肺动脉平滑肌细胞

肺动脉平滑肌细胞（精选八篇）

肺动脉平滑肌细胞 篇1

1 材料与方法

1.1 试剂与抗体

细胞培养试剂, 胎牛血清 (FBS) 购自Gibco。水合盐酸法舒地尔购自天津红日药业股份有限公司。其他试剂均购自Sigma公司。家兔抗MYPT-1抗体购自Santa Cruz生物科技, 抗磷酸化MYPT-1 (Thr696) 多克隆抗体购自Upstate。辣根过氧化物酶结合的家兔和小鼠多克隆二抗购自KPL。SV总RNA提取试剂盒, 反转录试剂盒和Go Taq Master Mixes购自Promega。

1.2 细胞培养

PASMCs分离自体重200 g～220 g雄性大鼠的肺动脉, 方法参照文献[8], 并得到本地伦理委员会的许可。动脉被分离后, 约1 mm3的小块被转移到一个烧瓶, 并在含10%FBS且补充了氨苄青霉素和链霉素的DMEM中培养, 湿度95%, 5% CO2, 37 ℃。PASMC的纯度和鉴定主要根据其特殊的形态学特征和免疫组化对α-actin的染色。第3代到第5代的细胞用于本研究。

1.3 细胞增殖检测

采用MTT法。PASMCs接种到96孔板上, 每孔5×103个细胞, 在含10%FBS的DMEM中培养48 h, 然后用去血清 (0.1% FBS) 的DMEM培养, 其中含有不同浓度的法舒地尔 (0, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L) , 培养24 h。用VEGF (1 μmol/L) 刺激24 h后, PASMCs置于MTT中, 37 ℃培养4 h。甲臜沉淀用DMSO溶解, 检测570 nm的吸光度。

1.4 细胞周期检测

细胞周期的分布用流式细胞仪检测。同步化的PASMCs用VEGF刺激。胰蛋白酶消化后, PASMCs用70%的乙醇4℃固定过夜, 然后用碘化丙啶溶液室温染色1 h。细胞核中的碘化丙啶-DNA复合物检测用FACS Calibur (Becton & Dickinson公司) 。

1.5 蛋白提取

PASMCs在100 mm的平皿中生长到发生融合, 用去血清的DMEM孵育24 h, 1 μmol/L的VEGF刺激指定时间。总蛋白的提取方法:生长捕获的PASMCs用冰冷的D-Hanks液洗涤, 加入裂解缓冲液, 冰上放置60 min, 使其脱离平皿。裂解混合液离心, 12 000 r/min, 4 ℃, 10 min, 收集上清液做分析。

1.6 统计学处理

数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。采用one-way ANOVA和Dunnett检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 法舒地尔逆转VEGF诱导的PASMC增殖

VEGF (10 ng/mL) 显著增加OD值 (P<0.01) , OD值代表了PASMCs的增殖, 这种增殖被法舒地尔显著的抑制 (P<0.01) , 并且呈剂量依赖性。MTT法检测和台盼蓝排除法检测表明, 用法舒地尔 (100 μmol/L) 处理24 h对PASMCs没有表现出任何细胞毒性 (数据没有提供) , 提示对PASMC增殖的抑制不是由于法舒地尔的细胞毒性。

注:组1为空白组-正常PASMC;2为VEGF10 ng/mL诱导增殖组;3为VEGF10 ng/mL+法舒地尔10 μmol/L组;4为VEGF10 ng/mL+法舒地尔30 μmol/L;5为VEGF10 ng/mL+法舒地尔50 μmol/L;6为VEGF10 ng/mL+法舒地尔100 μmol/L

2.2 法舒地尔对细胞周期进程的影响

10 ng/mL的VEGF刺激24 h后, 处于S期的细胞从17.8%增加到26.3%, 同时, G1期细胞从75.3%降到54%。这些效应可以被法舒地尔的预处理所抑制。法舒地尔显著地阻滞了VEGF诱导的细胞周期进程, 使进入S期的PASMCs细胞分别下降到15.2%, 11.1%, 12.7%和10.9%, 而停滞在G0/G1期的细胞分别增加到62.9%, 72.4%, 74.7%和76.3。该结果与MTT结果相一致。

2.3 法舒地尔对VEGF介导的ROCK激活的影响

与处于静态的PASMCs 相比, VEGF诱导了ROCK-1 mRNA表达上升 (P<0.01) , 法舒地尔预处理导致ROCK-1 mRNA表达降低 (P<0.05 或P<0.01) 。ROCK激活后磷酸化其底物, 肌球蛋白磷酸酶目标亚单位-1 (MYPT-1) 。检测VEGF对MYPT-1磷酸化的影响。VEGF (1 μmol/L) 引起MYPT-1的磷酸化, 10 min时达到峰值 (P<0.01) , 这种效应可以被法舒地尔所抑制, 并呈现剂量依赖性 (P<0.05 或P<0.01) 。详见图2、图3。

3 讨 论

肺动脉高压是一种致命的疾病, 其特征包括:内皮功能不全, 肺动脉平滑肌细胞过度收缩、增殖, 炎性细胞浸润, 其中ROCK信号通路可能广泛的参与[9]。ROCK与PAH中平滑肌细胞重构有关, 本研究主要在体外培养的细胞中评估法舒地尔对VEGF诱导的PASMC增殖的影响及其作用机制。本研究显示, 法舒地尔显著下调了进入S和G2/M期的PASMC的百分数, 而停留在G0/G1期的细胞百分数显著增加。法舒地尔显著抑制了VEGF诱导的PASMC增殖。

ROCK是平滑肌细胞中Rho A下游的效应物。激活的ROCK在Thr696位点磷酸化其底物, MYPT-1[10]。所以检测法舒地尔对VEGF诱导的MYPT-1磷酸化的影响。结果提示, VEGF诱导了ROCK-1 mRNA表达的显著上调和PASMC中MYPT-1的Thr696位点快速磷酸化。对PASMC进行法舒地尔的预处理可显著抑制VEGF诱导ROCK-1 mRNA表达和MYPT-1的磷酸化。法舒地尔通过抑制ROCK的活性而抑制ERK转位到细胞核和紧接着的对转录因子的激活, 这可能解释法舒地尔抑制ROCK-1 mRNA表达的事实。结果提示, VEGF诱导PASMCs增殖明显地被法舒地尔所阻断。这些数据提示, VEGF诱导的PASMCs增殖需要Rho和ROCK的激活。

本研究证明, ROCK被VEGF激活, 这对VEGF诱导的PASMC增殖很关键。而且, 法舒地尔可以抑制VEGF诱导的PASMC增殖和细胞周期进程。这些结果将有助于进一步了解法舒地尔对肺动脉高压疾病的有益作用的分子机制。

参考文献

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肺动脉平滑肌细胞 篇2

目的 探讨三七总皂甙对血小板源生长因子刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响及其可能机制.方法 运用血小板源生长因子刺激兔体外血管平滑肌细胞增殖模型,通过四甲基偶氮唑盐比色法、流式细胞术及免疫细胞化学法观察三七总皂甙对其增殖活性、细胞周期及c-myc蛋白表达的影响.结果 血小板源生长因子显著刺激血管平滑肌细胞增殖,三七总皂甙呈浓度依赖性抑制血管平滑肌细胞增殖,对血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖亦具有显著抑制作用;三七总皂甙作用下血管平滑肌细胞处于G1/G0期的细胞数增多,而G2/S期的.细胞数显著减少,c-myc蛋白的表达亦降低.结论 三七总皂甙对基础状态下及血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖均具有显著抑制作用,部分机制与其阻滞血管平滑肌细胞G1/G0期向S期转化以及下调c-myc基因表达有关.

