真核细胞和原核细胞

真核细胞和原核细胞（精选7篇）

篇1：真核细胞和原核细胞

原核细胞是什么

原核细胞指没有核膜且不进行有丝分裂、减数分裂、无丝分裂的细胞。这类细胞的主要特征是没有以核膜为界的`细胞核，也没有核仁，只有拟核。细胞较小，没有真正的、成型的细胞核，没有染色体，DNA不与蛋白质结合，细胞器只有核糖体。

原核细胞构成的生物称为原核生物，均为单细胞生物，包括所有的细菌和蓝藻类等低等生物体，进化地位较低。

篇2：真核细胞和原核细胞

目的:为研究细胞周期蛋白(cyclin)在肿瘤形成过程中的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白B1、D1、E的真核表达载体,并检测其在293T细胞中的表达.方法:以乳腺cDNA文库为模板,分别扩增细胞周期蛋白B1、D1、E基因全长编码区序列,克隆到pcDNA3-FLAG真核表达载体上;用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染293T细胞,检测细胞中的FLAG融合蛋白的.表达.结果:酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的FLAG-Cyclin真核表达载体,Western印迹分析表明克隆的载体都能在真核细胞中表达分子大小相符的重组蛋白.结论:构建了FLAG-CyclinB1、FLAG-CyclinD1、FLAG-CyclinE真核表达载体,为细胞周期蛋白及其相关蛋白的研究奠定了基础.

作 者：熊志红 丁丽华 袁斌 王朝云 李杰萍 杨丽萍 杨智洪 叶棋浓 XIONG Zhi-Hong DING Li-Hua YUAN Bin WANG Zhoo-Yun LI Jie-Ping YANG Li-Ping YANG Zhi-Hong YE Qi-Nong 作者单位：熊志红,XIONG Zhi-Hong(军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;解放军总医院第二附属医院,结核病研究室,北京,100091)

丁丽华,袁斌,王朝云,李杰萍,杨丽萍,杨智洪,叶棋浓,DING Li-Hua,YUAN Bin,WANG Zhoo-Yun,LI Jie-Ping,YANG Li-Ping,YANG Zhi-Hong,YE Qi-Nong(军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850)

篇3：真核细胞和原核细胞

1 材料

1.1 试验动物、菌株及载体

C57BL/6J雄性小鼠[ (20±2) g], 购自新疆医科大学实验动物中心;p MD19-T载体和p EGFP-C1质粒, 购自Ta KaRa公司;基因工程菌E.coli DH5α, 由新疆农垦科学院畜牧研究所提供。

1.2 试剂

Plasmid Mini-preps Kit, 购自北京百泰克生物有限公司;DNA Gel Extraction Kit, 购自Bioer公司;RNA提取试剂盒, 购自美国Promega公司;Revert AidTMFirst Stand c DNA Synthesis Kit和限制性内切酶, 购自MBI公司;DNA Marker, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司;胎牛血清, 购自杭州四季青生物工程材料有限公司;G418和DMEM培养基, 购自Gibico公司;EDTA、Trypsin和青霉素、链霉素, 购自Sigma公司;GFP抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠Ig G, 购自武汉博士德生物工程有限公司;细胞培养板和培养皿, 购自丹麦Nunclon公司;引物由北京六合华大基因科技服务有限公司合成, 其他试剂均为进口或国产分析纯。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank公布的Ipr1基因序列 (登录号为AY845948.1) , 用生物软件Premier Primer 6.0设计特异性引物, 由北京华大基因公司合成 (序列见表1) , 以小鼠胸腺组织总RNA的反转录产物为模板扩增Ipr1基因的编码序列。

2.2 C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA的提取

摘眼球放血颈椎脱臼处死小鼠, 无菌操作取胸腺组织, 用TRIzol方法从分离的小鼠胸腺组织细胞中提取总RNA, 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取效果, -70℃保存, 备用。

