细菌培养与检测

细菌培养与检测（精选十篇）

细菌培养与检测 篇1

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2011年1月至2012年4月来本院进行尿路感染诊断的643例疑似病患, 女341例, 男302例, 年龄为19～74岁, 平均年龄 (45.2±2.4) 岁。

1.2 诊断方法

将643例尿路感染病患分成A、B两种诊断方法, A种方法是尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测的方法进行诊断, 采用自动尿沉渣分析仪器, 计量尿沉渣白细胞及细菌数量, 对所有的病例进行诊断, B种方法是尿细菌培养方法, 取尿液接种培养皿, 计数菌落数, 以B诊断方法作为检测的金标准。

1.3 临床观察

测定A、B两种诊断方法阳性以及阴性例数、阳性以及阴性率、阳性以及阴性的预测符合率、病患满意度、花费时间等指标。A种方法每微升大于两千五百个的情况, 判为阳性。B种方法出现菌落大于每毫升一万个的情况, 判为阳性。

2 结果

A组以及B组阴阳性情况见表1, B组阳性的例数为211例, 阳性率32.81%, 阴性率为67.19%, A组阳性219例, 阳性率34.06%, 阴性率为65.94%, 并且P值>0.05, 不存在统计显著性差异。

A组阳性219例, 其中也同时是B组的210例, 符合率为95.89%, 阴性例数424例, 同时也是B组的422例, 符合率为99.53%, 并且P值>0.05, 不存在统计显著性差异。A组以及B组病患态度情况见表2, A组病患满意度99.53%, B组病患满意度93.47%, A组花费时间低于B组, 并且P值<0.05, 存在显著性差异, 有统计意义。

3 讨论

尿细菌培养诊断方法主要是利用培养皿, 对正常尿液里的细菌进行培养, 然后通过对病患尿液中菌落数进行计算, 达到诊断效果, 这种方法长期以来被应用于尿路感染的诊断中, 其效果相当显著, 但由于其本身存在不足, 很多病患在使用这种方法的时候, 很不配合, 延误了诊断和治疗。

而尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测方法是一种新型的诊断尿路感染的方法, 这种方法通过采用先进的自动尿沉渣分析仪器, 方便的通过诊断病患尿液中白细胞及细菌, 达到准确的诊断, 及时发现病患病情的目的, 并且具有诊断的速度快、符合率高、成本低等优点, 在临床尿路感染的诊断中, 具有很大的推广以及研究意义。本文通过对643例疑似尿路感染病患进行了尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测以及尿细菌培养的诊断, 证明了两种方法内在一致性, 具有类似的诊断效果。当然, 在尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测诊断方法应用的初期, 会投入比较大的固定成本, 存在花费费用高以及医生题, 随着其广泛应用, 一定能最大化的降低成本, 更加方便群众, 除此之外, 由于这种诊断方法使用的仪器先进, 很多操作人员没有能够很好的掌握这方面技能, 因此, 各单位要注意, 在加大引入先进设备以及先进技术的同时, 要极大对医生以及护理人员先进理论知识以及操作方法的培训, 从而使得他们技能跟上时代的发展, 更好的为人民服务。

摘要：目的 分别应用尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测以及尿细菌培养的检测方法来对尿路感染病患进行诊断, 对比两种方法的诊断是否具有一致性。方法 选取2011年1月至2012年4月来本院进行尿路感染诊断的643例疑似病患, 分成A、B两种诊断方法, A种方法是尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测的方法进行诊断, 采用尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测的方法对所有的病例进行诊断, B种方法是尿细菌培养方法, 以B诊断方法作为检测的金标准, 测定A、B两种诊断方法阳性以及阴性例数、阳性以及阴性率、阳性以及阴性的预测符合率、病患满意度、花费时间等指标。结果 B组阳性的例数为211例, 阳性率32.81%, 阴性率为67.19%, A组阳性219例, 阳性率34.06%, 阴性率为65.94%, 并且P值>0.05, 不存在统计显著性差异;A组阳性符合率为95.89%, 阴性符合率为99.53%, 并且P值>0.05, 不存在统计显著性差异;A组病患满意度99.53%, B组病患满意度93.47%, A组花费费用低于B组, 并且P值<0.05, 存在显著性差异, 有统计意义。结论 应用尿沉渣白细胞及细菌定量计数联合检测的方法与尿细菌培养诊断诊断尿路感染具有很好的一致性, 并且花费更低, 时间也更短, 值得推广。