作 者：周永兰 陈清枝 张延斌 李东野 ZHOU Yong-Lan CHEN Qing-Zhi ZHANG Yan-Bin LI Dong-Ye 作者单位：周永兰,ZHOU Yong-Lan(江苏大学附属徐州医院,徐州市第三人民医院心内科,江苏省徐州市,221005)

陈清枝,张延斌,李东野,CHEN Qing-Zhi,ZHANG Yan-Bin,LI Dong-Ye(徐州医学院附属医院心内科,江苏省徐州市,221002)

肺动脉平滑肌细胞 篇3

研究证实,阿托伐他汀钙(ATV)通过钙调通道差异性表达来减弱野百合碱诱导的PAH大鼠的肺动脉重构[4]。Guerard等[5]证明普伐他汀可抑制野百合碱诱导的PAH进展,改善肺动脉内皮依赖性舒张功能。此外,Taraseviciene-Stewart等[6]研究提示辛伐他汀能够显著降低平均肺动脉压力,缓解右室肥厚,其机制可能与抑制凋亡蛋白Caspase-3激活、减少肺微血管内皮细胞凋亡有关。信号转导通路磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是许多生命活动中关键的信号转导分子,参与调控细胞分裂﹑分化﹑凋亡、增殖及迁移等活动。经ATV后处理可激活PI3K/AKt信号通路,减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤[7]。但ATV是否参与调控PASMCs的生物学行为仍不十分清楚。因此,本研究旨在探讨ATV对野百合碱诱导的PASMCs增殖的调控作用,探讨PI3K/AKT信号通路是否参与ATV逆转野百合碱诱导的PASMCs增殖,从而为ATV治疗PAH提供新思考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

野百合碱购于上海纯优生物科技有限公司;ATV购于上海研生实业有限公司;双抗购自友康基业生物科技有限公司;细胞培养液DMEM-F12购自Invitrogen公司;SYBR Green PCR Master Mix染料荧光定量Real-time PCR试剂盒购自美国Applied Biosystems公司;胎牛血清购自Gibco公司;蛋白电泳仪、PVDF膜购于BIO-RAD公司;紫外分光光度仪购于美国BIO-RAD公司;Odyssey红外荧光扫描成像系统购于美国LI-COR公司;抗PI3K、AKT、Bcl-2及Bax抗体购自Cell Signaling Technology公司;6孔板和96孔板购自上海拜力生物科技有限公司;共聚焦显微镜FV300购自日本Olympus公司。Image-Pro Plus 6.0图像分析系统购于Media Cyberneties公司。

1.2 PASMCs细胞培养

Wistar乳鼠购于哈尔滨医科大学附属第二临床医院动物中心。动物实验研究遵循哈尔滨医科大学所制订的有关实验动物保护和使用的指南,并经实验动物伦理委员会批准(批准文号:2009104)。本研究采用组织块种植法:取Wistar乳鼠,脱颈椎处死后,消毒后剖开胸腔,迅速取出心肺置于D-Hanks液中。迅速剥离肺动脉主干及左右肺动脉,用D-Hanks液反复漂洗。剥除血管外膜的纤维脂肪层,沿血管外侧纵向剪开,将血管内膜面向上,用刀片去除内皮细胞,在DMEM-F12培养液中漂洗2次。将中膜剪成0.5 mm×1 mm小块,移入培养瓶内,组织块之间距约0.5 cm。然后将培养瓶翻转,置于37℃、CO2培养箱中。1 h后轻轻翻转并加入含20%胎牛血清的DMEM-F12培养液,使组织块浸泡在培养液中,置于37℃、CO2培养箱中静置培养1周。1周后再观察及换液。此后,改用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液,每隔3 d换液1次。当大部分组织块长出细胞晕,并且相邻组织块间细胞晕融合时,振摇培养瓶,使组织块脱壁,吸除培养液和脱壁组织块,加入2~3 m L无菌D-Hanks液清洗2次后,用0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化分散细胞,进行传代培养。通过三瓶置换法纯化PASMCs。第3~6代细胞用于后续实验。

1.3 药物干预

将PASMCs细胞分为对照组、野百合碱组、野百合碱+ATV组以及野百合碱+ATV+SC79组。野百合碱组PASMCs细胞培养液中加入野百合碱(1μmol/L);对照组给予等剂量的生理盐水;野百合碱+ATV组在培养液中加入1μmol/L野百合碱的同时给予ATV(10μmol/L);野百合碱+ATV+SC79组在培养液加入1μmol/L野百合碱的同时给予ATV(10μmol/L)和SC79(AKT特异性激动剂,150μmol/L)。继续培养48 h后用于后续的实验。

1.4 MTT实验

收集各组PASMCs细胞,以3×103个细胞/孔接种于96孔培养板,每孔培养液总量200μL,于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养48 h,每孔加入20μL MTT溶液(5 mg/m L),继续培养4 h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2~3遍后,再加入含MTT的培养液。终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。同时设置空白对照孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),每组设定3个复孔。以加药前的吸光值作为100%,各时间点与其比较。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡

将爬满PASMCs细胞的载玻片用PBS洗涤1次。室温下晾干,利用4%多聚甲醛固定PASMCs细胞30 min,再用PBS冲洗载玻片2次,每次5 min。4 m L3%H2O2加36 m L甲醇配制的封闭液封闭细胞10 min。PBS洗2次,每次5 min。加入穿透液(通透液的配制:0.1%Triton X-100溶于0.1%柠檬酸钠,需新鲜配制),冰上(2~8℃)促渗2 min。加入Roche原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL染色,每张载玻片加50μL TUNEL反应混合液,放入避光湿盒中,于37℃孵箱中孵育1 h。在暗室中利用PBS洗玻片2次,每次5 min。加入DAPI进行细胞核染色,37℃培养箱孵育10 min。用抗荧光淬灭封片液进行封片,置于荧光显微镜下观察,计算每组细胞的凋亡率。

1.6 免疫印迹(Western blot)分析PI3K、AKT、Bcl-2以及Bax蛋白的表达

将各组细胞培养瓶置于冰上,PBS洗涤细胞3次,每个培养瓶中加入适量细胞裂解液,超声裂解组织,每次工作20 s,间歇30 s,反复5次,之后放置冰上裂解30 min,13 500 r/min高速离心机于4℃条件下离心15 min,收集上清液于-80℃冰箱中保存。取1μL样品应用BCA试剂盒测定细胞中蛋白质浓度。依次配制分离胶和积层胶,每个孔道中加入80~100μg的样品量。电泳槽联通电泳仪电源,90V电压跑浓缩胶。待测样品和进入分离胶后,电压改为120V,电泳60~90 min后,溴酚蓝快迁移出分离胶时停止电泳。按照“纤维垫-滤纸-凝胶-硝化纤维膜-滤纸-纤维垫”的顺序由下至上排列安装好,恒定300 m A电流,转膜时间为80 min。取出NC膜置于5%的脱脂奶粉中,在4℃的环境中封闭2 h。分别用一抗PI3K抗体(1∶200)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、GAPDH(1∶1000)在4℃冰箱中孵育过夜。取出孵育过抗体的NC膜,用PBS-T洗涤3次,每次10 min。然后用(1∶4000)稀释的红外荧光标记二抗均匀铺展在NC膜上,避光孵育1 h后用PBS-T洗涤3次,每次10 min。最后用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行检测,计算其灰度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据,计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATV能明显抑制PASMCs细胞增殖

MTT实验检测结果表明,与对照组(1.03±0.04)比较,在野百合碱能诱导作用下,PASMCs细胞的增殖明显上调(1.68±0.07),差异有高度统计学意义(P<0.01),而ATV能明显逆转野百合碱诱导PASMCs细胞的增殖的能力(0.55±0.18)(P<0.01)。

2.2 ATV能促进PASMCs细胞的凋亡

TUNEL染色法结果证明,与对照组比较,PASMCs细胞经过ATV处理后,被TUENL染色染成绿色的凋亡细胞明显增多,而野百合碱处理组不会引起细胞凋亡数量的增加(P<0.01)(图1,封四)。

2.3 ATV能抑制PASMCs细胞中PI3K/AKT信号通路

Western blot检测结果显示,与对照组及野百合碱组比较,野百合碱+ATV组可以显著抑制PASMCs细胞中PI3K和AKT的表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)(图2)。

与对照组比较,**P<0.01;ATV:阿托伐他汀钙;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞

2.4 AKT特异性激动剂SC79逆转ATV的作用

Western blot检测结果显示,与野百合碱+ATV组比较,AKT特异性激动剂SC79可以显著逆转ATV抑制PASMCs细胞中AKT的表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)(图3)。

2.5 ATV能调控PASMCs细胞中凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达

Western blot检测结果显示,与对照组及野百合碱组比较,野百合碱+ATV组可以显著抑制PASMCs细胞中Bcl-2的表达,促进Bax蛋白的表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)(图4)。

与野百合碱组比较,**P<0.01;与野百合碱+ATV组比较,##P<0.01;ATV:阿托伐他汀钙;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞

与对照组比较,**P<0.01;ATV:阿托伐他汀钙;PASMCs:肺动脉平滑肌细胞

3 讨论

PAH是慢性阻塞性肺疾病发展成肺源性心脏病的重要环节,其发病机制尚未完全阐明。本研究采用野百合碱体外诱导PASMCs增殖,研究ATV对PASMCs增殖及诱导凋亡中的作用。研究结果提示:(1)野百合碱在体外诱导PASMCs增殖,且ATV能明显抑制野百合碱诱导增殖的能力。(2)ATV能明显诱导PASMCs发生凋亡。(3)ATV可能通过抑制PI3K/AKT信号通路而发挥作用。(4)ATV能明显诱导促凋亡蛋白Bax的表达,而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

ATV是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶抑制剂,可以有效降低体内胆固醇合成[8,9,10]。近年来大量研究发现ATV还存在着除了降低血清胆固醇水平的特性之外的“多效性”作用。这些作用包括抗氧化、刺激内皮祖细胞分化、改善内皮功能、抗炎等[11,12,13]。此外,ATV可有效抑制血管平滑肌细胞增生,稳定动脉斑块,改善心肌重构,抗血小板以及抗凝等[14]。然而,ATV在抑制PAH发生发展方面的研究较少,本研究提示ATV可能通过诱导PASMCs发生凋亡而发挥抗凋亡的作用。

PI3K/AKT信号通路是调节细胞功能的重要的信号转导通路[15],包括生长因子在内的多种刺激能够激活血管平滑肌细胞的PI3K,进而提高细胞内IP含量,然后活化AKT,参与调控细胞的迁移、增殖和凋亡等[16]。文献报道,PI3K/AKT信号通路在血管平滑肌细胞增殖的发生发展过程中起着非常重要的作用[17]。近年来有研究证实,生长因子及缺氧等可激活PASMCs中PI3K/AKT信号转导通路,诱导PASMCs增殖;而抑制PASMCs中PI3K/AKT信号转导通路,则可抑制生长因子及缺氧刺激的PASMCs增殖,提示PI3K/AKT信号通路可能特异性介导PASMCs的增殖[17,18]。Wang等[19]进一步证实PI3K/AKT信号转导通路可通过特异性调控细胞周期蛋白的表达,促进细胞周期进展,诱导PASMCs增殖,且活体动物研究进一步证实抑制PI3K/AKT信号通路可预防及治疗多种诱因导致的PAH的发生。Chao等[20]报道,PI3K/AKT和ERK/p38 MAPK信号通路的平衡决定了PASMCs表型的变化。本研究发现ATV可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路而发挥抑制PASMCs增殖的作用。本研究免疫印迹检测结果显示,与对照组比较,ATV能够增加抑制AKT蛋白的磷酸化,并且诱导促凋亡蛋白Bax的表达而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。TUNEL实验进一步证明我们的结论,ATV能够诱导PASMCs发生凋亡。

总之,通过本研究提示ATV通过作用于PI3K/AKT信号通路调控PASMCs细胞增殖,诱导细胞凋亡,为PAH治疗提供新的治疗策略。

摘要：目的 探讨阿托伐他汀钙(ATV)对野百合碱诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖与凋亡作用及其分子机制。方法 将PASMCs随机分为对照组、野百合碱组、野百合碱+ATV组以及野百合碱+ATV+SC79组。应用MTT法检测PASMCs细胞的生长情况,荧光TUNEL法分析PASMCs细胞凋亡情况,并用免疫印迹法检测PASMCs细胞中PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2以及Bax表达的变化。结果 与对照组比较,野百合碱组PASMCs细胞增殖明显增强(P<0.01),ATV能明显抑制MCT诱导的PASMCs细胞增殖(P<0.01),且ATV可明显降低PI3K/AKT通路蛋白及Bcl-2蛋白的表达,而升高Bax蛋白的表达,诱导PASMCs细胞凋亡(P<0.01)。此外,AKT特异性激动剂SC79能逆转ATV的作用。结论 ATV通过作用于PI3K/AKT信号通路调控PASMCs细胞增殖,诱导细胞凋亡,为肺动脉高压治疗提供新的治疗策略。

肺动脉平滑肌细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物 纯种新西兰大耳白兔80只,雌雄各半,体重2.0 kg~2.5 kg(北京通利试验动物养殖场提供),分笼饲养,经1周检疫期及动物室基础饲料适应性喂养后进行实验。

1.2 药物 芎芍胶囊由北京国际生物制品研究所提供(批号200094),由川芎、赤芍的有效部位川芎总酚和赤芍总苷组成,每粒0.25 g;普罗布考片每片0.25 g,河北承德市制药厂生产(批号200083)。

1.3 仪器与试剂 显微镜-微机彩色图像处理系统(BHEC型,北京惠中公司产品),4F·Forgarty导管(英国BASTER公司产品)。DAB显色剂(Sigma公司),原位细胞凋亡检测试剂盒(北

1) 为国家自然基金资助课题(No.30100248)

京医科大学分子病理室。

1.4 实验方法

1.4.1 兔腹主动脉AS造模与分组给药方法 纯种新西兰大耳白兔80只,适应性饲养1周后,用3%戊巴比妥钠1 mL/kg经耳缘静脉注射麻醉,固定四肢及头部,右后肢内侧剪毛,无菌条件下,在股动脉搏动最明显处,沿股动脉走行方向剪开皮肤及皮下组织,钝性分离股动脉,结扎远端,用血管夹阻断其近端血流,在两者间的血管壁上剪一小切口,其中70只逆行插入4F·Forgarty导管,插入深度为15 cm,用1 mL注射器注入球囊内0.5 mL气体,缓慢回拉约10 cm,抽出气体后,重新将球囊插至原位,反复5次,确保腹主动脉内皮剥脱。退出导管,结扎股动脉,依次缝合切口,外敷云南白药1粒以止血及促进伤口愈合。术后每日肌肉注射青霉素8×105 U,连续3 d,预防术后感染。所有动物均手术成功,术后随机分为7组,每组10只,即模型3 d组、2周组、6周组:术后喂食高脂饲料(10%猪油、2%胆固醇、88%基础饲料),观察时间分别为3 d、2周、6周,不给予特殊药物治疗;单纯内皮损伤组:术后只喂食普通饲料,不服用高脂饲料及任何药物;普罗布考组:在高脂饲料中拌入普罗布考0.031 6 g/(kg·d);芎芍胶囊小剂量组:在高脂饲料中拌入芎芍胶囊0.24 g/(kg·d);芎芍胶囊大剂量组:在高脂饲料中拌入芎芍胶囊0.48 g/(kg·d),观察时间均为6周,药物组09:00喂食拌有药物的高脂饲料,观察喂食完毕后喂食普通高脂饲料。另10只兔为假手术组(正常对照组),只分离结扎股动脉,不拉伤腹主动脉内皮,普通饲料喂食6周。

1.4.2 观察项目及检测方法

1.4.2.1 取材 各实验组到达设计时间后予3%戊巴比妥钠1 mL/kg,经耳缘静脉注射麻醉,麻醉状态下,沿腹部正中线切开,分离出腹主动脉,先用生理盐水冲洗后予10%甲醛恒压灌注10 min,灌注压为100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。取出腹主动脉,在血管病变最明显处取材,每个动脉分为两部分,一部分用于组织学检测,于10%甲醛中继续固定2 h~4 h。常规石蜡包埋,间断均匀切片,切片厚度均为5 μm,用于原位凋亡染色。

