生物学机制论文提纲

论文题目：深海高效除镉菌株对磷镉去除的相互作用及其生物学机制

摘要：近年来工业废水排放、磷肥施用以及矿山开采引起的镉污染日益严重。镉作为一种剧毒的重金属元素,由于其不可降解,进入食物链后会在生物体内富集而造成严重的健康和生态危害。自然界中,磷和镉的分布具有一定相关性,海水中镉和磷之间的关系是双线性的,磷矿中镉通常会以0.1-60 mg/kg的浓度伴生存在;生产中,由于有色金属矿床和磷矿的开采以及含镉磷肥的施用使含镉废水中含有浓度不等的磷。另外,磷资源属于不可再生类,据估计全球可开采的磷矿将在60-130年内耗尽。因此,污水中的磷回收以及磷镉的同时去除在磷资源保护和镉污染防理中具有重要意义。微生物作为元素循环和物质传递的中间环节,在磷镉循环以及磷的矿化中发挥着重要作用。文献报道的能够实现磷镉的同时去除的微生物种类较少,种属不明确。Pseudoalteromonas sp.SCSE709-6（P.sp.SCSE709-6）是分离自中国南海的一株高效除镉海洋菌,前期研究发现P.sp.SCSE709-6能实现磷镉的同时去除;但是磷镉同步去除过程中,其作用机理和生物学机制尚不明确。基于以上研究背景,本课题首先研究了菌株P.sp.SCSE709-6的除磷效能及其应用;进一步分析了不同磷镉浓度对P.sp.SCSE709-6的生理生化特性及磷镉去除效能的影响;解析了同步去除过程中磷镉的迁移转化和P.sp.SCSE709-6的生物学机制。本论文主要研究工作及重要结论包括以下几个部分:（1）P.sp.SCSE709-6的环境适应能力以及除磷能力强,去除的磷主要以有机磷形式（磷酸单脂和磷酸双脂）分布在胞内和胞外聚合物上,P.sp.SCSE709-6的接种强化了系统对碳磷的去除能力,增加了微生物群落结构的相似性。P.sp.SCSE709-6,能够在初始磷浓度1-40 mg/L、盐度为1%-10%、pH为5-8.5、C/N比为15-20以及温度为15-30℃的条件下良好生长并实现高效除磷,最多除磷30 mg/L左右,该菌环境适应能力强,除磷效果好。除磷过程中正磷酸盐逐渐同化吸收转化为有机磷,有机磷以磷酸单脂和磷酸双脂形式存在,占总磷的92.82%-95.54%。去除的磷主要分布在胞内和EPS上,其百分比分别为41.3%和50.6%。SMT提取结果显示,菌体中的磷主要以易于迁移和可生物利用的磷形式（有机磷OP和非磷灰石磷NAIP）存在,其占比高达97.1%。批次实验中,P.sp.SCSE709-6处理含盐黑水的最大COD、TP和TN去除率分别为96%、83%和50%左右。在船上的半连续实验中,接种了P.sp.SCSE709-6的系统T3具有最佳的COD去除率（99.8%）;T3和T4（接种P.sp.SCSE709-6进行强化的两个系统）均具有良好的脱磷能力（去除率分别为80.9%和88.4%）。T3和T4之间的β多样性指数中的未加权unifrac距离最小（0.368）,表明T3和T4之间存在最小的群落差异。（2）镉胁迫下细菌形态变粗变短,磷能缓解镉对P.sp.SCSE709-6生长的抑制作用,P.sp.SCSE709-6对镉的去除速率随磷浓度增加而提高,磷的增加有利于细菌对镉的抵抗。通过原子力显微镜观察发现,磷浓度为9 mg/L的无镉污水中P.sp.SCSE709-6的菌体形态呈细长的杆状,细菌的长度约为2 μm,宽度约为1 μμm;随着镉浓度逐渐增加,P.sp.SCSE709-6的菌体形态变短变粗,并且其周围聚集着一些纳米颗粒,随着磷浓度的增加,细菌形态受镉影响的程度变小。磷能减轻镉对细菌生长的抑制作用,污水的pH值先降低后增加至7.5-8.4,P.sp.SCSE709-6能自主调节污水pH至弱碱性。随着镉浓度或磷浓度的增加,EPS中蛋白多糖的含量逐渐增加;磷的增加有利于细菌对镉的抵抗。三维荧光光谱结果显示,随着镉或磷浓度的增加,EPS中芳香类蛋白质的结构发生变化,腐殖酸类的峰消失,出现新的富里酸峰。芳香类蛋白质的羧基、羰基、羟基、氨基官能团含量增加,使D峰出现红移。热重分析表明镉和磷的增加使菌体的失重温度降低,增加了菌体的可燃性,有利于处理污水后的菌体的脱水。