老年心血管病医学信息论文提纲

论文题目：中国东北地区汉族人群AdipoQ多态性与冠心病的关联研究

摘要：一、背景冠心病（CHD）和其他心血管疾病（CVDs）是工业化国家和发展中国家所面临的一个巨大挑战。与其他疾病相比,每年死于心血管疾病的人数较多。据估计,2012年心血管疾病的死亡人数约为1750万（占非传染性疾病死亡总人数的46%）,其中死于冠心病的人数有740万,死于中风的人数有670万。全球非传染性疾病（NCD）和可持续性发展目标（SDG）的关注的焦点是：约三分之一冠心病死亡者为30-70岁之间的成年人。据估计,1990-2020年全球冠心病所造成的伤残调整寿命年（DALYs）将由4700万上升到8200万。因此,冠心病应该引起人们足够的重视,达到完全预防和控制该疾病的目的。事实上,冠心病等非传染性疾病不仅能影响人群的健康状况和死亡率,还能对经济产生巨大影响,是导致贫困发生的主要原因。目前,专业化医疗服务正日益完善,心血管疾病等慢性病需要负担更为昂贵的治疗方案和长期的个人护理费用。与西方国家相比,中国人群冠心病的死亡率相对较低,但中国人群的冠心病人数正逐年增加。中国城市和农村地区冠心病死亡人数分别占心血管疾病死亡人数的22%和13%,冠心病已成为造成心血管疾病死亡的第二个主要原因。随着中国经济的增长和人口寿命的延长,冠心病的医疗保健、发病和死亡所造成的费用支出将大部分由国家卫生部门承担。冠状动脉粥样硬化通常被认为是导致冠心病发生的病理基础,但该病的确切病因和病理生理学机制仍然未知。许多研究显示,冠心病是一种由多种因素所造成的复杂疾病,包括环境因素、生活方式和遗传易感性,以及这些因素之间的交互作用。与冠心病和其他心血管疾病遗传学方面有关的资料在学术文献中均有据可查。某些基因、基因簇以及基因的多态性都能参与冠心病的发生和发展。环境因素等非遗传因素也可影响冠心病的发展,研究提示一些环境因素与冠心病的病因有关。流行病学研究和家系研究均表明,冠心病发病风险的40%-60%可由遗传易感性来解释,因此,对冠心病采取全方位的治疗和预防也应该改变遗传危险因素的影响。此外,由遗传因素和环境因素共同作用导致的高胆固醇血症的治疗过程中也应该考虑改变遗传因素的影响。常见基因变异包括单核苷酸多态性（SNPs）,许多有关常见基因变异与某些疾病易感性的关联研究结果表明,常见基因变异能影响常见病的易感性。目前认为AdipoQ基因及其编码的脂联素蛋白与冠心病有关联。已有研究报道AdipoQ基因上的一些单核苷酸多态性位点（如rs3774261、rs1063537和rs2082940）与许多疾病有关,包括冠心病、肥胖、糖尿病、类风湿关节炎、高血压和心肌梗死等。许多学术文献报道,AdipoQ基因单核苷酸变异与脂联素水平之间的关联较强。许多研究已证明脂联素具有抗动脉粥样硬化、保护心脏、抗炎和抗血栓的作用。一些研究结果显示,脂联素水平降低（低脂联素血症）与冠心病风险升高有关,而脂联素水平增加可防止冠心病的发生。然而,另有一些研究结果表明脂联素血症与心血管疾病之间的关联程度较弱或无关联,尤其是妇女和老年人群。Luc等的研究认为在外表健康的男性人群中,循环中脂联素总体水平不是冠心病事件的独立预测因子。许多研究显示,遗传因素和环境因素在多因素疾病（也称复杂性疾病,如冠心病）的发生发展过程中均发挥重要作用。非遗传因素对心血管疾病发生和发展过程的影响也已被识别。吸烟、饮酒、久坐、缺乏体育锻炼、饮食习惯和许多其他社交活动等日常生活方式均能影响冠心病的发生。虽然全基因组关联研究（GWAS）已识别出许多与疾病状态有关的各种基因单核苷酸多态性位点,但要发现由这些疾病相关遗传变异所导致相应疾病病因的确切分子或细胞机制仍然很困难。实际上,现有的基因变异与疾病或性状的关联研究速度和这些关联的功能机制研究速度并不同步。可以尝试通过预测小RNA （miRNA）结合位点来研究基因单核苷酸多态性导致异常性状或疾病的机制。miRNA属于小RNA基因产物,它以碱基互补配对的方式来调节信使RNAs （mRNAs）的活性。在动物体内,miRNA能调节基因的翻译表达,它还能与成熟目标mRNA的3’非翻译区（3’UTR）位点互补结合,miRNA主要调控（抑制）目标mRNA翻译过程,但其机制仍然有待进一步研究。许多已经发表数据表明,AdipoQ基因与某些疾病有关联,如糖尿病、高血压、冠心病和代谢综合征等。既往有关AdipoQ基因多态性与冠心病及其他心血管疾病之间的关联研究结果并不一致,而且大多数都是在动物模型、欧洲或其他西方国家的人群中开展的研究。由于已报道的AdipoQ基因单核苷酸变异与心血管疾病的关联研究结果存在不一致性,因此需要采用meta分析法综合分析现有的研究结果,并最终得出定量性结论。1976年,Gene Glass,创造了一个术语"meta分析”来指代一种将大量个人的研究分析结果收集起来进行统计分析,以达到整合调查结果的目的。Meta分析是使用统计方法将不同研究的结果相结合的过程。