关键词：尿沉渣白细胞,细菌定量计数,尿细菌培养

参考文献

细菌培养与检测 篇2

【关键词】蜡样芽胞杆菌；食物中毒

【中图分类号】R155.3 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2012）08-0321-01

Detection and analysis of a bacterial food poisoning case

WANG Yan-ping MA Jing YANG Xiao-bo

Research center for public health of China Three Gorges University [Centre for Disease Control and Prevention of city YiChang](Yichang, Hubei,china 443005)

【Abstract】Objective：Identify the causes of food poisoning, prevention and control of food poisoning. Methods Combination of epidemiology, clinical manifestations, laboratory for analysis.Results Leftovers at 1 and 3 were detected in both patients vomit the same biological characteristics of Bacillus cereus. Conclusion：Confirmed from eating with Bacillus cereus food poisoning caused by contaminated leftovers.

【keyword】Bacillus cereus；food-poisoning

2010年9月7日，宜昌市疾病预防控制中心接到报告某校几十人疑似食物中毒，均以头晕、恶心、呕吐为主要症状。疾控中心迅速开展了现场流行病学调查，并采集了可疑食物、病人呕吐物等样本进行实验室检验。经现场流行病学调查、临床诊断，结合实验室检测，证实为一起因食用被蜡样芽胞杆菌污染的剩饭引起的食物中毒。

1 流行病学调查

当日上午在校食堂早餐人数为270人， 早餐后陆续有学生出现头晕、恶心、呕吐症状。经对发病与未发病者进食情况的全面调查，中毒病例均在校食堂早餐食用炒饭，在发病前48h内无外出聚餐史，共有25人发病，发病率为9.26%。

2 临床表现

头晕、恶心、呕吐症状，无腹痛、 腹泻。发病潜伏期最短0.5h ，最长4h，平均2.5h，经静脉补液等对症治疗，中毒病例均已痊愈且无续发病例。

3 实验室检测

3.1 样本采集 以无菌操作采集剩米饭1份、患者呕吐物3份，置于无菌容器送检。

3.2 检验方法 依据GB/T 4789.14-2003《食品卫生微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》。

3.3 培养基和试剂由北京陆桥技术有限责任公司提供，均在有效期内。

3.4 食物蜡样芽胞杆菌菌数测定 以无菌操作分别取25g剩米饭，加入225mL灭菌生理盐水，置均质器中制成混悬液，将混悬液稀释成1O-1～1O-5，分别取各稀释液0.1mL接种在两个甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板上，用L形棒涂布于整个表面，37℃培养24h。选择呈粉红色、周围有粉红色晕的蜡样芽胞杆菌可疑菌落，并从中挑取5个此种典型菌落做证实试验。剩饭中蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌计数为104cfu/g。

3.5 增菌和分离培养 将患者呕吐物接种营养肉汤、普通营养琼脂平板、血平板、甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板，在37℃培养24h后，营养肉汤有菌膜，振摇后乳化。在普通营养琼脂平板上菌落较大、不透明、表面粗糙、融蜡状、灰白色菌落生长。在血平板上呈灰色粗糙的融蜡状、边缘不整齐、溶血。在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板上呈粉紅色，周围有粉红色晕的可疑菌落。剩饭和患者呕吐物同时接种营养肉汤、SC、GN、7.5%NaCl肉汤、3%NaCl碱性蛋白胨水增菌，然后接种HE平板、Baird-Parker平板、TCBS平板，均未检出沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌。