1.4.2.2 TUNEL法原位凋亡染色 采用TUNEL法,即末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法标记凋亡细胞核中的DNA3′-OH末端,DAB显色,苏木精复染。用含有核苷酸混合液的标记溶液取代TUNEL反应混合液作阴性对照,其余步骤相同。用于检测新生内膜中VSMC的凋亡情况。

1.4.2.3 TUNEL染色定量方法 苏木精复染后,正常细胞核均匀着蓝绿色,凋亡细胞核呈深浅不一的棕黄色。每组随机取2张切片,每张切片于高倍镜下选取5个视野,分别计数每个视野中血管内、中膜细胞数和TUNEL染色阳性细胞数,求阳性细胞百分率。

1.4.2.4 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)测定 实验结束后心脏取血2 mL,注入含有10%EDTANa2溶液15 mL和抑肽酶20 mL的EP管中,混匀,3 000 r/min离心10 min,吸取上层血浆置另一EP管中-20 ℃保存,用于血浆AngⅡ测定。血浆AngⅡ水平采用放射免疫法。

1.5 统计学处理 计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,采用SPSS 10.0 软件用单因素ANOVA 分析各组差异。

2 结 果

2.1 各组血浆AngⅡ水平的比较

内皮损伤喂食高脂饲料3 d,血浆AngⅡ水平逐渐升高,6周时与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),芎芍大剂量组明显降低血浆AngⅡ水平,与模型6周组比较,差异有统计学意义(P<0.05),普罗布考组及芎芍小剂量组亦有降低AngⅡ水平的趋势,但无统计学意义。单纯内皮损伤组AngⅡ升高不显著。详见表1。

2.2 各组血管壁细胞TUNEL染色结果及凋亡阳性细胞百分率

TUNEL染色结果显示,阴性对照未见凋亡细胞,正常对照组中膜有少量凋亡细胞,其他各组血管内膜、中膜均可见凋亡细胞阳性表达。模型3 d组已出现凋亡细胞,2周及6周时细胞凋亡进一步增多,单纯内皮损伤组与模型6周组比较,凋亡细胞阳性表达无统计学意义(P>0.05)。芎芍胶囊大、小剂量组凋亡细胞阳性表达率均高于模型6周组,普罗布考组凋亡细胞阳性表达率与模型6周组比较有升高趋势。各组血管壁细胞凋亡率详见表2。

3 讨 论

目前认为,内皮损伤和VSMC的迁移增殖是AS启动和发展的关键环节之一,而细胞凋亡与增生相伴并行,在内皮损伤、增生的抑制、粥样病灶的形成和斑块的剥脱等方面起着重要作用。研究发现[1],内皮剥脱后VSMC的迁移和增殖导致内膜增厚,而在内皮的再愈合过程中以及血管壁的再建过程中,VSMC凋亡可能引起细胞成分的减少。在AS过程中,由于细胞凋亡过度或削弱对细胞增生的制约,血管的细胞构成和功能发生改变,非细胞成分增多,促成AS病变的同时,导致管壁变形变硬[2]。因此,细胞凋亡可能是AS病变中细胞死亡的重要方式,是调节内皮损伤后所致内膜增殖演变过程的一个重要机制。

近年来,人们越来越关注AngⅡ在AS中所起的作用,已有许多研究表明,AngⅡ与其受体AT1结合后,可通过一系列反应引起VSMC的肥大和增殖,并抑制凋亡的发生[3]。本实验证实,芎芍胶囊大剂量可明显降低血浆AngⅡ水平,可能是芎芍胶囊抑制平滑肌细胞增殖并促进其凋亡的作用机制之一。Durand等[4]对动脉粥样硬化的新西兰兔行股动脉血管成形术,发现损伤血管处细胞凋亡率与最终血管内膜增生及再狭窄的发生呈显著负相关。因此推测,在血管内皮损伤后血管平滑肌细胞增生的过程中,细胞凋亡可以起到拮抗内膜过度增生的作用,并最终减轻再狭窄的程度。Bochaton等[1]在大鼠主动脉的实验中发现,当主动脉去内皮或内皮损伤后可引起中膜VSMC的迁移和增殖,形成新内膜,去内皮损伤15 d后,病灶中可发现大量凋亡的VSMC,凋亡的VSMC数量于损伤后20 d达最多,45 d后,当损伤的内皮重新愈合时,凋亡的VSMC也随之消失,增厚内膜的细胞即明显减少。因此认为VSMC的凋亡是调节内膜厚度演变的重要机制之一。本研究显示,模型3 d时可见VSMC凋亡,2周至6周时凋亡有所增加,但内膜仍进一步增厚,可能原因为:①与VSMC增殖比较,凋亡相对不足,致使VSMC总数不断增加;②由于大量凋亡细胞被巨噬细胞吞噬后,清除不足,以及大量VSMC和巨噬细胞来源的泡沫细胞在病变局部聚集,分泌大量细胞外基质,内膜反而增厚。芎芍胶囊大、小剂量组VSMC凋亡均明显增加,内膜较模型组变薄,尤以芎芍大剂量组为优,提示芎芍胶囊能诱发平滑肌细胞出现凋亡,抑制细胞迁移、增殖,从而抑制AS的发生、发展。

参考文献

[1]Bochaton Piallat ML,Gabbiani F,Redard M,et al.Apoptosis participates in cellularity regulation during aortic inti mal thickening[J].AmJ Pathol,1995,146(5):1059.

[2]沃兴德,丁志山.细胞凋亡与动脉粥样硬化[J].浙江中医学院学报,2001,25(2):76-80.

[3]黄震华.肾素血管紧张素和血管重构[J].心血管病进展,1998,19(5):288-291.

肺动脉平滑肌细胞 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物小鼠 (CD-1) , 雌雄不限, 6周龄, 体重23~33g, 由北京维通利华实验动物有限公司提供。

1.1.2 主要仪器解剖显微镜 (Olympus) ;倒置生物显微镜 (尼康TS-100F) ;普通光学显微镜 (Olympus) ;SHZ-82A水浴恒温振荡器 (金坛市医疗仪器厂) ;微量移液器 (Eppen-dorf) ;pH计 (Sartorious) ;BT25S电子天平 (Sartorious) ;Simplicity纯水系统 (Millipore) ;眼科手术器械 (roboz) ;微离心管。

1.1.3 主要试剂木瓜蛋白酶 (BoMei公司) , 二硫苏糖醇 (Amresco公司) , Ⅱ型胶原酶、台盼蓝、BSA、3%戊巴比妥钠溶液 (Sigma公司) 。

生理缓冲液 (mmol/L) :NaCl 138、KCl 5.3、MgCl21.0、HEPES 10、Glu10, 加NaOH液调pH至7.3;预处理液:1mgⅡ型胶原酶溶于1mL生理缓冲液;分离酶液Ⅰ:1.8mg木瓜蛋白酶、1.5mg DTT、1.4mg BSA溶于1mL生理缓冲液;分离酶液Ⅱ:3.0mg胶原酶、1.4mg BSA溶于1mL生理缓冲液。

1.2 方法

1.2.1 分离颈总主动脉中膜层用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉, 生效后, 剪开颈部皮肤, 分离出颈总动脉, 置于4℃PBS溶液中洗净, 放入预处理液中处理10min, 再放入4℃PBS液中, 置于解剖显微镜下, 用眼科镊子剥离外膜;于内膜上轻划几次, 去除内膜。

1.2.2 消化颈总动脉将所得血管中膜层置于含分离酶液Ⅰ 的微离心管中, 放入37℃ 恒温水浴振荡器中消化25min左右, 弃酶液, 用PBS液清洗2~3次, 置于含分离酶液Ⅱ的微离心管中, 37℃下恒温水浴消化45min左右。弃酶液, 加入适量PBS液, 吹散至溶液中无组织块, 吸取适量于显微镜下观察。

1.2.3 台盼蓝染色观察吸取50μL CCAVSMCs悬液, 加入10μL 0.4%的台盼蓝染色, 使混匀, 室温染色3min, 吸取适量用血细胞计数板在显微镜下观察并计数死细胞数目, 被染色的细胞为死细胞。