Meta分析历来被用于整合临床随机试验,其中样本量小,导致不稳定的估计结果,但meta分析可以将每个研究进行标准化。在生物医学科学中,meta分析有着悠久的历史,它通过利用一些独立研究的信息对感兴趣的问题进行系统,有组织,有结构化的评价。流行病学研究的meta分析的主要目标是：1)综合各个研究的估计到一个综合的估计,在探索低关联的原因上起至关重要的作用；2)为了深入了解研究具体估计之间的关系和研究具体特点,可以通过meta分析在进一步的研究中回答相同或类似的问题。对于有矛盾和争议的研究问题,就像AdipoQ基因单核苷酸多态性和冠心病之间的关联研究的meta分析一样,不仅仅是要解决结论不一致的问题,而且还可以给出更正确的结论。如果在面对具有挑战性的问题,特别是医疗行业无法利用系统综述和meta分析的原则和技术,将会导致资源丢失。一个典型的常被引用的失败的例子是,在20世纪50年代到70年代,由于听了医生错误的指导,以趴着的姿势睡觉,而引起超过10万的婴儿突然婴儿死亡综合症,经过大约半个世纪以后,研究的证据表明这很可能是有害的。今天,meta分析是解决医学界许多问题的非常重要的工具。据资料可知,在中国北方汉族人群中开展冠心病风险与AdipoQ基因变异（rs3774261、rs1063537和rs2082940）的关联研究尚未见报道。在本文的研究人群中需要调查脂联素水平及该水平是否与冠心病和其他变量有关。此外,有关AdipoQ基因活性的单一研究也未见报道,如meta分析、关联研究、环境因素交互作用、脂联素蛋白相关性和功能性研究。本研究的主要研究目的如下。研究目的：为进一步了解冠心病/心血管疾病与AdipoQ基因变异之间的关联,本研究设计了以下具体研究目标：1.根据已经发表的数据结果,总结有关AdipoQ基因变异与CVD关联的最新完整信息。这部分研究主要是在数据库中广泛搜索CVD与AdipoQ基因SNPs之间关联的相关研究。2.在中国东北地区汉族人群中研究冠心病与AdipoQ基因上3个SNPs位点之间的关联（rs3774261、rs1063537和rs2082940）。这部分为流行病学研究,所有研究对象为中国东北地区汉族人群,收集DNA样本并分析人口学数据和生物化学数据。3.在本研究人群中探索AdipoQ基因变异与环境因素之间的可能交互作用对冠心病的影响。这部分研究包括分析冠心病和环境因素（饮酒、吸烟、TG、LDL-C、HDL-C口FBG水平）之间的关联,AdipoQ基因SNPs与以上环境因素之间的交互作用对冠心病的影响。4.在中国东北地区汉族人群中研究血液中脂联素水平分别与AdipoQ基因SNPs及冠心病之间的关联。测量血浆脂联素水平,探讨其与冠心病、年龄、性别和AdipoQ基因变异之间的相关性。5.应用生物信息学技术预测AdipoQ基因上3个SNPs位点（rs3774261、rs1063537和rs2082940）的1niRNA结合靶点。运用不同的生物信息学数据库来预测能与本研究3个SNPs位点的：mRNA靶点相结合的：miRNA。二、材料与方法1. Meta分析1.1检索策略、文献纳入和排除标准：检索PubMed、EMBASE、中国知网（CNKI）、中国生物医学文献数据库网络版（CBMDisc）、维普、万方数据库中2015年12月31日前发表的关于AdipoQ基因多态性与冠心病的关联研究的文献。运用多种检索词结合进行检索,例如：“冠心病”或“冠状动脉疾病”或“心血管疾病”或“缺血性心脏病”或“心绞痛”或“中心肌梗死”或“中风”或“动脉粥样硬化”或“动脉硬化”或“冠状动脉狭窄”结合"ADIPOQ’或‘’APM1’或“ACDC’”或“脂联素基因”并结合“多态性”或“突变”或“基因关联研究”。文献纳入标准如下：1)具有足够的数据评估疾病（冠心病/冠状动脉疾病/心血管疾病/心肌梗死）与ApdipoQ基因单核甘酸多态性之间的关联；2)有原始数据；3)对于AdipoQ基因多态性位点rs266729、s2241766、rs1501299,纳入的文献必须至少包括上述三个位点之一与冠心病发病风险关联的数据：4)语言为英语或汉语。文献排除标准为：1)文献中有重复数据；2)文献的语言不是英语或者汉语；3)文献一些信息缺失（基因型分布）,尤其是在联系通讯作者后,未能提供所需的信息。对于有重复病例或对照的文献,最新发表或者能提取数据量最大者纳入meta分析。基因组扫描文献不纳入meta分析。文献质量评价和数据提取：纳入meta分析的每篇文献质量均经过评估,并由两名研究人员提取数据。总结提取的信息并整理成表格,以备meta分析。1.2统计学分析：运用等位基因计数法从纳入文献中获得等位基因频率。通过对比AdipoQ次要等位基因与常见等位基因,评估等位基因的作用。利用比值比（OR）及其95%可信区间（95%CI）衡量AdipoQ基因多态性与冠状动脉疾病的易感性之间的关联。采用Q检验中的卡方检验进行异质性检验,I2衡量异质性大小。运用反变量随机效应模型合并所有的OR,并采用Z统计量分析合并的OR的统计学显著性。