2.3 Ipr1基因的扩增、克隆及鉴定

通过两步法RT-PCR扩增得到PCR产物, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 切下目的条带, 用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物, 将回收产物与克隆载体p MD19-T连接, 转化到DH5α中, 筛选出阳性克隆, 用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切鉴定。取经鉴定正确的质粒送北京六合华大基因科技有限公司测序。

2.4 重组表达质粒p EGFP-Ipr1的构建

重组克隆质粒p MD19-T-Ipr1和真核表达质粒p EGFP-C1分别经EcoRⅠ/Bam HⅠ酶切并回收后在T4 DNA连接酶作用下, 16℃连接4 h, 转化大肠杆菌DH5α感受态获得p EGFP-Ipr1重组质粒, 经EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切对重组质粒p EGFP-Ipr1进行鉴定。

2.5 小鼠腹腔巨噬细胞的培养

将C57BL/6J小鼠脱颈致死, 用75%乙醇浸泡5 min;取出, 用无菌纱布将乙醇擦去后用注射器紧贴表皮向腹腔内注射5 m L的DMEM培养液 (不含血清) , 放置5 min;再将腹腔内的液体抽出3.5~4 m L, 2 000 r/min离心10 min;加入洗涤液 (D-Hank’s) , 弃上清液;加入DMEM培养基 (含小牛血清和双抗) 调整细胞浓度, 37℃、5%CO2培养48 h后换液, 显微镜下观察可见有贴壁细胞呈圆形或椭圆形。巨噬细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养, 每日换液, 每4 d用0.25%胰蛋白酶消化, 以1∶3比例传代培养。

2.6 体外生长试验

将生长旺盛的第5代小鼠腹腔巨噬细胞用0.04%EDTA和0.25%胰酶消化后混匀, 调整细胞浓度为4×104个/m L, 接种在6孔细胞培养板中, 每孔接种1 m L, 再补加培养液1 m L, 混匀, 37℃、5%CO2、饱和湿度下培养, 每隔24 h消化收集3孔细胞, 连续7 d, 用血细胞计数板计数3次, 取平均值, 绘制细胞生长曲线。

2.7 重组表达质粒p EGFP-Ipr1转染小鼠腹腔巨噬细胞及表达产物的检测

巨噬细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养, 每日换液, 每4 d用0.25%胰蛋白酶消化, 以1∶3比例传代培养, 取对数生长期的细胞用无抗生素和含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养, 待细胞状态良好时加入50μL转染试剂LipofectamineTM2000和0.5μg p EGFP-Ipr1 (总体积120μL/孔) , 进行瞬时转染24~48 h后, Western-blot检测Ipr1基因的表达产物。

3 结果

3.1 Ipr1基因的RT-PCR扩增及阳性克隆的筛选结果

利用设计好的引物, 以细胞总RNA为模板, 获得c DNA第一链, 经RT-PCR扩增得到长度约为1 338 bp的特异性目的条带, 见图1。

M.DL-2 000 Marker;1~3.Ipr1基因扩增产物。

将PCR回收产物Ipr1与p MD19-T连接后转化克隆菌DH5α, 培养后提取p MD19-T-Ipr1质粒用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切鉴定, 经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 在2 692 bp和1 338 bp处有特异性条带, 与理论分子质量相符, 见图2。

3.2 重组表达质粒p EGFP-Ipr1的构建结果

将p MD19-T-Ipr1及p EGFP-C1分别用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切并回收小片段和载体大片段, 连接后转化大肠杆菌DH5α感受态, 挑取阳性克隆, 摇菌, 提取质粒, 用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切鉴定p EGFP-Ipr1重组质粒, 经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 在4 700 bp和1 338 bp处有特异性条带, 与预期结果一致, 见图3。