1.2.4 免疫荧光法鉴定将分离的CCAVSMCs用PBS漂洗3遍, 用10%的多聚甲醛固定细胞20min, PBS漂洗3次后, 用10%的山羊血清封闭30min, 加大鼠抗calponin单抗 (1∶100) , 4℃过夜, PBS漂洗3次 (1min/次) , 用荧光标记二抗 (1∶50) , 37℃ 避光孵育30min, PBS洗3 次 (1min/次) , 置于荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 平滑肌细胞数量、形态

酶液Ⅰ的消化时间为20、25、30min, 酶液Ⅱ的消化时间为35、40、45、50、55min。显微镜下观察计数显示, 消化分离的原代CCAVSMCs呈圆形, 见图1。酶液 Ⅰ、酶液 Ⅱ 的消化时间分别为25、45min时, 分离的平滑肌细胞在倒置显微镜下数量较多, 为 (50±1.3) 个/低倍视野 (×100) , 与其他时间点比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 且细胞形态最佳, 没有细胞破损, 细胞光滑, 有立体感, 胞质均匀, 背景清晰。另外, 随着两种酶分离时间的延长, 细胞数目虽显著增加, 但个别细胞有轻度破损现象。见表1。

(±s)

注:与其他各时间点比较, *P<0.05。

2.2 细胞存活率

台盼蓝染色后, 共计300个细胞, 其中6个阳性细胞, 即存活率为98%, 说明急性分离的CCAVSMCs存活率高。

2.3 免疫荧光法鉴定

CCAVSMCs细胞经免疫荧光染色, 在低倍显微镜下显示VSMC特异性标记Calponin分子着色为绿色条束状, 细胞核呈淡蓝色, 形态清晰, 细胞核轮廓可见, 证明急性分离所得细胞为平滑肌细胞而非成纤维细胞。

3 讨论

本研究通过对不同分离和消化条件进行摸索, 总结出可获取数量较多、质量较好的CCAVSMCs的方法, 为国内外相关研究提供参考。获取单个细胞会受多种因素的影响, 如颈总动脉外膜及内膜的成功去除、酶消化时间、酶浓度、恒温水浴箱温度、动物个体差异、环境温度、湿度等。以下几点与实验成功率、分离的细胞数目、细胞形态及细胞纯度密切相关: (1) 剥离血管外模和内模:血管中膜层的分离将影响最终消化所得细胞的纯度, 应彻底剥离血管外膜和刮除血管内膜, 由于小鼠动脉小而薄, 内皮细胞数量少, 仅需轻轻刮几次即可[3]; (2) 酶消化时间和浓度:消化时间和浓度是影响细胞质量好坏的主要因素。消化时间过短, 细胞数量较少, 而消化时间过长, 细胞膜会受损[4,5]。酶浓度对细胞分离的作用亦如此; (3) 温度:合适的温度是酶发挥作用的基本条件, 水浴箱温度为37℃时, 所得细胞分离结果最佳。

综上所述, 本研究实验方法可在较短时间内获得较高数量和较大纯度的小鼠颈总动脉平滑肌细胞, 为下一步进行相关疾病研究提供了实验基础。

参考文献

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[4] MESSINA E, DE ANGELIS L, FRATI G, et al.Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart[J].Circulation Research, 2004, 95 (9) :911-921.

肺动脉平滑肌细胞 篇6

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

氟伐他汀(来适可)由北京诺华制药有限公司生产;化痰祛瘀方(组成:半夏15 g,茯苓15 g,丹参20 g,三七10 g,瓜蒌20 g),由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)免疫组化一抗、二抗,购于武汉博士德生物工程有限公司;RT-PCR试剂盒及DNA-marker购于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaLa)。2.5 mm～3.0 mm球囊导管及导丝,压力泵(微创医疗器械上海有限公司);PCR仪(PE-9600美国)、离心机、电泳仪、电泳槽、紫外线分析仪,系统生物显微镜(日本OLYMPUS,BX50F4)、精密轮转切片机(德国LEICA,Rm2135),分光光度计、日本电子公司JEM-100CXⅡ型透射电子显微镜,瑞典LKB公司LKBⅤ型超薄切片机。

1.2 兔动脉内膜损伤模型建立

新西兰兔30只,雌雄不限,体重2.4 kg～2.6 kg(由辽宁中医药大学实验动物中心提供)。随机分为正常组、模型组、氟伐他汀对照组、化痰祛瘀组。正常组6只,其余每组8只。正常组用普通饲料喂养,同时给予生理盐水20 mL每日1次灌胃;其余各组均予以高脂饲料(含胆固醇1%,蛋黄粉5%,猪油6%)每只150 g/d;模型组加用生理盐水20 mL每日1次灌胃;西药对照组加用氟伐他汀10 mg溶于生理盐水20 mL中每日1次灌胃;化痰祛瘀组予中药(浓度0.481 g/mL)20 mL(生药量3.85 g/kg)每日1次灌胃。除正常组外其余各组喂养4周,第5周行球囊导管动脉内膜剥脱术。2%戊巴比妥钠按1 mL/kg耳缘静脉给药麻醉,常规消毒,沿股动脉走行方向逐层钝性分离股动脉,结扎股动脉远端,从近端逆行插入球囊扩张导管20 cm左右,导管顶端达腹主动脉约在膈水平处,向球囊内注射生理盐水,测压约为4个～6 个大气压,继而缓慢回拉球囊到股动脉切口处,如此反复3次,使腹主动脉和骼动脉内皮完全剥脱,拔出导管,结扎股动脉近端,逐层缝合皮肤。术后每天肌注庆大霉素16×104U 1次,连续3 d。继续同前喂养2周。共6周后处死并留取标本。在饲养过程中,正常组、氟伐他汀对照组各死亡 1只;模型组、化痰祛瘀组各死亡 2只。

1.3 指标测定

1.3.1 电镜

实验结束后取腹主动脉损伤严重处,切成1 mm3小块若干,投入2.5%戊二醛,1%锇酸双固定,乙醇、丙酮梯度脱水。环氧树脂EPON812包埋,LKB切片机切片,铅铀双重染色,置JEM-100CX型透射电子显微镜下观察与照相。

1.3.2 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

将取得的标本进行总RNA提取→反转录→PCR扩增→电泳。①引物序列:PDGF-BB上游引物5'-AGG AGG CCC ATC TAC ATC ATC ACC GAG T-3',下游引物5'-CCT TTC ATG TCC AGC CAT GGG CCA CGT-3',扩增片断259bp;c-myc上游引物:5'-ATG CCC CTC AAC GTT AGC T-3',下游引物:5'-AGC TCG CTC TGC TGC TGC T-3',扩增片段为119bp。内参:三磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) G1: 5'-ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG-3';G2:5'-CTC AGT GATA GCC CAG GAT GC-3',347-874计528bp 。94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循环30次,72 ℃ 5 min,取反应液10 μL以含溴乙锭的2%琼脂糖电泳30 min(5 V/cm),紫外分析仪上观察若在259bp和119bp处出现橙黄色条带,则为阳性标本。计算PDGF-BB和c-myc的相对表达强度。

1.3.3 IGF-1免疫组化法检测

按试剂盒说明操作。结果判断:胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)以胞浆黄染为阳性指标,取阳性细胞百分比。

1.4 统计学处理

采用SPSS 11.0软件进行统计学处理,计量资料数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$来表示,治疗后组间对比用 t 检验,P<0.05表示有统计学意义,不同指标间用线性相关分析。