基于研究的结局（冠心病和所有其他的结局指标）、基因分型技术（PCR-RFLP, TaqMan或者其他）、研究对象（对照组与病例组）、人种（欧洲人、东亚人、西亚人和非洲人）、样本量（＜1000和≥1000）、质量评分（＜10和≥10）进行亚组分析。采用敏感性分析评估每篇文献对于合并OR的作用。此外,还进行累积性meta分析并检验发表偏倚。运用遗传模型（显性模型、隐性模型、共显性模型）分析基因与冠心病之间的关联性。对于纳入meta分析的3个SNPS进行单独分析。本研究运用STATA 12进行统计学分析。除特殊说明外,P＜0.05则认为有统计学意义。2.关联研究（AdipoQ突变-冠心病关联；基因-环境交互作用；脂联素水平与冠心病/AdipoQ突变/其他研究的变量）2.1研究对象：采用病例-对照研究的设计,招募冠心病患者754例,对照760例,共1514名研究对象。病例来源于吉林大学第一医院和吉化总医院。对照与病例年龄、性别相匹配,且与病例同期。本文研究对象为相互间无血缘关系的中国北方汉族人。数据从2011年9月份开始收集,直至2012年11月。本研究获得吉林大学公共卫生学院伦理委员会的审查与批准。所有研究对象均签署《知情同意书》。2.2流行病学调查和生化检查：运用标准化信息检索工具（调查问卷）收集研究对象的人口学资料和临床资料。吸烟定义为在过去的一个月内每天至少吸烟一支,或者既往吸烟,即使至少一个月内完全不吸烟。饮酒定义为饮用各种含酒精成分的饮料,每周至少一次。由两名有经验的心血管病医生诊断冠心病,诊断依据WHO有关冠心病的诊断标准,且经冠脉造影证实（至少有一支主动脉狭窄程度＞50%）。运用心电图和临床表现确定对照不患有冠心病。对照无糖尿病和高血压病史。抽取研究对象静脉血至抗凝、有机玻璃管中,并储存于-20℃。2.3 SNP的选择,DNA提取和基因型检测：运用HapMap网站和软件Haploview4.2选择AdipoQ基因的3个SNPs （rs3774261、rs1063537和rs2082940）。利用血液基因组提取试剂盒（ClotBlood DNA kit,康为,北京,中国）提取基因组DNA。采用标准聚合酶链反应（PCR）扩增基因组DNA样本。运用Assay Design 31引物设计软件设计PCR的引物。SNP位点的基因型检测采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术。运用紫外分光光度计,波长取260nm和280nm,检测DNA的纯度和浓度。之后进行电泳、PCR扩增和聚集分析。分别对盲样本和非盲样本进行检测,要求重合率大于99.99%。2.4脂联素水平与冠心病/AdipoQ突变／其他研究的变量：本研究共检测了83例冠心病患者和81例对照者的血浆脂联素含量。每个研究对象采集3m1血液样本,在3500×g离心10分钟后储存于-80℃温度下直至进行测量。血浆脂联素水平检测使用Abeam贸易有限公司生产的人类脂联素ELISA试剂盒,且所有实验步骤均依据该试剂盒说明书进行操作。2.5统计学分析：计量资料采用均数和标准差描述,组间比较运用t检验；计数资料采用频数和构成比描述,组间比较则采用卡方检验。年龄的界值为60岁,脂联素水平的界值为6μg/ml。根据规定的界值生成虚拟变量,变量值小于等于界值,则定义为0,变量值高于界值,定义为1。AdipoQ基因多态性与冠心病之间的关联研究运用多因素logistic回归分析。采用协方差分析法（analysis of covariance）分析每个SNP位点的不同基因型之间脂联素水平的差异。采用软件SPSS 21.0和在线软件SNPStats （http://bioinfo.iconcologia.net/SNPStats）进行统计分析。除特殊说明外,P＜0.05则认为有统计学意义。3. MicroRNA巴基因预测本研究利用AdipoQ基因及其3个SNP位点（rs3774261.rs1063537和rs2082940）的序列信息,检索了3个生物信息学数据库（miRGator、miRDB和RegRNA 2.0）,进而预测能与AdipoQ基因及其3个SNP位点靶向结合的miRNAs。根据相应的步骤在3个数据库中检索所需信息,总结、分析并解释输出的结果。三、结果1.Meta分析在本文第一部分中,广泛在PubMed、EMBASE、中国知网（CNKI）、中国生物医学文献数据库网络版（CBMDisc）、维普、万方数据库中,检索2015年12月31日前已发表的AdipoQ单核苷酸多态性与冠心病关联研究的文献。利用meta分析,总结并提供AdipoQ单核苷酸多态性与冠心病关联研究的全面、最新信息。在此次meta分析中,经过文献检索和严格的文献筛查后,纳入了63篇文献,共66个研究。研究对象共49108例,其中,病例组18250例,平均年龄为60.00岁,BMI的平均值为26.27；对照组30,858例,平均年龄为57.22岁,BMI的平均值为25.88。