禽流感血凝抑制试验中鸡红细胞吸附鸭血清非特异性凝集因子方法的建立

2023-02-13

目前, 在采用鸡红细胞悬液进行血凝抑制试验检测鸭血清中禽流感抗体时, 常常存在非特异性凝集现象, 导致在结果判定时, 鸡红细胞不流淌或流淌不完全, 给结果判定造成严重干扰。鉴于实验室的条件限制, 难以采集鸭红细胞进行同源血清抗体检测, 普遍采用鸡红细胞悬液进行检测。禽流感血凝抑制试验中鸡红细胞吸附鸭血清非特异性凝集因子方法的建立分别对鸡红细胞悬液与样品血清吸附处理的取液量配比、吸附时间以及鸡红细胞浓度进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

抗原:禽流感病毒H5亚型 (re-6) 血凝抑制试验抗原, 哈尔滨维科生物技术开发公司。血清:20份新鲜鸭血清。

1.2 仪器用品

96孔90ºV型微孔板和BIOHIT可调移液器。

1.3 方法

1.3.1 红细胞悬液制备

1%、5%、10%、20%鸡红细胞悬液。1%鸡红细胞悬液按GB/T18936-2003方法制备。5%、10%、20%鸡红细胞悬液分别按照0.5、1、2 m L鸡红细胞原液溶于10 m LPBS制得。鸡红细胞原液在最后一次洗涤离心后去掉上清液后制得。

1.3.2 血凝抑制试验

按照GB/T18936-2003[1]。

1.3.3 鸡红细胞悬液与样品血清吸附处理的取液量及配比的确定

因本法采用在微孔板中逐孔加入待检血清和鸡红细胞悬液进行吸附, 为确保吸附处理后的样品上清液大于血凝抑制试验检测样品量0.025 m L, 并且不稀释样品致影响样品抗体效价测定, 故以1∶1配比吸附;同时, 加入微孔中的液体总量不至于溢出, 本法采用0.05 m L鸡红细胞吸附0.05 m L鸭血清。

1.3.4 吸附时间的确定

参考GB/T18936-2003中HA及HI试验中抗原抗体吸附时间在30~40 min, 为保证鸡红细胞对鸭血清非特异性凝集因子的最大限度的吸附及完全沉淀出上清液, 本法吸附时间采用60 min。

1.3.5 用于吸附的鸡红细胞悬液浓度的研究

鸡红细胞悬液吸附预处理及分组试验。为了寻求鸡红细胞悬液吸附处理鸭血清中非特异性凝集因子的最佳浓度, 选取5%、10%、20%, 30%鸡红细胞吸附预处理后进行对比试验, 以比较其检测效价和判定效果。在微孔板中进行吸附处理, 加贴膜覆盖以防挥发, 轻震后静置1 h, 吸取0.025 m L上清进行检测。

按以下5个分组进行鸭血清禽流感H5亚型抗体效价检测, 用1%鸡红细胞悬液对20份直接测定为7log2的不同鸭血清进行血凝抑制试验抗凝集效果统计。A组:直接测定;B组:0.05 m L待检血清+0.05 m L 5%鸡红细胞悬液吸附后测定;C组:0.05 m L待检血清+0.05 m L 10%鸡红细胞悬液吸附后测定;D组:0.05 m L待检血清+0.05 m L20%鸡红细胞悬液吸附后测定;E组:0.05 m L待检血清+0.05 m L 30%鸡红细胞悬液吸附后测定。

2 结果

4种测定方法凝集现象去除效果对比见表1;5种测定方法血清效价具体结果见表2 (效价单位为Log2) 。

表1中, 凝集数A:仅1~2孔出现凝集的份数;凝集数B:2孔以后出现凝集的份数;不凝集数:不出现凝集现象的份数;凝集率B:凝集数B/30, 其下降可反映去除两孔以后非特异性凝集因子的效果[2];去除凝集率:不凝集数/30, 其上升可反映完全去除非特异性凝集因子的效果。表2中, 将B、C、D方法分别和A法进行了比较, 结果表明B、C、D法测得的效价与A法差异不显著 (P) 。

3 讨论

从表1结果来看, 鸭血清经10%、20%、30%鸡红细胞吸附处理后, 非特异性凝集率 (总凝集率) 由A法的100%下降至C、D法的95%、75%、75%, 表明鸡红细胞吸附法能明显去除非特异性凝集因子。经10%、20%、30%鸡红细胞吸附处理后, 2孔以后的非特异性凝集率 (凝集率B) 由A法的95%下降至C、D、E法的30%、25%、25%, 表明.10%.20%鸡红细胞吸附在去除2孔以后的凝集现象效果均明显;去除凝集率由C法5%上升到30%、25%, 可见20%、30%鸡红细胞吸附处理比10%鸡红细胞吸附更能去除2孔以内的非特异性凝集因子甚至完全去除单个样品的凝集现象, 从表2结果来看, 鸭血清中非特异性凝集因子会使抗体效价出现1~2个滴度的误差, 因此有必要去除。

4 小结

试验表明30%、20%、10%鸡红细胞悬液吸附处理比5%鸡红细胞悬液吸附处理, 更明显降低血清中非特异凝集的影响, 10%及以上浓度鸡红细胞悬液即可对鸭血清中非特异性凝集因子明显去除, 20%、30%鸡红细胞悬液吸附在去除非特异性凝集上整体效果相当。出于便于鸡红细胞悬液制备的考虑, 采用较低鸡红细胞浓度, 即20%鸡红细胞悬液应用于日常检测进行对鸭血清废特异性凝集因子的去除。

摘要：禽流感血凝抑制试验中, 建立鸡红细胞吸附鸭血清非特异性凝集因子方法, 分别对鸡红细胞悬液与鸭血清吸附处理的取液量配比、吸附时间以及鸡红细胞浓度进行探讨。在确定取液量配比、及吸附时间后, 通过对同一批鸭血清样品分别经不同浓度的鸡红细胞悬液吸附处理后进行一系列对比试验, 找出鸡红细胞悬液吸附处理鸭血清中非特异性凝集因子的最佳浓度。对比发现, 采用在96孔90o微孔板中逐孔加入0.05 m L待检血清和0.05 m L20%鸡红细胞悬液吸附1 h以上能够获得理想效果。

关键词：禽流感抗体,非特异性凝集因子,鸡红细胞吸附,鸭血清