2 结 果

2.1 电镜VSMC形态学观察

正常组:内弹力板呈波浪型。VSMC形态正常,呈梭形;细胞核位于中央,呈梭形,两端钝圆,纵切时呈分瓣状,有凹陷外凸的特征,细胞核中黑色为异染色质,白色为常染色质,细胞核内有核仁;胞浆中线粒体分布在核周边,纵切时线粒体在核尖端,内质网分布在核周边,可见核糖体。VSMC呈“收缩型”表现。模型组:内弹力板增厚呈波浪型。大部分VSMC细胞体积增大,细胞膜不连续,细胞核增大,呈分瓣状,核膜间隙增宽,胞浆内未见完整细胞器,呈增殖期“合成型”表现。也可见核固缩,核膜明显增宽,异染色质明显增多,凝聚在核周边;胞浆内可见线粒体扩张,嵴断裂、消失呈空泡样改变,粗面内质网扩张成池,核糖体脱落,少量糖原颗粒和肌原纤维;细胞体积变小,细胞膜不连续,有断裂,可见密斑。氟伐他汀组:细胞核增大,肌浆内见到线粒体肿胀,粗面内质网扩张,核糖体脱落。化痰祛瘀组:核膜表面凹凸不平,异染色质积聚在核的周边,细胞浆内可见空泡增多,线粒体轻度肿胀核膜间隙增宽。

2.2 免疫组化及RT-PCR结果

2.2.1 免疫组化IGF-1

正常组在血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、泡沫细胞胞浆内IGF-1均呈阴性表达;模型组平滑肌细胞、泡沫细胞、血管内皮细胞胞浆内IGF-1呈强阳性表达,呈棕黄色颗粒。氟伐他汀组及中药化痰祛瘀组在血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、泡沫细胞胞浆内IGF-1均呈阳性表达。

2.2.2 RT-PCR结果(见图1、图2)

泳道1:MARK;泳道2:氟伐他汀组;泳道3:化痰祛瘀组;泳道4:正常组;泳道5:模型组。

2.2.3 化痰祛瘀方对血小板源性生长因子-BB(PDGF)、c-myc、IGF-1表达的影响

模型组PDGF、c-myc、IGF-1均显著高于正常组(P<0.01);氟伐他汀对照组与化痰祛瘀组PDGF、c-myc、IGF-1均较模型显著下降(P<0.05),而两组间无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

3 讨 论

在AS发生发展及RS 形成过程中,VSMCs的作用倍受重视。本实验用兔作为实验动物,采用高胆固醇饲料喂养,配合球囊动脉内膜剥脱法,复制兔动脉内膜损伤模型。于术后2周取材,电镜下观察显示,模型组VSMCs细胞体积增大,细胞膜不连续,细胞核增大,核膜间隙增宽,呈增殖期“合成型”表现,“合成型”适合VSMCs快速增殖和定向迁移的功能。说明术后2周VSMCs明显增殖。化痰祛瘀组内弹力板较模型组完整,增殖水平较模型组低,从形态学方面印证了中药能够抑制VSMC的增殖。

PDGF是强有力的VSMCs增殖和迁移的刺激因子。有研究发现PDGF能刺激中膜VSMCs向合成表型转变,并具有增殖能力[4]。在损伤动脉局部导入PDGF-B受体的反义寡核苷酸可抑制内膜增殖,说明在内膜损伤和血管重构过程中,PDGF可能是主要成分[5]。IGF-1是一种由70个氨基酸组成的单链多肽,分子量约为7.5 kD,其结构与胰岛素原相似。人体内许多组织可以合成IGF-1,但循环中的IGF-1主要由肝脏分泌,此外许多细胞(如血管内皮细胞、VSMC、巨噬细胞和单核细胞等)也可以自分泌或旁分泌的方式合成这一生长因子。有研究发现,IGF-1能促使VSMCs从G1期进入S期及分裂期,开始细胞的DNA合成和有丝分裂,是细胞周期中的进展因子[6]。原癌基因c-myc是一种重要的核蛋白调控基因,在细胞生长调控、细胞分化和损伤修复过程中发挥重要作用。研究发现c-myc 基因的激活是VSMCs增殖的始动因素,细胞增殖的刺激因素首先引起c-myc基因的高表达,随后才出现细胞迅速增生,DNA合成增加[7]。

本实验结果显示,模型组PDGF、c-myc、IGF-1均显著高于正常组(P<0.01),提示PDGF、c-myc、IGF-1表达增加在动脉损伤后平滑肌细胞增殖中起一定作用;而化痰祛瘀组PDGF、c-myc、IGF-1均较模型组显著下降(P<0.05),化痰祛瘀方可有效抑制c-myc、PDGF、IGF-1表达。提示中药既能抑制血管平滑肌细胞增殖启动因子,又有抑制进展因子的作用,并可能通过抑制PDGF、 IGF-1的合成和分泌抑制c-myc基因的表达。本实验只对PDGF和IGF-1两种生长因子进行观察,由于RS是多种生长因子和血管活性物质相互作用的过程,不排除中药对其他生长因子和血管活性物质有调控作用,这些有待进一步的研究。

中医学对RS认识,许多学者认为RS是外源性创伤,属“血瘀证”范畴,治疗上宜活血化瘀。这一理论的提出开辟了中医药防治RS的先河。另有学者指出,PCI术后患者多有精神紧张或抑郁,肝郁气滞,气滞则血瘀,所以术后早期每易出现肝郁血滞;情志变化日久,进而导致忧思伤脾,脾虚气结,气不化津,聚而为痰,或郁怒伤肝,肝郁化火,灼津成痰,痰浊与术后必留之瘀互结,以致脉络不利,痹阻心脉,形成痰瘀交阻之实证。故予化痰祛瘀之方剂:半夏15 g,茯苓15 g,丹参20 g,三七10 g,瓜蒌20 g。方中半夏化痰降逆,茯苓祛湿化痰,丹参、三七活血祛瘀,瓜蒌涤痰宽胸,共奏化痰降浊,活血化瘀之效,使痰瘀化解,血脉得通。

本实验通过西医检测证据,动脉硬化内膜球囊损伤多属瘀血痰阻证,化痰祛瘀方可有效的防治AS和RS的发生发展。AS和RS的病因病机较复杂,很难从某一单一病因病机来解释,因此中药多方位、多靶点的作用更值得探讨。

摘要：目的探讨化痰祛瘀方对兔动脉内膜损伤后血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响。方法将30只新西兰兔随机分为正常组、模型组、氟伐他汀对照组及化痰祛瘀组。正常组6只,其余每组各8只。通过高脂饲料配合腹主动脉内膜剥脱术建立兔动脉内膜损伤模型。取腹主动脉下段,电镜观察血管平滑肌细胞形态;应用逆转录取聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定原癌基因c-myc和血小板源性生长因子-BB(PDGF)水平;免疫组化法测定胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平。结果模型组PDGF、c-myc、IGF-1均显著高于正常组(P<0.01);氟伐他汀对照组、化痰祛瘀组与模型组相比较PDGF、c-myc、IGF-1显著下降(P<0.05)。结论动脉损伤后可致PDGF、c-myc、IGF-1表达增加,提示PDGF、c-myc、IGF-1表达增加在动脉损伤后平滑肌细胞增殖中起一定作用。化痰祛瘀方能使动脉损伤后PDGF、c-myc、IGF-1表达减少,对动脉损伤后平滑肌细胞增殖有一定抑制作用。

关键词：化痰祛瘀方,血管平滑肌细胞,血小板源性生长因子,胰岛素样生长因子-1

参考文献

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肺动脉平滑肌细胞 篇7

我们的前期研究发现采用小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA) 技术下调大鼠主动脉平滑肌细胞( RVSMCs) 中的一种黄素蛋白———醌氧化还原酶2( quinone reductase 2,NQO2) 的表达,可降低细胞内氧自由基( reactive oxygen species,ROS) 的水平,阻抑细胞因子ERK1 /2的磷酸化,从而抑制细胞的增殖[3],但这一过程是否有线粒体的参与尚不十分清楚。本研究通过探讨下调NQO2基因对RVSMCs线粒体膜电位及其氧化还原功能的影响,从而为在亚细胞水平上防治动脉粥样硬化性疾病提供新的途径。

1 材料与方法

1. 1材料及试剂RASMCs购自齐氏生物科技公司;DMEM培养基、胎牛血清、D-Hank's液、胰蛋白酶消化液购自Gibco公司; 50 ml细胞培养瓶、6孔细胞培养板为corning公司产品; 5-溴脱氧尿嘧啶核苷( Brd U) 检测试剂盒、ATP检测试剂盒、超氧化物歧化酶( SOD) 检测试剂盒、细胞色素C检测试剂盒及JC-1线粒体膜电位检测试剂盒均购自南京凯基生物科技公司; 倒置荧光显微镜为Nikon公司产品。