本研究纳入了AdipoQ的三种突变,分别为rs266729 [-13770＞G]、rs2241766 [+45 T＞G]、rs1501299 [+276 G＞T]。位点rs266729[-1377C＞G]纳入的文献数量是30,对照组中rs266729 [-1377C＞G]的MAF平均值为0.26；位点rs2241766 [+45 T＞G]纳入的文献数量是40,对照组中rs2241766 [+45 T＞G]的MAF平均值为0.21；位点rs1501299[+276 G＞T]纳入的文献数量是45,对照组中rs1501299[+276 G＞T]的MAF平均值为0.32。在位点rs266729突变研究中,36.7%的研究结果显示AdipoQ突变与心血管疾病存在关联（P＜0.05）,其中,30.0%的研究结果表明AdipoQ突变是心血管疾病的危险因素,6.7%的研究结果表明AdipoQ突变是心血管疾病的保护因素。在rs2241766突变研究中,有50.0%的研究显示AdipoQ突变与心血管疾病存在关联（P＜0.05）,其中,45.0%的研究结果表明AdipoQ突变是心血管疾病的危险因素,5.0%的研究结果表明AdipoQ突变是心血管疾病的保护因素。在位点rs1501299突变研究中,35.6%的研究结果显示AdipoQ突变与心血管疾病存在关联（P＜0.05）,其中,24.4%的研究结果表明AdipoQ突变是心血管疾病的危险因素,11.1%的研究结果表明AdipoQ突变是心血管疾病的保护因素。在rs266729突变的meta分析中,共纳入28487例,包括病例组10249例,对照组18238例。研究结果表明rs266729突变与心血管疾病存在关联（OR=1.142,95%CI：1.037-1.259,P=0.007）,研究存在异质性（,=78.1%,P＜0.001）。在rs2241766突变的meta分析中,共纳入25876例,包括病例组10347例,对照组15529例。研究结果表明rs2241766突变与心血管疾病存在关联（OR=1.198,95%CI：1.087-1.319,P＜0.001）,研究存在异质性（I2=69.4%,P＜0.001）。在rs1501299突变的meta分析中,共纳入37598例,包括病例组13054例,对照组24544例。研究结果表明rs1501299突变与心血管疾病不存在关联(（OR=0.936,95%CI:0.943-1.122,P=0.050）,研究存在异质性（I2=63.3%,P＜0.001）。显性模型下,本研究发现AdipoQ rs266729突变和rs2241766突变均与心血管疾病有关联（OR=1.216,95%CI：1.078-1.372,P=0.002；OR=1.229,95%CI：1.099-1.374,P＜0.001）,但是rs1501299突变与心血管疾病无关联（OR=0.948,95%CI：0.874-1.027,P=0.192）。AdipoQ突变与心血管疾病之间的关联性可能与AdipoQ突变与血浆脂联素水平存在关联有关。研究表明AdipoQ突变会在一定程度上影响血浆脂联素水平和血浆脂联素亚型水平。脂联素具有抗动脉粥样硬化、保护心血管、抗炎、抗血栓的作用,低脂联素水平（低脂联素血症）与心血管疾病的发病风险相关,较高的脂联素水平是心血管疾病的保护因素。然而,也有研究发现,脂联素血症与心血管疾病之间仅存在微弱或无显著关联性,尤其是在老年人群和女性中。目前有关AdipoQ单核苷酸多态性与心血管疾病关联研究的meta分析中,得出研究结果并不一致,这可能是由于在不同种族中,遗传因素和环境因素存在一定程度的差异,进而影响了AdipoQ多态性对脂联素水平的作用。亚组分析显示不同的变异情况有不同的结果。敏感性分析没有发现任何一篇文章影响整体的OR。本研究发现在rs2241766变异研究中存在发表偏倚,但是在rs266729和rs1501299变异研究中没有发现发表偏倚。rs266729亚组分析：对基因型、研究对象、研究人群和文献质量评分进行亚组分析。七个研究明确指出他们的结局是冠心病。这些研究的结果显示rs266729的G等位基因与冠心病有统计学关联（OR=1.554.95%CI:1.056-2.285,P=0.025）,而其他研究却没有显示这种关联（OR=1.090.95%CI:0.998-1.191,P=0.055）。利用P CR-RFLP基因检测方法提示rs266729的G等位基因与冠心病存在关联（OR=1.462,95%CI:1.117-1.914,P=0.006）,而其他检测方法没有发现关联（TaqMan:OR=1.031,95%CI:0.935-1.137, P=0.544; OR=1.065,95%CI:0.927-1.223,P=0.374）。本研究结果显示,在对照组人群中rs266729的G等位基因与冠心病存在关联（OR=1.217,95%CI：1.071-1.384,P=0.003）,而在病例组不存在关联（OR=1.035,95%CI：0.886-1.209,P=0.666）。