M.DL-2 000 Marker;1.p MD19-T-Ipr1/EcoRⅠ+Bam HⅠ双酶切产物。

M.DL-5 000 Marker;1~4.p EGFP-Ipr1/EcoRⅠ+Bam HⅠ双酶切产物。

3.3 小鼠腹腔巨噬细胞的培养结果

小鼠腹腔巨噬细胞呈圆形、椭圆形, 在接种2 h后可贴壁生长, 增殖到一定程度就会因生长空间受限而呈现卷曲现象, 生长状态不佳, 死亡细胞随之增多。本试验所用的第5代生长形态和状态都非常好的细胞连续培养7 d用于转染试验。刚培养的小鼠腹腔巨噬细胞用0.4%台盼蓝染色, 细胞活力都在98%以上, 见229页彩图4。

3.4 体外生长试验结果

将传至第5代的小鼠腹腔巨噬细胞以5.0×104个/孔的密度接种在24孔板中, 0~2 d为潜伏期, 生长缓慢;3~6 d为对数生长期, 生长较快;6 d后为平台期, 细胞生长缓慢。细胞生长曲线符合体外培养细胞的正常增殖规律, 为S形曲线 (见图5) , 在生长特性方面并无明显差异。

3.5 重组质粒p EGFP-Ipr1转染小鼠腹腔巨噬细胞

质粒p EGFP-Ipr1用真核细胞转染试剂LipofectamineTM2000转染小鼠腹腔巨噬细胞24 h后, 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况, 发荧光细胞较多, 说明转染效率较高, 用G418筛选2周后, 细胞形态正常, 出现6个单克隆, 挑取单克隆继续扩大培养后, 细胞形态正常, 在荧光显微镜下观察发出绿色荧光, 见229页彩图6。

3.6 Ipr1基因在小鼠巨噬细胞中表达产物的West-ern-blot检测结果

Western-blot检测结果表明, p EGFP-Ipr1转染细胞组的Ipr1-EGFP融合蛋白表达产物在约77 ku发生特异性免疫反应, 空质粒p EGFP-C1转染细胞组的EGFP蛋白表达在27 ku左右有1条特异性免疫反应条带, 表明Ipr1基因的表达产物的分子质量约为50 ku, 见图7。

1.p EGFP-Ipr1转染的巨噬细胞;2.p EGFP-C1转染的巨噬细胞。

4 讨论

全世界每年约有800万结核病新发病例, 约2百万人死于结核病, 但感染结核分枝杆菌的人中只有约10%的人发展成为结核病。有研究者提出, 除环境、年龄、吸烟及合并人类免疫缺陷病毒 (HIV) 感染等因素外, 机体的遗传因素可能与结核病的易感性相关[10]。研究者对巨噬细胞抗结核分枝杆菌固有免疫机制相关因素, 如TLRs及其信号途径、TNF-et及其受体、IFN-γ及其受体等的研究中指出, 宿主基因的遗传变异机体可能与结核病易感性相关, 但在人类还未发现某种单一基因变异决定机体对结核病的易感亦或有抗性[11]。

试验选用小鼠巨噬细胞是由于该株细胞来源于C57BL/6J小鼠, 目前国内外还未见报道其Ipr1基因的表达, 本试验结果表明, 在该细胞中未检测出Ipr1基因mRNA水平的表达, 因此本试验培育菌株是研究Ipr1基因在小鼠巨噬细胞抗核分枝杆菌等胞内寄生菌机制的理想细胞株。

本试验构建的真核表达载体p EGFP-Ipr1, 瞬时转染小鼠巨噬细胞观察到融合绿色荧光蛋白的Ipr1表达产物定位于细胞核内, 由于蛋白质的翻译是在细胞核中, 因此在进行瞬时转染后的第2小时开始, 每隔2 h观察荧光的表达及定位情况, 发现在最初看到微弱荧光时, 融合蛋白已经在细胞核内表达, 表明Ipr1基因表达产物一旦合成便立刻被输送至细胞核内, 并在细胞核内发挥其功能。