3.6 革兰氏染色和生化鉴定 挑取从剩饭和呕吐物分离的蜡样芽胞杆菌可疑菌落接种肉汤和营养琼脂做成纯培养。革兰氏染色镜检均为革兰氏阳性大杆菌。生化鉴定结果均为：动力（+）、卵磷脂酶（+）、酪蛋白酶（+）、过氧化氢酶（+）、溶血（+）、甘露醇（-）、木糖（-）、明胶液化（+）、硝酸盐还原（+）、葡萄糖利用（厌氧）（+）、柠檬酸盐利用（-）、淀粉水解（-）、V-P反应（+）。根状生长试验（-）、蛋白质毒素结晶试验（-）、生化分型为蜡样芽胞杆菌8型。

3.7 双份血清效价测定 取患者急性期和恢复期血清各3份，用分离的蜡样芽胞杆菌做血清效价测定，3例患者恢复期血清均比急性期血清有4倍以上增长。

4 讨论

4.1 依据《食物中毒诊断标准及技术处理原则》（GB14938—94）和《蜡样芽胞杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》（WS/T 82-1996），结合流行病学调查、临床表现和实验室检测结果证实为一起由进食剩米饭引起的呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒。

4.2 蜡样芽胞杆菌常污染淀粉性食物而引起食物中毒，一般认为当食物中蜡样芽胞杆菌活菌数达到105cfu/g才能引起食物中毒。本次检测结果剩米饭中蜡样芽胞杆菌活菌数未达到105 cfu/g，原因是前一日中午食堂未售完的米饭虽然放入冰箱冷藏，但是后来停电2小时，加之当时气温较高，达到30℃，且冰箱内食品摆放杂乱、拥挤，导致剩饭冷热不均，部分剩饭温度较高，蜡样芽胞杆菌大量繁殖，导致食物中毒发生。剩余米饭采集时已很少且冷藏，蜡样芽胞杆菌含量较发生食物中毒的部分剩饭要少。

4.3 该次食物中毒提示食品安全监督机构应重点加强学校食堂等集体用餐单位的食品安全监督管理，严格落实学校食品安全第一责任人的制度，进一步加强对食品从业人员的食品安全知识培训，加大食品安全知识的宣传力度，防止食物中毒的发生。同时还应建立健全食品安全应急反应机制，加强应急演练，各级疾控机构要认真履行《食品安全法》赋予的职责，不断提升技术支撑能力，协助卫生监督机构及时进行流行病学调查、现场应急处置，防止事态进一步扩大，有效保障学生身体健康。

参考文献：

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[2] 张华丽,孙静,龙霞,等.一起蜡样芽胞杆菌引起食物中毒的实验室分析[J].预防医学论坛,2007 ,13(9):853.

细菌培养与检测 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年9月—2012年3月在本市区的多个大型超市不定期采购肉食相关样品, 种类包括鸡肉、猪肉、牛肉等。采样过程中样品选择遵循随机化的原则, 整个过程无菌操作。

1.2 菌株选择

鲍氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏、甲型副伤寒沙门菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、威尔氏李斯特菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌株。

1.3 细菌培养

按照每10g样品/100ml Preston肉汤的比例将样品加入增菌肉汤, 混匀后置于42℃, 微需氧培养24h, 观察并挑取可疑菌落进行生化鉴定。

1.4 生化鉴定

1.4.1 过氧化氢酶试验

挑取一接种环菌落置于洁净试管内, 滴加3%过氧化氢溶液2ml, 0.5min内发生气泡者为阳性, 不发生者为阴性。

1.4.2 氧化酶试验

挑取一接种环菌落点样于洁净滤纸上, 分别滴加1%盐酸二甲基对苯二胺溶液, 2min内呈现蓝色者为阳性。2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。