对rs266729的多态性meta分析包括了欧洲和东亚人群,研究结果显示在东亚人群,rs266729的G等位基因与冠心病有明显关联（OR=1.364,95%CI：1.116-1.667,P=0.002）,但是在欧洲人群中不存在关联（OR=1.022,95%CI：0.948-1.102,P=0.564）。在文献质量评分的亚组分析中,发现在文献质量评分小于10分组,rs266729的G等位基因与冠心病有明显关联（OR=1.318,95%CI：1.093-1.589,P=0.004）,而在评分大于10分组不存在关联（OR=1.019,95%CI：0.940-1.105,P=0.646）。rs2241766亚组分析：对基因型、研究对象、研究人群和文献质量评分进行亚组分析。十一个研究明确指出他们的结局是冠心病。这些研究的结果显示rs2241766的G等位基因与冠心病有统计学关联(（OR=1.225,95%CI:1.022-1.468,P=0.028）。结果显示其他研究的rs2241766突变也同样与冠心病的发生存在关联(（OR=1.188,95%CI: 1.057-1.335,P=0.004）。在对基因型检测方法的亚组分析中,本本文结果显示,利用PCR-RFLP方法的研究和合并方法的研究均发现rs2241766的G等位基因与冠心病存在关联（OR=0.68,95%CI:0.52-0.90,P=0.006; OR=1.201,95%CI:1.039-1.389, P=0.013）,但是利用TaqMan检测方法的研究中没有发现关联（OR=1.053,95%CI：0.905-1.225,P=0.504）。在正常人群和患病人群中均发现rs2241766的G等位基因与冠心病存在关联（OR=1.159,95%CI：1.039-1.292, P=0.008; OR=1.336,95%CI:1.095-1.630,P=0.004）。在对rs2241766的多态性研究中包括欧洲、东亚、西亚和非洲人群,本文的研究结果显示在东亚和西亚人群rs2241766的G等位基因与冠心病存在关联（OR=1.203,95%CI：1.044-1.386,P=0.010；OR=1.591,95%CI：1.284-1.970,P=0.000）,但是在欧洲和非洲人群不存在关联（OR=1.066,95%CI：0.933-1.217,P=0.348；OR=1.757,95%CI：0.907-3.403,P=0.095）。在文献质量评分的亚组分析中,发现在文献质量评分小于10分组,rs2241766的G等位基因与冠心病存在关联（OR=1.385,95%CI：1.182-1.624,P＜0.001）,而在评分大于10分组不存在关联（OR=1.028,95%CI：0.943-1.122,P=0.530）。rs1501299亚组分析：对基因型、研究对象、研究人群和文献质量评分进行亚组分析。八个研究明确指出他们的结局是冠心病。这些研究的结果显示的rs1501299的T等位基因与冠心病有统计学关联（OR=0.860,95%CI:0.694-1.065,P=0.166）。结果显示其他研究rs1501299的突变也同样与冠心病存在关联（OR=0.950,95%CI:0.886-1.017,P=0.142）。在基因型检测方法的亚组分析中,任何一种测序方法都没有发现rs1501299的T等位基因与冠心病存在关联：PCR-RFLP（OR=0.913,95%CI:0.795-1.048,P=0.196）,TaqMan方法（OR=0.960,95%CI:0.859-1.074,P=0.478）和其他的合并方法（OR=0.933,95%CI：0.838-1.039,P=0.209）。在病例组中,rs1501299的T等位基因与冠心病存在关联（OR=0.845,95%CI：0.770-0.927,P＜0.001）,而在对照组中未发现rs1501299与冠心病存在关联（OR=0.976,95%CI:0.901-1.058,P=0.551）。rs1501299多态性研究的研究人群包括欧洲,东亚,西亚和非洲人群。本文的研究结果显示,在欧洲,东亚,西亚和非洲人群中rs1501299的T等位基因与冠心病均不存在关联（OR=0.944,95%CI:0.889-1.003,P=0.062；OR=0.950,95%CI:0.833-1.083,P=0.440;OR=0.819, 95%CI:0.573-1.171,P=0.275；OR=0.848,95%CI:0.629-1.143,P=0.278）。在文献质量评分的亚组分析中,本研究发现在文献质量评分小于10分组和评分大于10分组,rs1501299的T等位基因与冠心病均无关联（OR=0.930,95%CI：0.831-1.041,P=0.209;OR=0.940,95%CI:0.868-1.018,P=0.130）。