5 结论

试验采用RT-PCR技术成功从小鼠胸腺组织中克隆了Ipr1基因, 以载体PEGFP-C1为基础, 构建了真核表达质粒p EGFP-Ipr1, 在体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞, 经传代纯化后, 用脂质体转染法转染p EGFP-Ipr1。经G418抗性筛选, 可对稳定表达绿色荧光蛋白的细胞进行检测, 为下一步研究Ipr1基因抗结核分枝杆菌杀伤的作用机制打下基础。

参考文献

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篇4：真核细胞分裂常见考点例析

例1 关于同一个体中细胞有丝分裂和减数第一次分裂的叙述，正确的是（ ）

A.两者前期染色体数目相同，染色体行为和DNA分子数目不同

B.两者中期染色体数目不同，染色体行为和DNA分子数目相同

C.两者后期染色体行为和数目不同，DNA分子数目相同

D.两者后期染色体行为和数目相同，DNA分子数目不同

解析 有丝分裂和减数分裂分裂期过程的最大区别是染色体的行为不同。有丝分裂前期有同源染色体但不联会，中期染色体的着丝点被纺锤丝拉到赤道板位置排列整齐，后期着丝点分裂，姐妹染色单体分离并分别移向细胞的两极，此时染色体数目暂时性加倍，DNA分子数不变，分裂的结果是分裂前后染色体数与DNA分子数与分裂前一样。减数第一次分裂前期同源染色体联会，中期是联会的同源染色体被拉到赤道板的两侧并列分布，后期同源染色体分离及非同源染色体的自由组合，分裂的结果是染色体数目和DNA 数目均减少一半。由于DNA是在间期复制的，在分裂期总数未增加。有丝分裂的前期无同源染色体联会的行为，所以A、B、D错。本题通过有丝分裂和减数第一次分裂中有关染色体行为和DNA数目变化规律的内容，考查两种分裂方式的相同点和不同点，考查大家对两种分裂方式的识记和分析解决问题的能力。

答案 C

例2 判断下列细胞正在进行什么分裂，处在什么时期？

解析 该题要求根据细胞分裂图能判断其所处的时期，实际上需要区分有丝分裂、减Ⅰ和减Ⅱ的前、中、后期的特点。前期特点：有丝分裂是核膜核仁消失，出现了纺锤体和染色体，染色体散乱排列；减Ⅰ是同源染色体配对联会，出现四分体，交叉互换；减Ⅱ是非同源染色体散乱排列在细胞内。中期特点：有丝分裂是染色体排列在赤道板上，染色体形态数目清晰；减Ⅰ是同源染色体排列在赤道板上；减Ⅱ是非同源染色体排列在赤道板上。后期特点：有丝分裂是着丝点分裂，姐妹染色单体分离变成染色体，染色体数目加倍；减Ⅰ是同源染色体分离，非同源染色体自由组合；减Ⅱ是着丝点分裂，姐妹染色单体分离变成染色体，染色体数目加倍。

答案 1. 减Ⅱ前期 2. 减Ⅰ前期 3. 减Ⅱ前期 4. 减Ⅱ末期 5. 有丝分裂后期 6. 减Ⅱ后期 7. 减Ⅱ后期 8. 减Ⅰ后期 9. 有丝分裂前期 10. 减Ⅱ中期 11. 减Ⅰ后期 12. 减Ⅱ中期 13. 减Ⅰ前期 14. 减Ⅱ后期 15. 减Ⅰ中期 16. 有丝分裂中期

点拨 可按下列步骤判断：一看染色体数目，奇数为减Ⅱ（姐妹染色单体分家只看一极），偶数进行二看；二看有无同源染色体，没有为减Ⅱ（姐妹染色单体分家只看一极），有同源染色体进行三看；三看同源染色体行为，根据同源染色体行为确定有丝分裂或减Ⅰ。

例3 下图表示某种生物细胞核内染色体及DNA相对量变化的曲线图。根据此曲线图回答下列问题：（注：横坐标各个区域代表细胞分裂的各个时期，区域的大小和各个时期所需的时间不成比例）

