正交设计在黄连中小檗碱提取实验教学中的应用

在天然药物提取教学中, 通常需要设计提取流程, 这需要对流程中每一步的条件进行优选, 如果提取条件选择适当, 则实验步骤少就能达到满意的结果, 实验设计不当, 次数既多结果也不见得满意。因此, 合理引导学生参与实验流程的设计, 既能培养学生对学习天然药物化学的兴趣, 又能让学生培养学生科学分析问题的能力。

1 正交表的介绍

正交表是安排实验、分析实验简单而容易掌握的一种工具, 它是根据数理统计原理归纳出来的一种合理安排实验的一种表格, 现以最简单的正交表L4 (23) 对正交表的结构作出说明, 见表1。

以上正交表中, L代表“正交”之意;L底部的数字为正交表中的横行数为实验数, 即本表可安排4次实验;括号内的底数为本实验的水平数, 本实验可安排2个水平;括号内的指数为表中的列数, 表示本实验可安排的因子数, 本实验最多可安排3个因子。

常见的正交表格有:L4 (23) , L8 (27) , L16 (215) , L32 (231) ……, 此类为2n正交表;L9 (34) , L27 (313) ……, 此类为3n正交表;L16 (45) ……, 此类为4n正交表。在实验过程中可根据不同的需要选择不同的正交表。

2 正交表的选用

实验设计法分为两大类:一为全面试验法, 二为部分实施法。例如, 在“从黄连中提取小檗碱”实验中, 如果要设计一个六因子三水平的实验, 如果所有因子的水平搭配都做一次试验 (即全面试验法) , 共要做36=729次, 这样的安排是很费时的。因此, 在实验设计中通常采用部分实施法, 根据实验研究的目的及自己所掌握的专业知识, 只挑选部分因子和水平的搭配做试验, 合理选用正交表进行设计, 就能有效地减少试验次数而达到研究目的。

2.1 最少需超过的实验数确定

对于没有交互作用的实验次数: (水平数-1) ×因子数+1。

存在交互作用的实验次数: (水平数-1) ×因子数+交互作用因子自由度×交互作用因子数+1。

2.2 选用正交表

在“从黄连中提取小檗碱”实验中, 如设计为4因子2水平, 最少需超过的实验次数为 (2-1) ×4+1=5, 因水平数是2, 所以只能从2n因子正交表中选实验稍大于5的正交表, 即L8 (27) 表。同理, 如实验为8因子3水平, 如果考虑因子1与因子2、因子1与因子3有交互作用, 故最少需超过的实验次数为 (3-1) ×8+ (3-1) (3-1) ×2+1=25, 须选L27 (313) 表。

3 黄连中小檗碱的提取实验设计

3.1 水平与因素的确定

根据盐酸小檗碱提取条件, 该次学生实验讨论选定以浸泡黄连粗粉的稀硫酸浓度、稀硫酸的用量、石灰乳调碱度的pH和趁热抽滤后用盐酸调pH的温度为提取因子, 每个因子设计为三水平, 不考虑因子间交互作用, 则最少实验次数为 (3-1) ×4+1=9, 本实验以L9 (34) 正交实验进行设计, 因子水平表 (见表2) 。

3.2 小檗碱提取精制

按学生人数, 称取黄连粗粉9组, 每组10份, 每份20g, 置于8~16倍、浓度为0.2%~0.6%稀硫酸溶液中, 浸泡24h。用滤布过滤, 同法再提取2次, 合并3次滤液, 加石灰乳调pH值, 静置过夜。倾出上清液, 过滤, 滤液与上清液合并, 加食盐, 使食盐量达6%, 静置过夜, 抽滤, 得盐酸小檗碱粗品。粗品加80mL纯化水, 加热, 煮沸, 趁热抽滤, 滤液在50℃~60℃用浓盐酸调pH至2~3, 静置过夜, 即析出盐酸小檗碱, 减压抽滤, 用少量乙醇洗涤结晶, 在80℃以下干燥即得精品, 称重, 每组计算平均质量 (排除个体差异不合理数据) 。

3.3 薄层色谱定性实验

取上述实验提取得到的盐酸小檗碱精制品10mg-1, 置于小试管中, 加乙醇10mL微热溶解, 摇匀, 得供试液。取供试液10μL, 点于硅胶薄层板上, 并以对照品盐酸小檗碱溶液为阳性对照, 以正丁醇:冰醋酸:水 (4∶1∶5) 上清液为展开剂进行展开, 取出, 晾干, 置紫外灯下观察, 可见供试品与对照品呈黄色荧光斑点, 且Rf相同。