随着镉浓度的增加,P.sp.SCSE709-6的除磷除镉速率均有所降低;当镉浓度为1-10 mg/L时,24 h内能实现磷镉的完全去除,当镉浓度大于12 mg/L时,对磷镉的最大去除率均有所降低。随着磷浓度的增加,P.sp.SCSE709-6对镉的去除速率增加,说明磷的存在有利于该菌对镉的去除。（3）高镉使P.sp.SCSE709-6菌体中总镉以可交换的镉形态增加,高磷能降低菌体中总镉含量,使镉更多的积累在EPS中以及可交换态镉的含量降低,减轻镉的毒性;含镉污水中,细菌生成Cd-S-P纳米颗粒。随着时间的增加,磷由EPS中转移到胞内,胞内的镉先增加后减少。随着磷浓度的增加,P.sp.SCSE709-6菌体中的磷更多的积累在EPS,镉积累的主要部位由细胞膜变成了 EPS。磷镉浓度的变化并未改变菌体中主要的磷形式（单脂、双脂和正磷酸盐）。随着镉浓度的增加,菌体中的镉含量显著增加,并且可交换态的镉增量最大,镉的直接毒性增加;随着磷浓度的增加,菌体中总镉含量有少量降低,可交换态镉的含量降低,可还原态镉的含量增加,表明磷能缓解镉的直接毒性,镉形态由不稳定变为稳定。污水中含镉时,细菌周围出现了纳米颗粒,并且镉浓度越大,颗粒聚集得越多。提取后的纳米颗粒聚集在一起,其由很多直径约为30 nm的圆形颗粒组成,其碳含量较高（87.8%）,说明该颗粒中主要为有机物,镉的占比为2.8%,硫的占比为2.9%,磷的占比为0.2%。对聚集纳米颗粒中的一个圆形颗粒放大,发现其具有明显的晶型和无定形性质,由直径为2-3 nm的纳米晶组成,纳米晶的晶面间距为0.305 nm。通过XPS测定,纳米颗粒的Cd3d精细谱图发现镉主要以Cd-S以及O-Cd-O方式与硫和氧结合,EPS的S2p谱图显示其主要为S2’形态,P2p谱图显示磷主要以P043-,P-O-P方式结合。（4）镉的存在影响了P.sp.SCSE709-6对磷的直接吸收,镉使肌醇磷酸代谢和磷酸戊糖途径中的多种酶下调表达,并影响三羧酸循环和糖酵解途径中的一些酶活性,从而影响P.sp.SCSE709-6的磷代谢。差异表达基因中显著富集的GO-term主要有细胞外膜、外部封装结构、细胞包膜、铜离子和银离子的跨膜运输、氨基酸合成和代谢过程、羧酸生物合成和有机酸生物合成。差异表达基因的KEGG分析发现,有磷时,镉胁迫条件下,菌体内差异基因主要富集在精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、氨基酸的生物合成（Biosynthesis of amino acids）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（Cysteine and methionine metabolism）、肌醇磷酸代谢（Inositol phosphate metabolism）。当污水中镉浓度增加时,谷胱甘肽产量略有升高,胞内碱性磷酸酶的活性增加。而当磷浓度增加时,谷胱甘肽的浓度随之稍微降低,胞内碱性磷酸酶的活性减少,环境中磷的增加使细菌可利用的磷增加,无需过多分解胞内存储的磷。明确了P.sp.SCSE709-6的抗镉机制。（ⅰ）通过细胞膜相关基因下调表达以及EPS的吸附作用,阻止镉离子内流;（ⅱ）胞内含硫蛋白质合成的上调表达,镉与含硫蛋白质和含磷有机物结合以达到细胞内部的隔离作用和解毒作用;（ⅲ）通过钴/锌/镉外排RND转运蛋白、铅/镉/锌/汞转运ATP酶、钴/锌/镉抗性蛋白CzcA、膜融合蛋白CzcB和阳离子外排系统蛋白CusA的上调表达,促进镉离子外排。综上,P.sp.SCSE709-6应用于含磷污水的处理,实现磷去除的同时将磷以生物可利用的形式储存在菌体内,对磷资源的再利用具有重要意义。不同磷镉浓度下P.sp.SCSE709-6的生理生化特性和磷镉去除效能以及P.sp.SCSE709-6对磷镉的同时去除过程中,磷镉的迁移转化为该菌应用于磷镉的同时去除提供了有利的理论基础和数据支撑。磷镉的同时去除实现了有毒有害污染物的高效低成本去除,具有重要的环境、生态和经济效益。此外,磷镉作用下P.sp.SCSE709-6的生物学机制探究,有利于理解海洋环境及磷矿中磷镉的相关性,揭示该菌在环境中的生态意义。