（1）图中代表染色体相对数量变化的曲线是 。

（2）形成配子时，成对的遗传因子分离发生在图中的 过程。

（3）细胞内含有四分体的区间是 。

（4）若该生物体细胞中染色体数为20条，则一个细胞核中的DNA分子数在9—12时期为 条。

（5）着丝点分裂发生在横坐标数字的 处进行。

解析 根据DNA和染色体在有丝分裂和减数分裂中的变化特点可知，曲线A为DNA的变化曲线，B为染色体的变化曲线。这个图把减数分裂、受精作用和有丝分裂很好的联系在一起。0～8表示的是减数分裂；8位点发生受精作用；8～13表示的是有丝分裂。具体的时间段1～2、2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、7～8依次为减Ⅰ的前期、中期、后期、减Ⅱ的前期、中期后期和末期；9～10、10～11、11～12、12～13依次为有丝的前期、中期、后期和末期。成对的遗传因子分离发生在减Ⅰ后期，即3～4；四分体形成于减Ⅰ前期，消失于减Ⅰ后期，存在区间即1～3；着丝点分裂是瞬间完成的，在两个地方发生：减Ⅱ后期和有丝后期刚开始时，这里很多考生往往不是漏掉一个就是填成区间。

答案 （1）B （2）3～4 （3）1～3 （4）40 （5）6、11

点拨 主要是减数分裂染色体、DNA的变化和有丝分裂染色体、DNA的变化四种曲线的比较（如下图）。

[减数分裂染色体的变化][减数分裂DNA的变化][① ②]

[③ ④] [有丝分裂DNA的变化][有丝分裂染色体的变化]

区别有丝分裂曲线与减数分裂曲线：看起点和终点，起点和终点在同一直线上的为有丝分裂；不在同一直线上的为减数分裂。（如图①与图②或图③与图④）

区别染色体曲线与DNA曲线：看染色体或DNA暂时加倍的时间，加倍的时间在间期，且线条是倾斜（DNA的复制需一定时间）的为DNA；加倍的时间在后期（有丝分裂后期或减数第二次分裂后期），且是突然加倍（着丝点的分裂是瞬间的）的为染色体。（如图①与图③或图②与图④）

1.a和b属于同一动物体内的两个细胞，通过对其核内DNA分子含量的测定，发现a细胞中DNA含量是b细胞的两倍，最可能的解释是（ ）

A.a是正常体细胞，b是处于减数第一次分裂结束时的细胞

B.a是处于有丝分裂后期的细胞，b是处于有丝分裂前期的细胞

C.a是处于有丝分裂前期的细胞，b是处于减数第一次分裂后期的细胞

D.a处于有丝分裂中心体相互分离时，b处于次级性母细胞中染色体移向两极时

2.图示某雄性二倍体动物体内一个正在分裂的精原细胞。这个细胞所处的时期为（ ）

A.有丝分裂中期

B.减数第一次分裂中期

C.减数第二次分裂中期

D.减数第一次分裂间期

3.下图表示某种植物生殖与发育过程中，细胞内染色体和DNA相对含量的变化曲线，据图回答下列问题。

（1）图中“——”（实线）表示 含量的变化，“- - -”（虚线）表示 含量的变化。

（2）图中表示有丝分裂的阶段是 ，表示减数分裂的阶段是 ，表示受精作用的点是 。

（3）染色体复制的阶段有 ，同源染色体分离发生的点是 。

篇5：原核生物有细胞壁吗

细菌

是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分组成，有的细菌还有荚膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。绝大多数细菌的直径大小在0.5-5微米之间。可根据形状分成三类：球菌、杆菌和螺旋菌。

放线菌微米

篇6：真核细胞和原核细胞

猪圆环病毒2型Rep蛋白在真核细胞中的表达与定位

为了构建Rep蛋白真核表达质粒,研究PCV2复制过程中的亚细胞分布.本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因,并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中.并转染PK15细胞和Vero细胞.结果显示,重组的pEGFP-PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达.结论认为pEGFP-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h,PCV2的.Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核.