2 结果

检查采得各种禽肉类样品300份, 其中猪肉含有食源性致病细菌的阳性率最高, 鸡肉次之, 最少的为牛肉 (见表1) 。

3 讨论

食源性疾病已成为我国头号食品安全问题, 面向全体社会公众的食品安全宣传教育工作十分紧迫。按照世界卫生组织的定义, 凡是通过摄食而进入人体的病原体使人体患上感染性或中毒性的疾病, 统称为食源性疾病。食源性疾病最常见的临床表现为胃肠道症状; 然而, 此种疾病还可能有神经科、妇科、免疫等其他症状。摄入受污染食品, 也可能造成全身多器官衰竭, 甚至引发癌症, 从而造成极大的残疾和死亡负担, 像蒙牛牛奶的黄曲霉素安全口[1]。其中细菌性食物中毒无论从发生的起数和人数都是占第1位。常见的细菌性食物中毒病原苗有福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌等。通过科学技术手段减少或遏制类似事件的发生已经成为一个重要的问题。

在检测中, 各种检材经分离培养得纯种细菌后, 若需保留菌种或进一步测试其生化反应等生物学特性时, 必须进行纯种细菌培养[2]。本研究将已接种过的培养基, 置42℃培养箱内18～24h, 需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌, 需培养3～7d直至一个月才能生长, 为使培养箱内保持一定湿度, 可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基, 接种后应将试管口塞棉塞后用石蜡凡士林封固, 以防培养基干裂。本研究通过检查, 检测结果显示各类禽肉类样品中均存在细菌污染相关致病细菌[3]。同时在采用与配眼各种中要注意以下问题:初步分离培养的时间在36h时培养基上菌落即有明显生长, 此时进行初步筛检可节省检测时间12h。复苏冻存菌种时应先用肉汤增菌然后再在血平板上分离培养36～48h, 方可有典型菌落生长。近年来越来越多的研究者报道了基于PCR的基因芯片技术在微生物检测中的应用。国已有的研究结果表明应用DNA芯片技术检测病原菌具有快速、高通量、高效率的特点, 将该技术应用于食源性致病菌的快速检测可以弥补现有一些检测方法的不足[3,4]。

总之, 细菌培养法在食源性致病检测中的应用还有一定的价值, 特别适应于禽肉类样品中细菌检测。

参考文献

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[2]吕德生, 陈志新, 王伯伦.空肠/结肠弯曲菌的生物分型和质粒分析及春在流行病学中的初步应用[J].中华流行病学杂志, 2009, 88 (1) :38.

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病原性细菌检测方法的研究进展 篇4

关键词：病原性细菌；检测方法；生化方法；分子生物学方法；优缺点

中图分类号： Q5-3；S852.61文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0253-03

随着我国社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们对肉、蛋、奶等畜禽以及果蔬类产品的需求量越来越大，与此同时，对食品的质量要求也日益提高。然而，由于我国农业生产大部分仍以中小散户为主，农产品来源广泛，生产过程中存在原料控制不严、用水污染、设施落后等因素，极易在生产前端染菌；此外，在农产品的后期加工与流通中，也同样容易造成食品的细菌污染。根据温州、长沙、南通等多地区研究机构和疾病预防控制中心报道，当地生猪、鸡、牛、羊肉、水产品、熟肉制品以及水果蔬菜中均能检测出致病性较强的病原菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等[1-3]。由此可见，我国农产品细菌污染较为严重，检测病原性细菌是食源性疾病预防和控制的关键环节，对维护消费者的健康具有重要意义。本文综述了对细菌检测方法的研究进展情况，为具备不同基础条件的各级检测部门和研究机构提供一定的参考。

1常规生化方法在细菌检测上的应用

1.1培养基法

为监控食品卫生安全，我国进出口商检局和卫生部经过多次修订并制定了针对农产品中致病性细菌检测的一系列标准，如检测肠杆科细菌（Enterobacteriaceae）的行业标准SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》以及检测金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus）的国家标准GB/T4789.10—2010《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》。几乎所有的标准均以传统的细菌培养方法为基础，包括前增菌、分离培养、结合生化及血清学试验进行判定，其优点在于设备要求不高，检测成本低，以生长菌落数作为判定结果可准确定量，重复性强；但其步骤繁琐，工作量大，报告结果通常需要5～7 d，因此过长的检验时间易使得生产部门延误时间，无法应对紧急情况。