（结果图表请见英文部分）2.AdipoQ单核苷酸多态性与冠心病之间的关联采用病例-对照研究,在中国东北地区汉族人群中探讨AdipoQ单核苷酸多态性位点（rs3774261、rs1063537和rs2082940）与冠心病的关联,以及AdipoQ与环境因素（吸烟、饮酒、血脂等）的交互作用对冠心病的影响。本研究共招募研究对象1514名,为相互间无血缘关系的中国东北地区汉族人,包括754名冠心病患者和760名对照。病例来源于2011年9月至2012年11月期间吉林大学第一医院和吉化总医院心内科确诊的冠心病患者。由至少两名经验丰富的心血管医生完成冠心病的诊断,并通过冠脉造影进一步确定诊断的结果。对照来源于同期吉林大学第一医院和吉化总医院的体检者。对照为与病例性别、年龄相匹配的,心电图正常、无冠心病临床症状和体征者。在病例组中,男性404例,女性350例,对照组中有男性378例,女性382例,两组间性别分布的差异无统计学意义（P=0.14）；病例组的平均年龄为63.12±8.05,对照组的平均年龄为63.10±8.37,两组的平均年龄的差异亦无统计学差异（P=0.96）,说明病例组与对照组的年龄和性别相匹配。与对照组相比,冠心病组的TC,TG和LDL-C水平较高,HDL-C水平较低。与对照组相比,冠心病组有更多的吸烟和饮酒者（饮酒：14.2% vs.7.2%,吸烟：50.1% vs.11.6%）。本文的结果显示吸烟和饮酒与冠心病存在关联,为冠心病的危险因素（OR=7.677,95%CI:5.895-9.997, P＜0.001; OR=2.120,95%CI:1.505-2.985, P＜0.001）。基因型DNA样本由754例冠心病患者和760例对照组成。位点rs3774261、位点rs1063537和位点rs2082940的检出率分别是98.88%,99.01%和98.88%。病例组和对照组在rs3774261位点的基因型分布和等位基因频率上差异均具有统计学意义（χ2=24.75, P＜0.001; χ2=21.33, P＜0.001）。在rs2082940位点,病例组与对照组间基因型分布的差异具有统计学意义（χ2=4.36,P=0.04）；而两组间等位基因频率的差异不具有统计学意义（χ2=0.34,P=0.562）。对于rs1063537位点来说,病例组和对照组的基因型分布和等位基因频率上的差异均不具有统计学意义（χ2=2.60, P=0.27;χ2=2.01, P=0.16）。显性模型下,携带rs3774261位点G等位基因的研究对象患冠心病的风险较高（OR=1.74,95%CI：1.39-2.18,P＜0.001）,携带rs2082940位点T等位基因的研究对象患冠心病的风险较低（OR=0.80,95%CI:0.66-0.99, P=0.035）, rs1063537位点C等位基因与冠心病的发病风险无关联（OR=0.85,95%CI：0.69-1.04,P=0.110）,提示AdipoQ对冠心病可能既存在保护作用,又可能是其危险因素,如在本研究中,rs3774261位点G等位基因可能是冠心病的危险因素,rs2082940位点的T等位基因可能是冠心病的保护因素。Lacquemant等研究表明AdipoQ rs224166突变增加糖尿病病人患冠心病的风险,而Bacci等研究发现AdipoQ rs1501299突变与冠心病发病风险降低有关,这些研究也表明AdipoQ在冠心病发生发展可能发挥双重作用,与本文的研究结果相一致。本研究单体型分析的结果显示,在冠心病患者中,AdipoQ基因多态性位点rs3774261、rs1063537、rs2082940组成的单体型共有GCC、ATT、ACC三种；在对照组中,AdiooQ基因多态性位点rs3774261、rs1063537、rs2082940组成的单体型主要有GCC、ATT、ACC、ACT四种,上述四种单体型频率之和为99.19%。在本研究中,仅在对照组中发现ACT单体型,频率为1.99%。与冠心病组相比,ATT单体型和ACC单体型在对照组中频率较大。携带单体型ATT的研究对象患冠心病的风险是携带单体型GCC的0.78倍（OR=0.78,95%CI：0.65-0.93,P=0.0068）；携带单体型ACC的研究对象患冠心病的风险是携带单体型GCC的0.74倍（OR=0.74,95%CI:0.62-0.88, P＜0.001）。在对照组中,AdipoQ的4个单核苷酸多态性位点不同基因型间,TG水平、TC水平、LDL-C水平和HDL-C水平的差异均没有统计学意义（P＞0.05）。基因和环境因素均影响心血管疾病的发病风险,此外,研究表明心血管疾病的遗传风险受到特定环境因素的调节,即基因与环境因素之间存在交互作用。在本研究的基因和环境的交互作用分析中,结果显示,HDL-C水平分别与AdipoQ rs1063537位点（P=0.034）和rs2082940位点存在交互作用（P=0.033）,未发现HDL-C水平与rs3774261位点存在交互作用（P=0.708）,说明环境因素在冠心病发生发展中的起到重要的作用。