关键词：海洋细菌P.sp.SCSE709-6;除磷;资源化;磷镉同步去除;磷镉相互作用机制

学科专业：环境工程

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 环境中的磷镉相关性

1.1.1 磷矿中的磷镉相关性

1.1.2 海水中的磷镉相关性

1.2 磷概况及污水中磷的处理回收

1.2.1 磷资源

1.2.2 磷污染

1.2.3 污水中磷的处理及回收

1.3 镉污染及含镉废水处理

1.3.1 镉污染来源

1.3.2 镉污染的危害

1.3.3 含镉废水的处理方法

1.4 微生物对镉的抗性和解毒机制

1.4.1 阻止镉进入胞内

1.4.2 胞内隔离作用和解毒作用

1.4.3 促进镉的外排

1.4.4 镉形态的转化

1.4.5 生物体中的磷镉相互作用

1.5 P.sp. SCSE709-6的除镉性能

1.6 本研究的目的、意义和主要研究内容

1.6.1 本研究的目的和意义

1.6.2 本研究的主要内容

1.7 本研究的技术路线

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验试剂和仪器设备

2.1.2 培养基和污水

2.1.3 实验菌株

2.2 P.sp. SCSE709-6的除磷效能及其应用

2.2.1 环境因素对细菌除磷效能的影响

2.2.2 磷在污水和菌体各部分中的迁移

2.2.3 磷的分级提取(SMT方法)

2.2.4 sp. SCSE709-6处理含盐黑水

2.3 不同磷镉浓度下的除磷除镉性能

2.4 同步去除过程中磷镉的迁移转化

2.4.1 磷镉在菌体中的分布

2.4.2 不同磷镉下菌体中磷的生物可利用性

2.4.3 不同磷镉浓度对镉形态的调节作用

2.5 P.sp. SCSE709-6的转录组分析

2.5.1 菌株的培养

2.5.2 RNA提取及浓度测定

2.5.3 测序及生物信息学分析

2.5.4 差异表达基因的qRT-PCR验证

2.6 表征方法

2.6.1 ~(31)p核磁分析(NMR)

2.6.2 三维荧光光谱分析(3D-EEM)

2.6.3 热重分析(TGA)

2.6.4 原子力显微镜(AFM)

2.6.5 扫描电镜(SEM)

2.6.6 透射电镜(TEM)

2.6.7 X射线光电子能谱(XPS)

2.7 生物指标分析

2.7.1 生物量的测定

2.7.2 EPS中蛋白质和多糖的测定

2.7.3 碱性磷酸酶的测定

2.7.4 谷胱甘肽的测定

2.8 水质分析方法

2.9 数理统计分析

第三章 P.sp.SCSE709-6的除磷特性及其应用

3.1 除磷效能的研究

3.1.1 初始磷浓度对除磷的影响

3.1.2 盐度对除磷的影响

3.1.3 pH对除磷的影响

3.1.4 碳氮比对除磷的影响

3.1.5 温度对除磷性能的影响

3.2 磷在污水和菌体各部分中的迁移

3.3 菌体中的磷形式及可回收性

3.3.1 菌体中的磷形式

3.3.2 菌体中磷的生物可利用性

3.4 P.sp. SCSE709-6应用于处理含盐黑水

3.4.1 不同接种量的P.sp. SCSE709-6处理含盐黑水

3.4.2 半连续反应器处理效果

3.4.3 半连续反应器群落结构分析

3.5 本章小结

第四章 P. sp. SCSE709-6生理生化特性及磷镉去除效能的研究

4.1 磷镉浓度对微生物形态的影响

4.2 磷镉浓度对细菌生物量和污水pH的影响

4.3 磷镉浓度对细菌EPS产量及其成分的影响

4.3.1 磷镉浓度对EPS产量的影响

4.3.2 磷镉浓度对EPS成分的影响

4.4 磷镉浓度对菌体热稳定性的影响

4.5 不同镉浓度对除磷除镉效能的影响

4.6 本章小结

第五章 同步去除过程中磷镉的迁移和转化

5.1 磷镉在菌体各部分的迁移

5.2 不同磷镉浓度下菌体中的磷形式及生物可利用性

5.3 不同磷镉浓度下镉形态的调节

5.4 纳米颗粒的生成及其磷镉结合方式

5.4.1 纳米颗粒的生成

5.4.2 纳米颗粒中磷镉的结合方式

5.5 本章小结

第六章 P.sp. SCSE709-6在磷镉作用下的生物学机制

6.1 RNA质量检测

6.2 测序原始数据质量评估

6.3 参考基因组比对

6.4 差异表达基因分析

6.4.1 差异表达基因聚类分析

6.4.2 GO功能显著性富集分析

6.4.3 Pathway显著性富集分析

6.5 测序结果验证

6.6 不同磷镉浓度下的细菌代谢

6.6.1 胞内碱性磷酸酶

6.6.2 胞内谷胱甘肽含量

6.7 磷镉作用下的生物学机制

6.8 本章小结

第七章 结论与展望

7.1 主要结论

7.2 论文创新点

7.3 不足与展望

参考文献

致谢

附录一

附录二

附录三