甲维盐合成工艺中的杂质研究

甲维盐(EmamectinB1benzoate)中文全名为4’-表-甲氨基-4’-脱氧阿维菌素B1苯甲酸盐,是阿维菌素下游合成的一种衍生物,其通常具有高效、少毒和无公害等相关生物特性,因而作为一种抗生素被广泛应用在农业领域[1]。据报道,阿维菌素的同系物主要存在8个,即:B1a、A2a、B2a、A1a、A1b、A2b、B1b和B2b,其中前四个同系物占主要成分,总含量高达80%以上[2](图1)。然而,Emamectin B1 benzoate是一种主要以阿维菌素B1(B1a和B1b)为起始原料合成的一种抗生素,因此本研究可以通过控制阿维菌素杂质组分的含量(除B1以外)来提高甲维盐的收率,进一步深入研究阿维菌素中的杂质组分对甲维盐收率的影响。

阿维菌素(Avermectins)是一种由链霉菌中的灰色霉菌发酵产生的次生代谢产物[3],一度被称为继青霉素之后抗生素类药物的再一次技术创新[4]。其表观颜色为白色晶体粉末,m.p为:155～157℃,b.p为:717.52℃,P为:2×10-7Pa,ρ为:1.16g/cm3;在21℃的条件下,各溶液的溶解度分别为:甲苯350g/L、三氯甲烷25g/L、无水甲醇19.5g/L、二氯甲烷(氯化亚甲基)7g/L、水10μg/L;K为:9.9×103,在常温常压下较为稳定,不易发生水解(PH=5～9)。

1.材料与条件

(1)材料

安捷伦高效液相色谱仪(AgilentTechnologies1200 InfinitySeries,紫外检测器)、电子天平(BSA3202S-CW)、旋转蒸发仪(RE-2000A)、圆底烧瓶、分液漏斗、定量瓶、量筒、玻璃棒、甲醇、冰醋酸、纯化水、二氯甲烷 (氯化亚甲基)、阿维菌素。

(2)色谱条件

用反相硅胶ODS柱(250毫米×4.6毫米,5微米)作为色谱柱,柱温:30℃,流速:1.0ml/min,进样量:10µl;检测波长:294nm;流动相solventA为:甲醇,流动相solventB为:0.2%冰醋酸/水。流动相的梯度洗脱条件如表1。

2.实验步骤

(1)线性储备液的制备

准确称取阿维菌素5.0mg,置于10ml的定量瓶中,随后再加入氯化亚甲基,震荡使其溶解,定容至量程即得线性储备液。随后准确量取0.25ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、 4.00ml阿维菌素的线性储备液,置于50ml的定量瓶中,继续再加入氯化亚甲基,震荡使其溶解,定容至量程,作为线性1、2、3、4、5溶液,待用。

(2)对照样品的制备

取甲维盐收率正常的氧化液200ml置于分液漏斗中,加纯化水100ml水洗两次(去除水溶性杂质),随后弃去水相、浓缩有机相至浸膏,再向浸膏中加5ml的二氯甲烷搅拌溶解,过0.22µm滤膜,置于4℃作为对照样品、待测;以上步骤重复3次,分别编号A-1,A-2和A-3。

(3)供试样品的制备

取甲维盐收率较低的氧化液200ml置于分液漏斗中,加纯化水100ml水洗两次(去除水溶性杂质),随后弃去水相、浓缩有机相至浸膏,再向浸膏中加5ml的二氯甲烷搅拌溶解,过0.22µm滤膜,置于4℃作为供试样品、待测;以上步骤重复3次,分别编号B-1,B-2和B-3。

3.实验结果与讨论

据报道,阿维菌素现今有8个组分,由于相对含量占比(≥80%)较高的主要4个组分,即A1a、A2a、B1a和B2a,而A1a、A2a和B2a相对于主要成分B1a来说都是杂质,因此,本实验主要分析研究阿维菌素中杂质组分A1a、A2a和B2a对主要成分B1a的影响,以致最终影响甲维盐的合成收率。

本实验通过HPLC分析方法并根据极性出峰顺序(反相色谱柱中极性大的先出峰),测得阿维菌素主要组分的峰面积如表2,其对照组A和实验组B的色谱图如图2。

根据表2的数据结果表明:(1)主要组分的出峰顺序:B2a>A2a>B1a>A1a;(2)实验组B的B1a含量较对照组低14.111%;(3)阿维菌素主要组分的含量顺序为: B1a>A2a>B2a>A1a,除主成分B1a以外,A2a、B2a和A1a都是杂质,并且杂质组分A2a影响最大,其含量较对照组A高7.531%,严重影响主成分的含量;(4)杂质组分的含量顺序为:A2a>B2a>A1a。

(1)线性

测得回归方程式为:

y=1.9996x+0.4179,R2为:0.9998,线性范围为: 7.81～250.00μg/ml。

(2)重复性

测得对照组A和实验组B主成分B1a的峰面积的RSD值分别为0.43%、0.79%。

(3)专属性

取空白样品(二氯甲烷)、对照样品和供试样品分别进样,结果显示空白样品对对照样品和供试样品无干扰,对照样品和供试样品中的各待测组分保留时间基本一致。

4.小结

本实验用了HPLC分析方法对阿维菌素有关杂质组分进行了考察,空白样品基线平稳无干扰,主成分与其相邻杂质组分色谱峰的分离度R(resolution)不小于1.5,两个相邻杂质组分色谱峰之间的分离度R(resolution)不小于1.0,检测效果良好。实验结果表明,阿维菌素中影响主峰含量的杂质主要有A2a、B2a和A1a,并且影响程度的顺序为: A2a>B2a>A1a。因此,这三个主要杂质组分值得我们今后做更深入的研究,对控制甲维盐的合成收率有一定的实用价值。

摘要：甲维盐是一种以阿维菌素B1为原料合成的抗生素,阿维菌素中的主要杂质有A2a、B2a和A1a,且对主峰B1a含量的影响程度为:A2a>B2a>A1a,从而间接影响甲维盐合成的收率。

关键词：阿维菌素,A2a(B2a和A1a),甲维盐,收率

参考文献

[1] 王圣印,周仙红,张安盛,等.甲氨基阿维菌素苯甲酸盐研究进展[J].江西农业学报,2012,24(12):123-126.

[2] 王广成,张忠明,高立明,等.阿维菌素的作用机理及其应用现状[J].植物医生,2006,19(1):4-5.

[3] 李艳芳.阿维菌素类药物的研究及应用[J].北方牧业,2005 (14):26-26.

[4] Fish Farm Advisory Group.Emamectin BenzoateAn Env-ironment Risk Assessment.Scottish Environment Protection Agency,1999:1-23.