1. 2大鼠主动脉RASMCs的培养与鉴定RASMCs原代细胞贴壁生长于含20% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg /ml链霉素的DMEM培养基中,置于5%CO2、37℃培养箱中培养,每4 d换液1次。待细胞长至80% ~ 90% 融合时用0. 125% 胰蛋白酶消化液传代培养,第3 ~ 8代细胞用于实验。RASMCs呈梭形,具有“峰-谷样”的生长方式。

1. 3 RNA 干扰慢病毒载体感染 RASMCs 及实验分组根据前期研究向上海吉凯基因化学技术有限公司定制针对大鼠NQO2 mRNA的RNA干扰慢病毒载体( Psc-NQO2) 及阴性对照载体( Psc-NC)[4]。RASMCs以1×105个/孔的密度接种于六孔板中,24 h后每孔加入病毒液( 滴度为5×108TU / ml) 10μl,孵育12 ~ 24h后荧光显微镜下观察到绿色荧光的表达时,更换新鲜培养液培养72 h进行后续实验。实验分为3组,野生型即正常的RASMCs,阴性对照组即感染Psc-NC的RASMCs,NQO2下调组即感染Psc-NQO2的RASMCs。

1. 4 Western blotting检测NQO2各组细胞加预冷的细胞裂解液200μl冰浴30 min,4℃、13 000 g离心10min,取上清测定蛋白质浓度。样品经蛋白质电泳后转至PVDF膜。一抗为兔抗鼠NQO2( 1∶400) 和兔抗鼠β-actin( 1∶1000) ,二抗为辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔Ig G,采用化学发光法检测。

1. 5 JC-1法检测线粒体膜电位JC-1是一种具有线粒体膜电位依赖性聚集特性的阳离子染料。线粒体膜电位未降低或降低时,JC-1分别发射红色和绿色检测光,因此可用红色/绿色荧光比值表示线粒体膜电位的降低。弃去旧培养液,用无血清培养基稀释的JC-1溶液( 终浓度为10 mg /L) 对细胞进行染色,37℃孵育30min后弃去染料,用GENios Pro reader ( Tecan公司,瑞士) 进行检测,以红色/绿色荧光比值表示线粒体膜电位的下降情况。

1. 6 Brd U检测细胞凋亡Brd U作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物,可在细胞增殖过程中参与核酸的合成,因此检测Brd U的分布可判断细胞增殖的情况。干预后的细胞在终止培养前用Brd U( 终浓度为30μg /L)于37℃孵育40 min,PBS洗涤细胞3次,甲醇/醋酸固定10 min,依次加兔抗大鼠Brd U单抗( 工作浓度1∶50) 和羊抗兔Ig G ( 1∶200 ) ,用ABC法检测,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及Brd U阳性细胞数。

1. 7 SOD活性及细胞色素C检测均按照试剂盒说明书操作,采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力,采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定细胞色素C水平。

1. 8统计学分析采用SPSS 15. 0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差(±s) 表示,组间计量资料比较采用方差分析( ANOVA) ,P < 0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 RNA干扰降低RASMCs中NQO2水平经western blotting检测,感染Psc-NQO2 72 h后的RASMCs胞浆内NQO2含量较野 生型RASMCs降低约77. 8%( 0. 222∶1) ,而阴性对照组与野生型组比较,细胞内NQO2水平无明显改变( 0. 923∶1) 。见图1。

注: 1 为野生型组,2 为阴性对照组,3 为 NQO2 下调组

2. 2 NQO2下调对RASMCs增殖的影响野生型和阴性对照组RASMCs中Brd U阳性细胞比率分别为( 18. 94±1. 43) % 和( 18. 29±0. 92) % ,而NQO2下调组RASMCs中Brd U阳性细胞 比率为 ( 9. 21±1. 42) % ,明显低于前2组( P < 0. 01) 。所以,NQO2下调可明显抑制RASMCs增殖。见图2。

2. 3 NQO2 下调对 RASMCs 线粒体膜电位的影响NQO2下调组的红色 / 绿色荧光比值为13. 58±0. 12,明显低于野生型的15. 48±0. 41和阴性对照组的15. 96±0. 52( P < 0. 01 ) 。结果显示NQO2下调可使RASMCs线粒体膜电位下降。

2. 4 NQO2下调对RASMCs总SOD活性及细胞色素C的影响NQO2下调组的总SOD活性较野生型和阴性对照组升高,但差异无统计学意义( P分别为0. 224和0. 261) 。而NQO2下调组的细胞色素C水平则明显高于野生型组和阴性对照组( P < 0. 01) 。见表1。

注: 与野生型组和阴性对照组比较,**P < 0. 01

3 讨论

动脉粥样硬化目前被公认为是一种由多因素导致的炎症反应性疾病[5]。殷亚昕等[6]报道辛伐他汀能通过降低动脉粥样硬化大鼠高迁移率族蛋白1及其基因的表达,减轻炎症反应,从而减少动脉粥样硬化斑块的形成。以往研究发现一种具有心血管保护作用的多酚类化合物白藜芦醇可抑制血管平滑肌细胞的增殖,诱导其凋亡,从而实现抗动脉粥样硬化的作用[7],且这种多酚类化合物可与NQO2形成晶体结构从而降低胞浆内的NQO2水平。而利用RNA干扰技术构建的NQO2沉默的K562细胞同白藜芦醇干预的K562细胞具有类似的抗甲萘醌毒性的特性[8,9],所以有学者认为白藜芦醇是通过抑制NQO2实现心血管保护作用的,但其具体的细胞内作用途径和机制尚不十分清楚。

近年来的研究显示线粒体在动脉粥样硬化进程中发挥重要作用。线粒体通过释放过量的ROS导致其自身的功能障碍,从而诱导血管炎症的发生,动脉粥样硬化的发展[10]。线粒体在细胞凋亡过程中也发挥了关键作用,包括caspase激活物的释放、电子转移功能的丧失、线粒体跨膜电位的降低甚至消失,以及Bcl-2等蛋白的功能变化[11]。线粒体跨膜电位的下降是细胞凋亡级联反应过程中较早发生的事件。因此,线粒体跨膜电位是常用的早期检测细胞凋亡的指标之一。

本研究采用以往使用的RNA干扰慢病毒载体感染RASMCs的技术实现下调NQO2基因及蛋白的表达。结果显示与野生型及阴性对照组相比,NQO2下调组RASMCs的增殖受到明显抑制,线粒体膜电位显著下降,同时伴有细胞色素C水平的明显升高,提示NQO2基因的下调可影响线粒体的正常功能,诱导细胞凋亡的发生。

细胞内氧化应激也与细胞凋亡有着密切的关系。线粒体DNA突变可致线粒体呼吸衰竭而造成ROS的生成增加,ROS可进一步诱导线粒体DNA的突变,引起呼吸衰竭和脂质过氧化的形成,如此循环导致细胞损伤[12]。本研究发现NQO2基因下调组的总SOD活性较野生型和阴性对照组有升高,但无统计学差异,提示NQO2基因水平与RASMCs的氧化应激状态有一定关系。

肺动脉平滑肌细胞 篇8

超声微泡造影剂联合诊断超声介导基因靶向传输是一种新型、无创、高效、简便易普及的技术。超声触发破坏微泡方法被认为可作为特定器官的靶基因治疗手段[6]。本研究拟制备兔髂动脉内膜平滑肌细胞增生模型,设计合成针对兔c-myc m RNA原癌基因的寡PNA。采用白蛋白作为原料,在制备超声微泡过程中向白蛋白溶液中加入定量PNA,制备白蛋白超声微泡——PNA靶向载体转染局部血管壁细胞,观察转染效果并评价对血管内皮剥脱后内膜平滑肌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 C-myc m RNA 原癌基因的寡肽核酸设计

