Glut-1、VEGF在胰腺癌中的表达及意义

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一, 恶性程度极高, 预后极差。在肿瘤病理中, 细胞对低氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。本研究通过采用RT-PCR及免疫组织化学染色的方法检查胰腺癌及正常人类胰腺组织中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 和葡萄糖转运蛋白-1 (glucose transporter-1, Glut-1) 的表达, 探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

胰腺癌组:我院普外科2000年1月至2008年10月间手术切除的30例胰腺癌标本;正常组:20例正常胰腺组织来源于同期良性胰腺肿瘤切除距肿瘤边缘2cm的正常组织, 所有标本均在手术切除后迅速冻存于液氮中, 然后置于-80℃低温保存。全部病例术前均未行放、化疗, 术后均经病理检查证实。

1.2 主要试剂

免疫组化SP试剂盒, 兔抗人抗体Glut-1、VEGF购自北京博奥森公司;Trizol试剂购自美国invitrogen公司。MMLV逆转录酶及TaqDNA聚合酶均购自美国Promega公司;Glut-1、VEGF和β-actin引物序列由上海“生工”公司合成, 由Primer.5.0软件设计, 其余试剂均为国产分析纯试剂。免疫组化按试剂盒说明书操作。

1.3 RT-PCR检测

样品总RNA的制备:取组织50mg, 采用Trizol说明书提取其中的总RNA。紫外分光光度计检测其浓度和纯度后, 逆转录合成cDNA。cDNA的合成:反应体系中加入提取的RNA5μg, 2.5mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP) 4μL, 寡聚脱氧胸苷酸0.3μg, RNA酶抑制剂20U, 0.1mol/L巯基乙醇25μL, 加水至19μL。上述混合物70℃加热5min后, 冰上冷却, 然后加入MMLV逆转录酶5μL终体积25μL, 离心、混匀后37℃水浴60min, 最后90℃灭活逆转录酶活性, 冰上冷却后即完成cDNA的合成。利用PCR方法扩增模板cDNA, 预变性:94℃5min, 变性:92℃30s, 退火:63℃30s, 延伸:72℃45s。循环次数:35次, 后延伸:72℃7min。VEGF:上游引物序列5'-GGAGCTTCAGGACATTGCTGTG-3'下游引物序列5'-GGAGGAAGGTCAACCACTCAC-3', 目的片段长度为353 bp, Glut-1上游引物序列5'-TCATCGTGGCTGAACTCTTCAG-3'下游引物序列5'-TCACACTTGGGAATCAGCCCC-3', 目的片段长度为231bp.β-actin上游引物序列为:5'-ACC ACA GTCCAT GCC ATC AC-3', 下游序列为:5'-TCC ACC ACC CTGTTG CTG TA-3', 目的片段长度为619 bp, 反应完毕后, 产物取2μL行凝胶电泳。目的基因和内参标基因 (β-actin) PCR产物用凝胶电泳分离, 每条带特异片断的相对量用DR2000凝胶图像分析系统, 在紫外灯下对凝胶图像进行扫描后处理数据, Marker对照。以目的基因条带光密度值与β-actin条带光密度值作为目的基因在胰腺组织和胰腺癌组织中表达的相对强度。

注:与正常组比较*P<0.01

注:与正常组比较, *P<0.01

1.4 免疫组化法检测蛋白的表达

胰腺组织石蜡切片Glut-1、VEGF免疫组织化学染色。每例均随机观察10个高倍视野, 读取阳性细胞数。由两位病理科医师双盲阅片。

1.5 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理, 所有计量资料均以表示。2个样本均数间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Glut-1 mRNA、VEGF mRNA在组织中表达结果

1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 正常组Glut-1 mRNA、VEGF mRNA产物电泳条带暗、产量低;胰腺癌组产物条带强、产量高, 其光密度值与正常组相比明显增高 (P<0.01) 。结果见表1。

2.2 Glut-1、VEGF的免疫组化结果

正常组个别细胞胞浆和/或胞膜内Glut-1、VEGF弱阳性表达;胰腺癌组细胞胞浆和/或胞膜内Glut-1、VEGF阳性表达与正常组相比显著增加 (P<0.01) , 在胰腺癌坏死组织周围的癌细胞中表达更强, 结果见表2。

3 讨论

本研究结果显示胰腺癌组织Glut-1 mRNA、VEGF mRNA水平明显高于正常组织 (P<0.01) , 且Glut-1的表达与VEGF的表达呈正相关性。结果说明Glut-1作为VEGF的靶基因产物, 由于胰腺癌对能量需求的增加刺激VEGF mRNA增多, 使VEGF表达上调, 结果表现为胰腺癌血管生成, 癌细胞能量供应充足, 癌细胞摄取葡萄糖加强, 刺激Glut-1 mRNA增多, 最终导致Glut-1的表达增加。

本研究结果提示Glut-1、VEGF在胰腺癌的发生发展中起着重要作用, 为今后以Glut-1、VEGF为靶点的临床基因治疗和预防胰腺癌提供新的重要对策。

摘要：目的研究葡萄糖转运蛋白-1 (Glut-1) 及血管内皮生长因子 (VEGF) 在胰腺癌中的表达及意义。方法应用半定量RT-PCR及免疫组织化学染色技术检测Glut-1、VEGF在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达。结果RT-PCR结果显示Glut-1mRNA、VEGFmRNA在正常胰腺和胰腺癌组织中均有表达, 但在胰腺癌组织中的表达量明显高于正常胰腺组织 (P<0.01) ;免疫组化染色阳性细胞计数显示Glut-1、VEGF在胰腺癌组织中的阳性细胞数明显多于正常胰腺组织 (P<0.01) 。结论Glut-1与VEGF的异常表达可能在胰腺癌的发生中起协同作用;VEGF通过上调Glut-1表达促进胰腺癌的发生发展。

关键词：胰腺肿瘤,Glut-1,VEGF

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