深度探讨COPD患者血清细胞因子与肺功能的相关性

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 是一种具有气流受限为特征的疾病, 气流受限不完全可逆、呈进行性发展, 与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。其发病率高, 死亡率高, 社会经济负担重, 已成为一个重要的公共卫生问题。目前应用细胞因子拮抗剂治疗COPD是一条新的途径, 目的是改善或缓解肺功能的减退, 但究竟哪种细胞因子对患者的肺功能影响较明显尚无定论。TNF-α, IL-8, GM-CSF是近年来发现与COPD的发生、发展有密切相关的细胞因子, TNF-α增高的患者的体重明显减轻, 病人体质下降反复感染, 但是与否肺功能减退存在确切的相关性少有报道及IL-8, GM-CSF是否影响肺功能尚无报导, 对此我们设计了本实验, 旨在观察这些因子与肺功能的相关性, 为临床治疗COPD提供有效的治疗手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

JAEGER呼吸驱动仪——德国;AVL-995全自动血气分析仪——瑞士;CUSTO vit m肺功能仪——德国;SPECTRA-Ⅲ分析仪——比利时;Olympus光学显微镜——日本;电热恒温水浴箱——中国上海;钢制纱头鼻夹——德国;洗板器与光密度仪——德国;Olympus纤维支气管镜日本低温离心机——德国;超低温冰箱——日本三洋;干燥箱——上海跃进医疗器械厂。

1.1.2 试剂

TNF-α试剂盒——第四军医大学免疫室;IL-8试剂盒——晶美生物工程有限公司;GM-CSF试剂盒——北京邦定生物医学公司;百令胶囊——中美华东制药有限公司

2.2 研究对象与分组

对照组:从健康查体的人群中随机选取56例, 女性26例, 男性30例, 平均年龄 (65±5.6) 岁, 与患病组无差异, 并排除影响肺功能、血清TNF-α, IL-8, GM-CSF的疾病, 如过敏性哮喘、急性肺部感染, 急性心肌梗死等。

患病组:从2003~2004年重庆某医院呼吸科门诊筛选稳定期COPD患者56例, 女性27例, 男性29例, 平均年龄 (64±6.7) 岁。COPD的诊断依据2001年4月美国国立心、肺、血液研究所 (NHLBI) 和世界卫生组织 (WHO) 共同制定的《慢性阻塞性肺疾病全球倡议》 (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease, GOLD) 及2002年中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》 (简称《指南》。结合相应病史, 危险因素接触史, 体征, 应用支气管扩张剂后的肺功能指标等综合分析, 按照《指南》提供的临床严重度分级标准将COPD患者分为Ⅰ (n=17例) 、Ⅱ (n=20例) 、Ⅲ (n=19例) 组。分级标准:

Ⅰ级:FEV1/FVC<70%, FEV1≥80%预计值, 有或无慢性咳嗽、咯痰症状。

ⅡA级:FEV1/FVC<70%, 50%≤FEV1<80%预计值, 有或无慢性咳嗽、咯痰、呼吸困难症状。

ⅡB级:FEV1/FVC<70%, 30%≤FEV1<50%预计值, 有或无慢性咳嗽、咯痰、呼吸困难症状。

Ⅲ级:FEV1/FVC<70%, FEV1<30%预计值或FEV1<50%预计值伴呼吸衰竭或右心衰竭的临床征象。注:COPD稳定期:指咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或症状轻微至少在3个月以上。为了研究方便, 本试验将ⅡA, ⅡB和成1组, 统称为Ⅱ组。选取COPD患者。

治疗组:从每组患病组中随机选取10名患者, 分为ⅠT、ⅡT、ⅢT组。

3 体格检查及病史采集

(1) 采取问卷形式, 面对患者及其共同居住亲属认真详实填写调查表格的基本资料、居住情况、吸烟史、个人及家族史。

(2) 体格检查包括血压、身高、体重、心肺状况等指标, 填写相关项目。

于晨8~10时清醒状态吸支气管扩张剂 (喘乐宁200μg) 后应用肺功能仪反复3次测肺功能, 取最高值, 记录FEV1, FVC, FEV1/FVC等指标, 最后确定患者分组。FEV1, FVC的采集以爆发力、快速、用力、深长呼气时所测得的肺活量, 并可得到FVC曲线 (F-V曲线) 与呼气流速峰值 (PEF) , 要求测定过程中呼气时间不少于6秒, 且要有≥2秒的平段, 每次至少要有3个合格曲线, 总次数<8次, 环境温度在17℃至40℃之间。可以得到一秒钟用力呼气容积 (FEV1) 和一秒钟用力呼气容积占用力肺活量的百分比 (FEV1%即FEV1/FVC) 。

于晨8~10时抽取静脉血10m L, 室温状态下静置1h, 放在低温离心机中, 以3000转/min离心10min, 取血清放入2mL的EP管中, 储存在-70℃的冰箱中保存, 待测TNF-α, IL-8, GM-CSF。

4 实验室检查

4.1 IL-8测定

采用双抗夹心ELISA法。抗人IL-8单抗包被于酶标板上, 人血清中的IL-8会与单抗结合, 未结合的将被洗去。加入生物素化的抗人IL-8 (二抗) , 它将与结合在单抗上的IL-8结合而形成免疫复合物。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合, 多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。IL-8的浓度与OD (450nm) 成正比。

