生长以及作为干细胞多分化潜能的确定 (在不同的条件下, 向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等分化的特性) 来证明其干细胞的属性。我们分离培养的MSC从显微镜下观察, 90%以上为梭形或呈纺锤形的细胞;电镜观察, 细胞表面有微绒毛结构, 细胞核大, 核浆比例较正常细胞大, 胞浆内细胞器以线粒体、内质网、溶酶体为主, 说明细胞蛋白合成和分泌能力旺盛, 能够大量摄取营养物质, 功能活跃, 显示了干细胞的幼稚特性, 与成纤维细胞和血细胞等明显不同, 这和文献相一致[9]。Pittenger等[10]认为, MSC细胞体积小, 核浆比大, 不表达分化相关标志如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶和osteopontin;在细胞贴壁附着后则细胞均一致地表达SH2, SH3CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124等多种表面蛋白。MSC缺乏造血干细胞标记, 不表达造血细胞抗原, 如造血前提细胞标志抗原CD34, 白细胞标志抗原CD45, 淋巴细胞表面抗原CD11a, 单核巨噬细胞表面抗原CD14, 同时不表达分化抗原HLA-DR[10~11]。我们采用1.073g/m LPercoll密度梯度分离法, 从兔骨髓中分离出单个核细胞, 3d后首次半量换液, 经多次换液, 去除大量为贴壁的杂细胞, 7~9d后细胞呈长梭形, 漩涡状生长。经传代细胞逐渐纯化, 至3代时采用流式细胞仪检测分离培养的细胞只表达CD29和CD90, 而CD34、CD45均呈阴性表达, 这表明我们分离培养的细胞是成分较为单一的MSC, 而不是造血干细胞和成纤维细胞。

总之, 实验结果表明利用本实验方法提取、纯化和扩增的MSC, MSC增殖能力较强, 纯度高, 可以作为组织工程的种子细胞, 为组织工程骨的构建提供依据。

摘要：目的探讨兔骨髓基质干细胞 (MSC) 体外分离培养及鉴定。方法自兔髂骨抽取骨髓, 采用密度梯度离心法分离纯化出MSC, 并增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点, 流式细胞仪检测第3代MSC表面抗原的表达情况。结果体外培养的兔MSC贴壁生长, 呈长梭形, 可增殖形成克隆;MSC阳性表达CD29, CD90, 但CD34, CD45呈阴性。结论利用密度梯度离心法获取的MSC具有大量增殖的能力, 表达CD29, CD90, 不表达CD34, CD45。

关键词：兔,骨髓基质干细胞,细胞培养

参考文献

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