在本次研究中,未发现AdipoQ单核苷酸多态性与其他环境因素（吸烟,饮酒,TG, LDL-C和FBG）之间存在交互作用（P＞0.05）。（结果图表请见英文部分）3.血浆脂联素水平本部分研究对象共包括83例冠心病患者和81例对照者,每人采集3ml的血液样本。应用Abcam贸易有限公司生产的人类脂联素ELISA试剂盒检测研究对象血浆脂联素水平分析性别、年龄、冠心病和AdipoQ基因多态性对血浆脂联素水平的影响。研究结果显示,未发现性别和年龄对血浆脂联素水平有影响（性别：P=0.991；年龄：P=0.447）,提示在本研究中性别和年龄对血浆脂联素水平可能无影响。而既往有研究表明女性血浆脂联素水平高于男性,与本研究结果不一致,需要扩大样本量进一步验证分析。冠心病患者的血浆脂联素水平低于对照者（病例组：7.70±4.96,对照组：12.85±3.98,P＜0.001）,提示在北方汉族人群中,冠心病患者血浆脂联素水平与冠心病发病风险呈负关联。采用协方差分析方法分别在冠心病组、对照组和所有研究对象中分析AdipoQ基因三个多态性位点（-3774261、rs1063537和rs2082940）对血浆脂联素水平的影响,结果显示各个基因型间的脂联素水平差异不具有统计学意义（P＞0.05）,提示AdipoQ基因多态性对血浆脂联素水平无影响。该结果与Apalasamy等在马来西亚人群中的研究结果相一致,但另有其他研究显示AdipoQ基因多态性可影响血浆脂联素水平,与本文的结果不一致,这可能与本研究的样本量较小有关。4. MicroRNA靶基因预测目前对于AdipoQ基因变异与脂联素水平之间的关联仍存在争议,现有研究结果也未能解释冠心病患者血浆脂联素水平降低的原因。由于miRNA能与AdipoQ基因的3’UTR区域互补结合,调控基因表达的转录后过程,进而抑制脂联素蛋白的翻译,因此本研究检索了3个生物信息学数据库（miRGator、miRDB和 RegRNA 2.0）,进而预测能与AdipoQ基因及其3个SNP位点靶向结合的miRNAs。通过检索miRGator数据库,仅发现一种miRNA （hsa-miR-199a-star）能与AdipoQ基因靶向结合。进一步检索显示,除了AdipoQ基因之外,hsa-miR-199a还能与另外612个基因的mRNA相结合,但hsa-miR-199a与大多数靶基因mRNA的结合强度较弱。在miRDB数据库中,本研究预测发现有62个miRNAs能够靶向结合AdipoQ基因,同时发现分别有20、36和41个miRNAs能够靶向结合AdipoQ基因的rs3774261、rs1063537和rs2082940位点,在预测出的41个与AdipoQ基因3’UTR处rs2082940位点靶向结合的miRNAs中,得分最高的2个miRNAs为hsa-miR-4657和hsa-miR-4491。以上结果与L agana等人的研究结论相一致,提示单个miRNA通过与目标mRNA的部分序列互补结合的方式来调控不同基因的转录过程,而且多个miRNAs也能共同调节单个基因的转录过程。因此,能与AdipoQ基因靶向结合的miRNAs同时也能调控其他基因的表达,如本研究中预测的hsa-miR-199a也可靶向调节SPARCLl和ACTA2基因,进而影响多种疾病的发展过程。本研究利用RegNA数据库来识另AdipoQ-miRNA结合的结构模体,将rs3774261、rs1063537和rs2082940位点的序列信息输入该数据库后进行检索。检索结果发现与AdipoQ基因rs3774261位点互补结合的miRNAs有hsa-miR-4655-3p（caccgtggacctgatgaagaa）和hsa-miR-323b-5p（aatgtactcaccgtggacctgat）,没有检索到与AdipoQ基因rs1063537和rs2082940位点靶向结合的1niRNAs。（结果图表请见英文部分）四、结论1.本研究的meta分析结果表明,rs266729和rs2241766的G等位基因是冠心病的易感基因,而rs1501299的T等位基因与冠心病无关联。在冠心病与rs2241766的关联性研究中存在异质性和发表偏倚。2.在东北地区汉族人群中,对AdipoQ基因的三种变异（rs3774261、rs1063537和rs2082940）与冠心病的关联进行研究,发现AdipoQ基因的单核苷酸多态性对冠心病的发病可能具有双重作用,即携带rs2082940位点的T等位基因是冠心病的保护性因素,携带rs3774261位点的G等位基因是冠心病的危险因素。3.在东北地区汉族人群中冠心病患者血浆脂联素水平与冠心病的发病风险呈负关联。4.通过检索生物信息数据库,针对rs3774261、rs1063537和rs2082940三个位点,预测了多个与AdipoQ结合的miRNAs,识别出AdipoQ-miRNA结合的结构模体,并发现hsa-miR-4657和hsa-miR-4491可与AdipoQ 3’UTR的rs2082940结合。