3.4 小檗碱含量测定

(1) 盐酸小檗碱对照品液的制备。精密称取盐酸小檗碱对照品5mg, 置于50mL容量瓶中, 加乙醇溶解至刻度, 摇匀, 作为对照品液备用。精密量取对照品溶液2mL, 置于50mL量瓶中, 用乙醇为空白对照, 用紫外分光光度计在200nm~500nm范围内测定最大吸收峰, 结果在348nm处有最大吸收峰。因此, 测定波长为348nm。

(2) 标准曲线的制备。分别精密量取盐酸小檗碱对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于5个50mL容量瓶中, 加乙醇至刻度, 摇匀, 以乙醇为空白, 在348nm处测定吸收度。以浓度 (C) 对吸收度 (A) 作曲线, 得回归方程A=0.05203C+0.00948 (r=0.9997) 。

(3) 精密度试验。取同一批号样品溶液5份, 按3.3操作测定, RSD为0.76%, 表明本实验精密度较好。

(4) 稳定性试验。取同一对照品溶液, 间隔2h按3.3操作测定, 在12h内RSD为0.95%。表明溶液至少可稳定12h。

(5) 回收率试验。精密量取已知含量的样品溶液5份, 分别加人盐酸小檗碱对照品1mg, 按3.3操作测定, 平均回收率为103.1%。

(6) 精制品中盐酸小檗碱含量测定。精密称取盐酸小檗碱精制品50mg, 置于100mL容量瓶中, 加入乙醇溶解至刻度, 摇匀, 再精密量取1.0mL溶液置于50mL容量瓶中, 加入乙醇定容至刻度, 摇匀。在348nm处测定吸光度, 按回归方程计算盐酸小檗碱的质量, 结果见表3。

4 结果讨论

4.1 直观分析

从上表各因子K值大小来看, 因子A以A1提取率最高, 因子B以B3提取率最高, 因子C以C1提取率最高, 因子D以D3提取率最高。即以16倍量, 浓度为0.2%的稀硫酸浸泡24小时, 石灰乳调碱度的pH为9, 盐酸调pH的温度为60℃时提取率为最好。如果要了解A、B、C、D四个因子中哪个是影响提取率的最关键因子, 可通过图1进行比较 (见图1) 。

从图1看出, A因子随稀硫酸浓度的增加, 提取率下降, 这与小檗碱可能形成酸式盐有关;B因子的斜率最大, 是影响产率的主要因子, 这一点从R (0.38) 得到说明;C因子对小檗碱的提取率无实质性影响, 本学生实验可选择pH为9;用盐酸调节pH为2~3是温度选60℃结果较好。因此, 最佳的实验安排为:A1B3C1D3。

4.2 方差分析

本实验的方差分析见表4。

以因子C作为误差来检验其他因子的显著性, 只有当P<0.25时A、B因子对提取率构成显著影响。从方差分析结果来看, 各因子对盐酸小檗碱提取率的影响顺序为B>A>D>C, 由于C对提取结果无明显影响, 可任选, 所以选择A1B3C1D3为最佳工艺, 这与直观分析结果一致。

本学生实验教学内容重点可放在以下几个方面: (1) 水平和因子概念的理解。 (2) 正交表的理解和选用。 (3) 黄连中小檗碱提取因子、水平及实验流程的设计。 (4) 实验结果的直观分析和方差分析等。

F0.25 (2, 2) =3.00 F0.05 (2, 2) =19.00 F0.01 (2, 2) =99.00

摘要：通过正交表的结构和选用、因子和水平的合理选择等教学活动, 把正交实验法应用于黄连中小檗碱提取的学生实验, 经过教师引导, 学生参与讨论, 确定了稀硫酸浓度、稀硫酸的用量、石灰乳调碱度的pH和趁热抽滤后用盐酸调pH的温度为提取的因子, 每个因子三个水平, 选用了L9 (34) 作为正交实验表, 学生实验后, 通过直观分析和方差分析, 得出此次实验最佳方案为:稀硫酸以16倍量, 浓度为0.2%, 浸泡24小时, 石灰乳调碱度的pH为9, 盐酸调pH的温度为60℃。

关键词：正交实验,黄连,小檗碱