4.2 TNF-α测定

采用抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人TNF-α单抗包被于酶标板上, 标准品和样品中的TNF-α与单抗结合, 加入生物化的抗人TNF-α抗体, 形成免疫复合物连接在板上, 辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合, 加入酶地物OPD, 出现黄色, 加终止液硫酸, 颜色变深, 在492nm处测OD值, TNF-α浓度与OD值成正比, 可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-α浓度。

4.3 G-CSF测定

采用抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人G-CSF单抗包被于酶标板上, 标准品和样品中的G-CSF与单抗结合, 加入生物化的抗人G-CSF抗体, 形成免疫复合物连接在板上, 辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合, 加入酶地物OPD, 出现黄色, 加终止液硫酸, 颜色变深, 在492nm处测OD值, TNF-α浓度与OD值成正比, 可通过绘制标准曲线求出标本中G-CSF浓度。

5 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析与统计学图表的绘制, 于各数据进行描述性分析、正态性检验与方差齐性分析。在描述性分析中, 对于正态分布的数据, 用均数±标准差表示, 正态分布的2组数据经方差齐性检验后,

对方差齐者应用t检验, 对方差不等的数据采用t检验。发病组与对照组、发病组之间用单因素方差分析 (oneway ANOVA) , 发病组中在给药前后行配对t检验。

6 结果

56名健康对照组血清中的TNF-α, IL-8, GM-CSF值分别为 (14.70±6.95) pg/mL, (26.70±1.40) pg/mL, (46.33±16.20) pg/mL, 实验Ⅰ组血清中TNF-α, IL-8, GM-CSF平均值分别为 (18.36±7.79) pg/mL, (70.31±2.29) pg/mL, (91.07±17.38) pg/mL。Ⅱ组中TNF-α, IL-8, GM-CSF的值分别为 (22.56±8.78) pg/mL, (84.49±5.61) pg/mL, (106.78±11.98) pg/mL。Ⅲ组中三者指标分别为 (28.46±9.47) pg/mL, (100.37±4.90) pg/mL, (146±18.85) pg/mL。这3种因子在3组之间存着差异 (P<0.05) , 其中Ⅲ组中TNF-α, IL-8, GM-CSF的血清水平最高。

治疗组:口服百令胶囊30d后 (每天3次, 每次5粒) , ⅠT组中血清中TNF-α, IL-8, GM-CSF水平分别是 (11.05±2.90) pg/mL, (41.26±23.27) pg/mL, (35.37±9.98) pg/mL。ⅡT组血清中TNF-α, IL-8, GM-CSF的水平分别是 (15.39±4.23) pg/mL, (79.48±5.64) pg/mL, (70.72±18.98) pg/mL。ⅢT组中血清中TNF-α、IL-8、GM-CSF水平分别是 (20.07±5.20) pg/mL, (93.12±7.71) pg/mL, (62.19±12.83) pg/mL。可以看出, 血清中TNF-α, IL-8, GM-CSF水平在治疗后有明显下降 (P<0.05) 。ⅠT组中血清中TNF-α, IL-8, GM-CSF水平降低幅度分别为45.3%, 41.3%, 61.1%。ⅡT组36.2%, 8.9%, 41.8%。ⅢT组29.5%, 7.2%, 31.6%。ⅠT组中FVC, FEV1和FEV1/FVC分别是 (2.96±0.42L) , (2.45±0.26) L/S和 (0.80±0.14) 。ⅡT组FVC, FEV1, FEV1/FVC分别是 (2.45±0.29) L, (2.02±0.40) L/S, (0.72±0.11) 。ⅢT组FVC, FEV1, FEV1/FVC分别是 (1.99±0.33) L, (1.77±0.44) L/S, (0.66±0.12) 。可以看出治疗后FEV1, FVC, FEV1/FVC明显的改善 (P<0.05) , 其中FVC, FEV1在ⅠT组中改善为28.3%, 32%。FVC, FEV1在ⅡT组为23.3%, 23.1%。ⅢT组15.7%, 22.1%。

患病组TNF-α, IL-8, GM-CSF与FEV1, FVC存在着明显的负相关, 其中TNF-α与FEV1, FVC负相关系数分别是r=-0.476, -0.465。IL-8与FEV1, FVC负相关性分别是r=-0.358, -0.365。GM-CSF与FEV1, FVC负相关性分别是r=-0.302, -0.226。随着血清中TNF-α, IL-8, GM-CSF水平的增高, FVC, FEV1明显下降 (P<0.01) 。治疗前后在光镜下观察肺组织慢性纤维增生无明显改善。

摘要：本文基于笔者多年从事慢性阻塞性肺病的临床工作经验, 以其血清细胞因子与肺功能的相关性为研究对象, 通过将临床数据与实验数据的结合分析, 探讨了二者的相关性分析结果, 全文是笔者临床经验基础上的理论升华, 相信对从事相关工作的同行有着重要的参考价值和借鉴意义。

关键词：慢性阻塞性肺病,血清细胞,肺功能