1.2快速检测试纸片法

目前商品化的细菌试纸片多将特定培养基和显色物质附着在纸片、凝胶或胶片等载体物质上，通过微生物的生长与显色达到快速检测微生物的目的[4]。由于与常规培养法相比省却了复杂的准备工作，操作简便，节省时间，因而已开始被广泛应用。其中以美国3M公司生产的Peterifilm系列纸片最具代表性，李宁采用该公司生产的试纸片测定食品、空气中沉降菌以及硬表面菌落总数，结果发现使用纸片法在培养24 h即可观察计数，且在硬表面菌落总数测试中，试纸片法表现出较高的灵敏度，优于国标检测法[5]。而陈春田等认为与传统培养方法相比，试纸片法并不能节约培养时间，且灵敏度较低，虽能简化操作步骤，但易出现假阴性结果[6]。笔者认为试纸片产品质量可能是影响检测结果的重要因素之一。此外，由于胶体金试纸具有方便快捷、特异性强、敏感度高等特点，通过制备目的细菌的单克隆或多克隆抗体，将其标记胶体金，制成的免疫层析试纸对于检测某些特定病原菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌等在近年来也得到了广泛应用[7-8]。

1.3全自动微生物生化鉴定系统

全自动微生物生化鉴定系统是一种集生化反应、计算机和自动化技术于一体，运用概率最大近似值模型法进行微生物检测的技术。各种微生物对不同底物生化反应的不同是该系统鉴定的基础，其鉴定结果的精确度取决于鉴定系统配套培养基的种类、配制方法、浓度、孵育条件和结果判定标准等。如法国生物梅里埃公司的VITEK系统和美国BD公司的PHOENIX系统，该自动化系统可进行多达几十种的微量生化反应和药敏生长试验，根据各生化反应孔中的生长变化及呈色反应情况，由计算机通过数值编码技术与数据库进行比较分析，得到鉴定结果[9]。范义等应用VITEK-2系统检测食源性病原菌沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌，并与国标GB/T 4789—2003《食品卫生微生物学检验》中的方法比较，结果显示符合率为100%，且应用该系统可缩短检测时间6～36 h[10]。王原等认为应用BD PHOENIX-100系统可基本上满足临床上检测金黄色葡萄球的需要，但在进行凝固酶阴性葡萄球菌鉴定时存在一定的局限性[11]。由于全自动微生物生化鉴定系统能同时对多个样品进行分析，鉴定时间短、速度快、易操作，且检测菌种范围广，因而具有很高的应用价值。

2分子生物学技术在细菌检测上的应用

近30年来，分子生物学技术发展迅猛，人们对微生物的研究也逐渐从外部表型转向内部基因结构特征，基于物种遗传物质多样性和保守型并存的理论前提，在核酸水平上进行微生物的分类鉴定及定量检测已成为一个重要的发展方向，传统的以培养为基础的诊断技术将逐步被更先进的分子诊断方法取代[12]。

2.1核酸扩增法

2.1.1聚合酶链式反应（PCR）法由于PCR扩增特异性好、操作简单、耗时短，因而在实验室和临床快速检测病原菌中得到了广泛应用。Wang等将PCR技术应用于食品中单核细胞增生李斯特菌的检测，结果发现PCR法对13株单核细胞增生李斯特菌呈阳性，而对其他23种细菌皆呈阴性，说明该方法具有较高的特异性[13]。Rahn于1992年建立了沙门氏菌检测的PCR方法，该方法基于扩增毒力岛SP11关键因子之一的invA基因，特异性良好[14]。Matsuki等设计了针对肠道脆弱拟杆菌、双歧杆菌等4种菌株的特异性引物，对300株菌株进行PCR扩增，结果发现74%的菌株能够特异性扩增出来，而未被扩增出来的菌株为其他种类细菌[15]。但是，另一方面，由于PCR得到的扩增产物并不能反映样本中细菌的真实含量，因而无法形成统一的标准进行衡量，且在核酸抽提和扩增过程中存在一定偏差和效率的不同，可能会降低信息的精确度；但PCR法检测细菌从样本采集到结果判定仅需6～8 h，与传统的培养基法相比，大大缩短了检测时间[16]，因而在某些基因序列并不保守的细菌检测上，具有无可比拟的优势。