作 者：张鑫 尹伟 金玉兰 何嘉玲 颜焰 周继勇 ZHANG Xin YIN Wei JIN Yu-lan HE Jia-ling YAN Yan ZHOU Ji-yong  作者单位：浙江大学农业部动物疫病病原学与免疫控制重点开放实验室,杭州,310029;浙江大学传染病诊治国家重点实验室,杭州,310003;浙江大学濒危野生动物保护遗传与繁殖教育部重点实验室,杭州,310058 刊 名：中国动物传染病学报 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VETERINARY PARASITOLOGY 年，卷(期)：2009 17(1) 分类号：S858.282.659.2 关键词：猪圆环病毒2   Rep蛋白   细胞定位  

篇7：真核细胞和原核细胞

汉坦病毒(Hantavirus)在世界上可引起以急性肾功能损害和免疫功能紊乱为特征的肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和以肺浸润及肺间质水肿、呼吸窘迫、呼吸衰竭为特征的汉坦病毒肺综合症(hantavirus pulmonary syndrome,HPS)。我国是HFRS疫情最为严重的国家,流行区域广,发病人数居全球之首,且病死率较高。汉坦病毒在我国流行的主要型别为汉滩病毒(HTNV)和汉城病毒(SEOV)。

目前已明确致病性汉坦病毒的受体主要为整合素β3,而非致病汉坦病毒的受体主要为整合素β1[1,2]。然而以β3抗体封闭病毒易感细胞并不能完全阻断病毒对细胞的感染,此外也有相关报道证实尚有其他辅助性受体存在[3,4,5]。本课题组前期研究发现肿瘤坏死因子受体超家族Ⅰ(TNFR Ⅰ)与汉坦病毒糖蛋白Gc之间具有相互作用。我们推测TNFRⅠ在汉坦病毒入细胞中可能起到一定作用,本实验拟建立整合素β3和TNFRⅠ的稳定转染细胞系,为进一步研究相关因子在汉坦病毒入胞中的作用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coil JM109菌株、pIRES2-DsRed(带有红色荧光报告基因)、pIRES2-EGFP(带有绿色荧光报告基因)真核表达质粒、pcDNA3-β3、pcDNA3-TNFRⅠ(extrocellular,EC),CHO细胞均为本室保存;DNA Marker、PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Ex Taq、19T vector为TaKaRa公司产品;DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒购自爱思进公司;Tripure、FuGENE HD购自Roche公司;RPMI—1640、DMEM细胞培养基、G418购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 载体构建

含有整合素β3全基因的质粒pcDNA3—β3由加州大学圣地亚哥分校的Ginsberg教授惠赠。含有TNFRⅠ胞外区基因的质粒pcDNA3-TNFRⅠ(EC)由NIH的Lenardo教授惠赠。以提供的质粒为模板设计引物TNFRⅠ-F:5’CTAGCTAGCATGGCGCCCGTCGC;TNFRⅠ-R:5’ACGCGTCGA-CTCACCGTTGGTAGCG和β3-F:5’CTAGCTAGCGAGA-TGCGAGCGCGG;β3-R:5’ACGCGTCGACTCAA-ATTCACGGGGCCATGCAC;PCR扩增出β3与TNFRⅠ(EC)基因。将目的基因与T载体连接后转化,对重组质粒以NheⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定,送与华大基因公司测序。上述测序正确的载体用NheⅠ+XhoⅠ双酶切,回收片段。同时以NheⅠ+XhoⅠ双酶切pIRES2-DsRed、pIRES2-EGFP,回收载体。将β3基因与pIRES2-EGFP,TNFRⅠ(EC)基因与pIRES2-DsRed连接。对重组质粒进行PCR和酶切鉴定阳性克隆分别命名为pIRES2-EGFP-β3和pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC)。