关键词：

学科专业：流行病与卫生统计学

Abstract

摘要

Chapter 1 Review of Relevant Literature

1.1 Cardiovascular diseases

1.1.1 General overview of the global impact of coronary heart disease andother cardiovascular diseases

1.1.2 CHD and other cardiovascular and circulatory diseases burden in China

1.1.3 Causes or risk factors associated with CHD

1.2 AdipoQ(adiponectin,C1Q and collagen domain containing)

1.2.1 Overview and structure of AdipoQ

1.2.2 Association of AdipoQ SNPs with CVDs

1.3 Adiponectin

1.3.1 Adiponectin discovery,structure and forms

1.3.2 Functions of adiponectin

1.3.3 Association of adiponectin with AdipoQ polymorphisms

1.3.4 Association of adiponectin with CVDs

1.4 MicroRNA(miRNA)target prediction and application in CAD diagnosis

1.5 Meta-analysis

1.6 Research main objectives

Chapter 2 Methods and Materials

2.1 A meta-analysis on the association between CVD and single nucleotidevariants of AdipoQ

2.1.1 Search strategy

2.1.2 Inclusion and exclusion criteria

2.1.3 Assessment of study quality

2.1.4 Data extraction

2.1.5 Statistical analysis

2.2 Association studies

2.2.1 Study participants

2.2.2 Ethical statement

2.2.3 Epidemiological survey and biochemical examination

2.2.4 SNP selection

2.2.5 DNA extraction

2.2.6 SNP genotyping

2.2.7 Adiponectin measurement

2.2.8 Statistical analyses

2.3 MicroRNA target prediction

2.3.1 Sequence used

2.3.2 Databases searched

2.3.3 Search Procedure

Chapter 3 Results

3.1 Results of meta-analysis

3.1.1 Overall results

3.1.2 Meta-analysis for the rs266729(-11377C>G)variant

3.1.3 Meta-analysis for rs2241766(+45T>G)polymorphism

3.1.4 Meta-analysis for rs1501299(+276 G>T)polymorphism

3.2 Association between Coronary Heart Disease(CHD)and the rs3774261,rs1063537 and rs2082940 variants of the AdipoQ gene

3.2.1 Demographics and lipid profile of participants

3.2.2 SNPs information

3.2.3 Lipid profiles in different SNP genotypes and alleles in controls

3.2.4 Participants' genotypes distributions and allelic frequencies

3.2.5 Associations between AdipoQ gene polymorphisms and CHD risk

3.2.6 Pairwise linkage disequilibrium among the three SNPs

3.2.7 Haplotypes of AdipoQ Gene with the risk of CHD

3.2.8 CHD risk associated with smoking and drinking

3.2.9 Interaction between AdipoQ SNPs and environmental factors in CHD 94

3.2.10 Distribution of adiponectin levels (μg/ml) by gender and age in cases and controls

3.2.11 Comparison of plasma adiponectin levels (μg/ml) between CHD cases

3.2.12 Distribution of adiponectin levels by genotypes

3.2.13 Comparisons of adiponectin levels by genotypes in cases and control

3.3 MicroRNA Target prediction

3.3.1. Prediction results from the miRGator database

3.3.2 Prediction results from the miRDB database

3.3.3 Prediction results from the RegRNA database

Chapter 4 Discussion

4.1 Meta-analysis on the association between CVD risk and single nucleotidevariants of AdipoQ

4.2 Association between CHD and the rs3774261, rs1063537 and rs2082940variants of AdipoQ

4.3 Gene-environment interactions in CHD

4.4 Association between plasma levels of adiponectin and AdipoQ variants,CHD, gender and age

4.5 MicroRNA target prediction

4.6 Study Limitations

4.7 Study novelty

Chapter 5 Conclusions

References

Short introduction of author

Acknowledgement