2.1.2环介导等温扩增（LAMP）法LAMP法是日本学者Notomi等于2000年建立的，属于核酸扩增技术的一种，它通过针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件下短时间内可扩增出大量拷贝[17]。该方法在操作上无需变性步骤，因而对设备的要求不高，简化后的LAMP法扩增出的产物甚至不需要借助仪器即可即时观察，这对于分子生物学技术在基层以及取样现场的使用具有重要意义。唐梦君等建立了金黄色葡萄球菌的LAMP快速检测法，65 ℃等温条件下仅45 min即可扩增出梯形条带，检测结果与国标方法符合[18]。姜侃等设计了针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌高保守基因序列的LAMP引物，建立了三重LAMP检测方法，在90 min内一次性检出上述3种细菌，且特异性高，检测灵敏度是PCR方法的1 000倍[19]。LAMP方法成为食品卫生领域致病菌检测的潜在有效手段之一，但是也正因其高灵敏性、产物量巨大的特点而导致开盖检测易形成气溶胶污染，从而造成假阳性结果的出现，因此在实际操作中应严格避免交叉污染，同时LAMP的不开盖检测应是未来进一步简化步骤并保证结果重复性高的研究重点[20]。

2.2核酸探针杂交法

核酸探针杂交技术是指利用核酸变性和复性的原理，使得带有标记物的已知序列的核酸片段，和与其互补的核酸序列杂交形成双链，因而能用于样品中特定基因序列的检测。

2.2.1印迹杂交法Southern、Northern和斑点印迹杂交法在核酸技术发展早期应用非常广泛，Greisen等针对能够引起脑膜炎的脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等设计了一系列特异性探针，采用印迹杂交技术成功检测出病患脑脊髓液样本中的目的细菌[21]。Lin等用 32P标记了沙门氏菌的3种寡核苷酸探针，采用Southern印迹显影，比较了3种探针的特异性，并优化了食品中沙门氏菌的鉴定体系[22]。AOAC990.13GENE-TRAK 沙门氏菌检测、AOAC993.09 GENE-TRAK李斯特氏菌检测均采用了核酸探针技术。应用印迹杂交技术的核酸探针方法灵敏性较高，特异性强，而不受非目的细菌的影响，尤其是对尚不能分离培养的细菌检测有特殊意义，具有良好的定性作用，但缺点是无法确切定量。

2.2.2与荧光显微镜联用法早期的放射性同位素标记由于其易造成放射性污染已逐步由非放射性标记物替代。采用不同荧光素标记的特异性核酸探针与细菌进行杂交，不同散射光和发射光波长的荧光素可使各种被标记的目的细菌在荧光显微镜下显示出不同颜色，选择一定数量的视野进行统计即可计量细菌总数。研究人员应用目标细菌的特异性核酸探针与细菌通用探针EUB338或DNA染料进行双标，从而在荧光显微镜下可以对目标细菌进行定性和定量。目前该方法尚未大量应用于食品与医学检测，Krimmer等用Cy3标记的核酸探针从生物膜中成功检测出金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，并认为其适用于临床检测[23]。在用16S rRNA序列设计特异性探针分析人的粪便中特定细菌数量变化发现，双歧杆菌在正常体重儿童排泄物种的含量要高于超重儿童，而随着年龄的增长，奇异菌属的多样性提高了[24-25]。由于通常情况下为保证统计结果的准确性，操作人员需要选择多达数十个视野进行分析，这无疑增加了工作量，降低了效率。