1.2.2 细胞转染

选用状态良好、密度约在90%的细胞,用FuGENE HD介导上述构建完成的重组质粒转染细胞,具体操作按说明书进行。24 h后用含800 μg/mL G418的1640培养基进行筛选和传代培养。持续培养4 w左右,亚克隆3次,获得稳定的细胞克隆,扩大培养后冻存细胞。4 w后复苏,检测克隆冻存稳定性。转染pIRES2-DsRed和pIRES2-EGFP作为阴性对照,未转染细胞以同样浓度G418处理作为细胞培养对照。于培养不同时间用倒置荧光显微镜观察荧光蛋白的表达水平。

1.2.3 qRT-PCR检测稳转细胞

按0.5、1、1.5、2 μg将pIRES2-EGFP-β3和pIRES2-DsRed- TNFRⅠ(EC)分别单转和共转入CHO细胞。24 h后提取各孔细胞RNA,合成特异性检测引物TNFRⅠ-qF:5’ CGCTACCAACGGTGGAAGT;TNFRⅠ-qR:5’CAAGCTCCCCCTCTTTTTCAG和β3-qF:5’TCATCACCATCCACGACC;β3-qR:5’TCCCAACCTACCCC-ACTC,以qRT-PCR检测目的基因β3和TNFRⅠ(EC)的含量。每个转染剂量设2个复孔,实验重复三次。

2 结果

2.1 目的基因的克隆和鉴定

合成引物以现有质粒为模板进行PCR扩增,分别扩增出大小约为780 bp TNFRⅠ(EC)和2 380 bp β3的目的基因,扩增产物连接入T载体。NheⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定的阳性克隆经测序鉴定正确。

M1— DL2000 DNA Marker,M2—Wider Ranger DNA Marker, 1— pcDNA3-β3基因扩增结果,2—pcDNA3-TNFRⅠ(EC) 基因扩增结果,a—β3基因扩增条带, b—TNFRⅠ(EC)基因扩增条带

2.2 重组真核表达载体的构建和鉴定

重组质粒pIRES2-EGFP-β3和pIRES2-DsRed- TNFRⅠ(EC)用NheⅠ、XhoⅠ双酶切,可分别切出约780 bp与2 300 bp大小的片段,与目的片段大小相符(图2)。

M1—DL2000 DNA Marker,M2—Wider Ranger DNA Marker, 1—3—pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC)/NheⅠ+XhoⅠ, 4—6— pIRES2-EGFP-β3/ NheⅠ+XhoⅠ

2.3 报告基因的表达

荧光显微镜观察结果显示,转染了重组质粒与空载体的CHO细胞,在观察的不同时间点均能观察到报告基因的表达(图3),pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC)显示绿色荧光,pIRES2-EGFP-β3显示红色荧光,两重组质粒的共转染结果显示两种报告基因均有表达,而未转染的细胞则观察不到荧光(未显示)。

1—转染空质粒pIRES2-DsRed 的CHO细胞 (200×), 2—转染空质粒pIRES2-EGFP的CHO细胞 (200×), 3—转染重组质粒pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC)的 CHO细胞(400×),4—转染重组质粒pIRES2-EGFP-β3的 CHO细胞(400×),5、6—同时转染重组质粒 pIRES2-EGFP-β3和pIRES2-DsRed- TNFRⅠ(EC) 的CHO细胞 (400×)

2.4 qRT-PCR检测目的基因mRNA水平

利用合成的特异引物,检测了转染有重组质粒的CHO细胞中的目的基因mRNA的水平。结果显示,转染了pIRES2-EGFP-β3的CHO细胞中β3基因表达水平显著升高,而同样细胞的TNFRⅠ(EC)基因表达情况为本底水平;转染了pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC)的CHO细胞中TNFRⅠ(EC)基因表达水平显著升高,而同样细胞的β3基因表达情况为本底水平。

1—转染pIRES2-EGFP-β3的CHO中β3基因的 mRNA水平检测结果,2—转染pIRES2-DsRed- TNFRⅠ(EC)的CHO中TNFRⅠ基因的mRNA水平检测结果, 3—转染pIRES2-DsRed-TNFRⅠ(EC) 的CHO中β3基因的mRNA水平检测结果,4—转染 pIRES2-EGFP-β3的CHO中TNFRⅠ基因的 mRNA水平检测结果