对比分析原核及真核动物包括病毒(v-myc)、小鼠、大鼠、兔、羊、猫、狗、猪和人c-myc原癌基因的c DNA序列,发现其自转录起始密码开始下游133~177位共45个碱基序列完全相同。根据核酸探针设计原则设计针对c-myc m RNA的寡肽核酸序列如下(共27个碱基):136位5'-AGCGAGGATATCTGGAAGAAATTCGAG-3' 162位,北京奥科生物技术有限公司合成,其5'- 氨基端以生物素分子标记。

1.2 载 PNA 超声微泡的制备

无菌制备含10%蔗糖的5%(g/ml)牛血清白蛋白液体10 ml,置于有盖50 ml塑料离心管中,加入2 mg合成的PNA并充分混匀,依次用氧气和氟碳气体饱和液体(流量:6 ml/min),约10 min,超声波发生器处理1 min(条件:180 W,固定频率20 k Hz),调整微泡浓度0.8×109~1.8×109个 /ml,PNA含量为0.2 mg/ml,将制备的微泡4℃下密闭保存备用。取部分显微镜观察微泡形态并计数;Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。

1.3 血管造模和超声靶向转染

纯种新西兰兔30只(雄性,2.3~2.5 kg,南方医科大学动物实验中心),随机分组。实验组(n =12):经股动脉插管,球囊剥脱一侧髂动脉内膜造成内膜损伤和增生模型,选择肝脏为超声显影对照器官。术后二维超声经腹壁观察肝脏显影后,经耳缘静脉注入载PNA白蛋白微泡剂5 ml(含PNA 1 mg),观察到肝脏显影明显增强,立即经皮行局部受损血管治疗性超声照射(超声频率1 MHz,强度1.5 W/cm2,6 min),观察到肝脏超声显影逐步恢复至正常。实验对照组(n =10):球囊剥脱内膜后经静脉输入等量含裸PNA1 mg的10%蔗糖的5%牛血清白蛋白液体及同等条件的超声治疗。对照组(n =8):球囊剥脱内膜后经静脉输入等量生理盐水及同等条件超声治疗。

1.4 取材和病理检查

术后1周气体栓塞处死动物,取实验髂动脉血管大体观察后石蜡包埋,常规病理活检,石蜡包埋切片行HE、马氏三色、弹力纤维染色,真彩色病理图像分析仪(Leica)直接进行血管内膜形态测量,免疫组织化学染色。

1.5 原位转基因效果检测

石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,PBS及SSC洗并加入稀释的HRP-Streptavindin,37℃孵育,1×biotin wash solusion洗后加入TrueblueTM染色和Orcein对比染色(以上试剂由晶美生物工程公司提供),二甲苯透明并封片。阳性产物为在胞浆或细胞核内蓝绿色颗粒状沉淀物。计数各段动脉横切面血管壁200个细胞所占的阳性细胞数,计算阳性细胞百分率作为转染率。

1.6 免疫组织化学染色

采用标记抗生蛋白链菌素生物素法(LSAB法)并按试剂盒说明书操作。I抗体为小鼠抗SMCαactin单克隆抗体 (DACO,1︰200稀释) 和小鼠抗PCNA单克隆抗体(DACO,1︰100稀释),由福建迈新公司提供。计数各段动脉横切面内膜中200个细胞所占的PCNA阳性细胞数,求其平均值作为实际计数。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理,实验数据用均数±标准差(±s)表示,组间差异用方差分析,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声微泡的物理表征

制备的超声微泡呈圆球形囊泡状,大小较一致,分散良好,直径2~5μm。经过4℃保存2周后未发生微泡融合、破裂,形态学上未发生改变,计数与新制备的微泡溶液差异无统计学意义,热稳定性良好(40℃,30min)。

2.2 靶向转 PNA 效果

实验对照组和对照组血管壁均未见PNA转染阳性细胞。实验组阳性细胞主要分布在增生的内膜,平均计数为(67.25±25.10)个 / 每200个内膜细胞,转染率为33.63%(见图1、2),血管中层偶见个别阳性细胞。

2.3 血管壁病理及免疫组织化学改变

球囊损伤兔髂动脉后1周见内皮缺失,内膜增厚,内膜细胞明显增多,管腔变窄,可见血栓形成(见图3)。免疫组织化学显示大多数细胞抗α-actin抗体反应阳性,反映这些增生细胞是SMC;部分细胞显示PCNA阳性,表明这些细胞增生较为活跃(见图4)。与对照组和实验对照组相比,实验组内膜厚度及内膜面积的测量值明显较低;PCNA阳性细胞计数也较少,表明反义PNA显著抑制局部血管内膜SMC增生和内膜增厚。见附表。

注:1)与对照组和实验对照组比较,P <0.05;2)与对照组和实验对照组比较,P <0.01

3 讨论

尽管反义PNA具有特异性强、稳定性好等特点,并可能在基因的复制、转录和翻译等环节抑制或下调靶基因的表达,达到治疗疾病的目的,但目前存在的问题是作为药用PNA不易进入细胞,进一步提高组织和细胞对反义PNA的摄入量以及反义PNA的抑制活性一直是影响其广泛应用于临床的关键问题[7]。细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是近年研究较多的促进PNA进入细胞的分子载体工具,它是一种含约30个氨基酸残基的短链肽分子,可促使所载药物在细胞外向细胞内跨膜运动而容易进入细胞。目前CPPs主要分为两类,一类可直接与药物化学连接促进其进入细胞;另一类与药物形成稳定的共价复合物。体内、外研究显示它可携带多种治疗性分子包括小的化学分子、核酸、蛋白、肽类(包括PNA)、脂质体和微粒等进入细胞[8]。尽管各种CPPs能够提高细胞对PNAs的摄入,但这种PNA-CPPs结合物活性如反义抑制作用有限[9]。因此,有人试图对其进行化学修饰如连接一个脂质基团[10]、一种光敏物质,抑或与一种合成的高分子纳米粒结合以提高PNA-CPPs的反义活性[11]。虽然如此,PNA作为药物针对特定细胞或组织的靶向性仍未得到解决。

超声造影技术的不断发展和可携带基因的微泡声学造影剂的研制,使得超声已经从一种临床诊断工具进入到治疗领域,将二者结合起来用于肿瘤或心血管疾病等的治疗,为这些患者提供一条安全、高效的治疗途径[12]。其基本原理为:1超声造影剂是基因的良好载体,与病毒载体相比容量大,可携带反义寡核苷酸等任意片断DNA;2超声照射可在特定空间(聚焦区)和特定时间破坏造影剂微泡,产生空化效应和声化学效应,使周围靶细胞(包括血管内皮细胞和组织细胞)间隙增宽,膜通透性增大,细胞表面一过性小孔形成(声孔效应),同时微泡破裂时产生的冲击波、微声流作为一种驱动力量,促使微泡上释放出来的基因,通过破裂的微血管和内皮细胞间隙进入靶细胞[13]。以白蛋白为原料制备的超声微泡具低毒性、低免疫原性、低侵袭力、器官特异性、可重复应用以及广泛的适用性,作为携带治疗基因的载体,这些微泡携带DNA的量从100~2 mg不等,单用超声照射可使裸DNA对血管内皮细胞的转染率提高10倍,如联合使用微泡造影剂,则可使基因的转染率提高3 000倍[14]。以往在制备超声微泡基因载体或药物载体时,大多是先制备微泡,然后再将其与基因或药物连接,被载物位于超声微泡表面,这种结合的稳定性和承载量较难估计,因而靶向转基因或靶向给药的量和效果较难控制[15]。本研究考虑到设计的PNA在结构上属肽类,其物理性状与白蛋白相似且不荷电,与白蛋白间不产生理化作用,同溶于水,首次制备超声微泡的同时在白蛋白溶液中加入定量PNA,使其包被于微泡壁白蛋白基质中并成为微泡壁结构的一部分。这种方法制备的超声微泡在循环中,当其通过受损血管局部超声照射区域时发生瞬间破坏并促使从微泡壁中释放出来的PNA进入血管壁,尤其是内膜增生活跃的SMC,成功获得c-myc反义PNA分子在局部血管壁的靶向转染。