2.2.3与流式细胞仪联用法流式细胞术是一种能够在单细胞或其他生物粒子水平上进行理化、免疫及分子生物学性状及功能方面多参数分析检测的现代分析技术，它可以高速分析上万个细胞，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。以核酸探针进行的荧光原位杂交技术与流式细胞仪的结合（FISH-FCM）使用最初应用于分析活性淤泥和海水样品中目标细菌及菌群的数量变化，而后研究人员逐渐将该项技术引入医学研究，姜云涛等应用细菌通用探针EUB388和变形链球菌特异性探针MUT590成功检测了主要致龋菌变形链球菌[26]；Xie等将该法用于动物营养学上的研究，发现随着摄食脂肪饱和度的降低，肠杆菌科细菌、梭菌、科里氏杆菌占鸽子肠道细菌总数的比例逐渐降低[27]。FISH-FCM方法特异性强，且能够真实反映自然环境下微生物数量与空间分布等方面的信息，在一个检测步骤中，可同时处理多条目标序列。我们相信FISH-FCM对于食品中致病性微生物的检测，应该存在较强的可行性。

2.3基因芯片技术

基于PCR与核酸探针杂交技术相结合的基因芯片技术于20世纪90年代即开始用于细菌的鉴定，细菌样品DNA经PCR扩增后，通过制备的荧光标记核酸探针与芯片上的寡核苷酸点杂交，经扫描仪定量并分析荧光分布模式来确定检测样本中的特定细菌是否存在。由于基因芯片技术同时将大量探针固定于支持物上，因此可一次性对样品大量序列进行分析和检测，具有多样品并行处理能力，解决了传统核酸印迹杂交技术操作序列数量少的特点，且所需样品量少，污染小[28]，基因芯片技术已用于临床细菌混合感染、耐药菌及毒力的检测，为医学上指导临床治疗，药物筛选带来深远影响[29-31]；但由于其制作成本高、技术复杂、检测灵敏性有待于提高等缺陷，因而目前在食品卫生领域应用较少。

3结语

综上所述，虽然分子生物学技术在致病菌定性与定量上将会是未来发展的主要方向，但是包括传统培养法在内的生化分析检测依然在成本和可操作性上具有一定的优势，而且今后将会朝着更加快速精确的方向发展。目前各级研究机构和卫生检测部门的基础条件不同，因此在一定程度上，2类方法的结合使用是确保检测工作准确进行的有效途径。

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细菌培养与检测 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2013 年1 月—2014 年12 月该院收治的100 例下呼吸道感染患者作为研究对象, 将其分为细菌感染组和非细菌感染组, 每组50 例。 这100 例患者均符合下呼吸道感染的诊断标准, 均出现高热、气喘、胸闷、 咳痰等症状, 双侧肺叶内均出现明显的干湿性啰音, 经胸部X线平片检查发现患者肺部出现浸润性的病变。 另选取同期进行体检的50 例健康体检者作为对照组。

细菌感染组中, 男25 例, 女25 例, 患者的年龄在39~78 岁之间不等, 平均为 (64.67±12.37) 岁;非细菌感染组中, 男26 例, 女24 例, 患者的年龄在39~79 岁之间不等, 平均为 (64.61±12.34) 岁;对照组中, 男24 例, 女26 例, 患者的年龄在40~78 岁之间不等, 平均为 (65.71±12.12) 岁。 3 组在性别、 年龄方面作比较, P>0.05, 差异无统计学意义, 可进行组间对比。

1.2 方法

在清晨采集受检者空腹时的静脉血液, 以4 000 r/min的速度对血液标本进行离心处理, 取出血清。 在零下20℃的环境下对血清进行保存, 并采用双抗体夹心免疫化学发光法对这3 组受检者血清中的降钙素原含量进行检测。

在患者晨起后, 给予患者生理盐水进行口腔清洁, 并对患者深度咳出的痰液进行收集, 对这些痰液标本进行细菌培养和分离处理。

1.3 统计方法

将研究数据录入到SPSS17.0 软件中进行处理。 计数资料采用 χ2检验, 使用[n (%) ]表示;计量资料采用t检验, 使用 (±s) 表示。 以P<0.05 表示数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清降钙素原含量对比