3 讨论

病毒通过其表面糖蛋白与宿主易感细胞表面受体结合从而入胞进行感染。汉坦病毒表面具有Gn与Gc两个糖蛋白。1998、1999年Gavrilovskaya IN[1,2]利用配体阻断实验发现,致病性汉坦病毒主要利用整合素β3来入胞,而非致病汉坦病毒则主要利用整合素β1来入胞。他们进一步研究表明,无论是β3受体的配体还是β3的抗体均不能完全(约70%)阻断汉坦病毒的感染入胞,提示有其他辅助型受体的存在。而Krautkramer E[3]研究发现病毒并不是利用整合素β3而进入极性细胞的,因为该细胞上β3主要存在于细胞基底侧,并不处于病毒感染进入时的细胞外侧,据此他们发现了极性细胞上DAF/CD55可作为汉坦病毒受体而导致病毒入胞。国内牟丹蕾等[4]研究表明,分子量大小为70 kD的分子可能在汉坦病毒入胞中起了重要作用。除此之外尚有发现30 kD大小蛋白[5]可能在汉坦病毒入胞中起了作用等等。这些研究表明除了主要受体整合素β3外,汉坦病毒的入胞可能尚有其他的辅助因子或辅受体存在。

此外有证据显示,TNFRSF(super family)在多种感染性疾病中起重要作用,可以介导病毒入胞诱导凋亡以及调节宿主免疫反应等[6,7]。本课题组前期研究发现,肿瘤坏死因子受体超家族Ⅰ与汉坦病毒糖蛋白Gc之间具有相互作用[8]。但其与汉坦病毒感染的关系及具体作用机制尚有待于进一步研究。我们推测TNFRⅠ可能在汉坦病毒入胞过程中起了一定作用。本实验通过分子克隆技术将汉坦病毒主要受体整合素β3与TNFRⅠ分别构建入CHO细胞,观察了荧光报告基因的表达水平,并以实时定量PCR进行了初步鉴定。结果表明,通过构建的稳定转染细胞系可为后续深入研究TNFRⅠ在汉坦病毒入胞机制中的作用提供实验依据和材料。

参考文献

[1] Gavrilovskaya I N,Brown E J,Ginsberg M H,et al.Cellular entry ofhantaviruses which cause hemorrhagic fever with renal syndrome ismediated by beta3 integrins.J Virol,1999;73:3951—3959

[2] Gavrilovskaya I N,Shepley M,Shaw R,et al.Beta3 integrins medi-ate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure.Proc Natl Acad Sci U S A,1998;95:7074—7079

[3] Krautkramer E,Zeier M.Hantavirus causing hemorrhagic fever withrenal syndrome enters from the apical surface and requires decay-ac-celerating factor(DAF/CD55).J Virol,2008;82:4257—4264

[4] Mou D L,Wang Y P,Huang C X,et al.Cellular entry of Hantaanvirus A9 strain:specific interactions with beta3 integrins and a novel 70kDa protein.Biochem Biophys Res Commun,2006;339:611—617

[5] Kim T Y,Choi Y,Cheong H S,et al.Identification of a cell surface 30 kDa protein as a candidate receptor for Hantaan virus.J Gen Vir-ol,2002;83:767—773

[6] Adkins H B,Brojatsch J,Young J A.Identification and characteriza-tion of a shared TNFR-related receptor for subgroup B,D,and E avi-an leukosis viruses reveal cysteine residues required specifically forsubgroup E viral entry.J Virol,2000;74:3572—3578

[7] Akhtar J,Tiwari V,Oh M J,et al.HVEM and nectin—1 are themajor mediators of herpes simplex virus 1(HSV—1)entry into hu-man conjunctival epithelium.Invest Ophthalmol Vis Sci,2008;49:4026—4035