与细菌感染组相比, 非细菌感染组和对照组的血清降钙素原含量均明显更低 (t=15.102 5、15.184 5, P<0.05) , 非细菌感染组和对照组的血清降钙素原含量无明显差异 (t=2.828 4, P>0.05) 。 见表1。

2.2 感染组痰培养阳性检出率对比

细菌感染组痰培养的阳性检出率为32%, 明显高于非细菌感染组的0% (χ2=19.0476, P<0.05) 。 见表2。

3 讨论

下呼吸道感染是一种临床常见的呼吸道感染, 多发生于老年患者和身体机能虚弱的患者, 对患者的生活质量水平影响较大。 下呼吸道感染患者往往会合并患有心脑血管疾病, 如患者的感染症状未得到有效的控制, 容易引发严重的后果, 危及患者的生命安全。 下呼吸道感染患者的死亡率较高, 尤其是老年下呼吸道感染患者, 其死亡率高达55%。 因此, 对下呼吸道感染进行尽早的诊断, 并对感染进行有效的控制, 对于提高患者的生存质量水平具有十分重要的意义。

下呼吸道感染通常是由细菌、 病毒以及支原体入侵引起的。 临床治疗下呼吸道感染时, 容易出现药物应用不合理现象。 痰细菌培养是目前临床上诊断下呼吸道细菌感染的有效手段, 能够对下呼吸道感染的用药选择起到决定性的作用。 但痰细菌培养的时间较长, 容易延误诊治的时机, 同时痰液培养的阳性检出率较低, 容易出现误诊和漏诊[2]。 随着检验科学的不断发展, 一些炎性标记物被不断应用到感染性疾病的检测中, 如降钙素原, 具有较高的检测价值。 该研究中, 对患者进行痰细菌培养联合血清降钙素原检测, 其诊断效果较好。

血清降钙素原是一种不具有激素活性的降钙素类前体物质, 血清降钙素原多在甲状腺C细胞中出现, 在生长到一定程度时, 可以进行裂解, 裂解出降钙素。 在正常情况下, 健康人体血液中的血清降钙素原含量很低[3]。 当人体受到细菌侵袭而发生感染时, 甲状腺C细胞活性增强, 生长速度加快, 并裂解出降钙素, 使血清中的降钙素原的浓度显著提高;同时, 在机体受到细菌感染后, 机体内环境发生紊乱, 甲状腺C细胞以外的细胞也会生成血清降钙素原, 如肝巨噬细胞和单核细胞、肺淋巴细胞以及神经系统内分泌细胞。 但当患者的感染是由非细菌因素引起时, 机体内环境未发生明显的改变, 甲状腺C细胞的活性未受到影响, 甲状腺C细胞以外的细胞未发生改变, 不会生成降钙素原, 患者机体血清中的降钙素原并不会出现明显的变化。 因此, 临床上, 将血清降钙素原的浓度作为区分细菌感染和非细菌感染的重要指标。 该次研究中, 与细菌感染组相比, 非细菌感染组及对照组的血清降钙素原含量明显更低 (P<0.05) , 这说明血清降钙素原检测能够准确的诊断出患者机体内发生的细菌感染性病变。

综上所述, 血清降钙素原检测联合细菌培养能够提高下呼吸道感染的确诊率, 能够有效鉴别出细菌感染, 对下呼吸道感染患者药物的选择具有重要的参考价值。

摘要：目的 研究并探讨下呼吸道感染疾病诊断中血清降钙素原检测和细菌培养的的应用价值。方法 随机选取100例下呼吸道感染患者作为研究对象, 另选取同期进行体检的50例健康体检者作为对照组。对患者的血清降钙素原含量进行检测, 并收集感染组患者的痰液进行细菌培养。结果 与细菌感染组相比, 非细菌感染组和对照组的血清降钙素原含量均明显更低, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。痰培养的阳性检出率明显高于非细菌感染组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 血清降钙素原检测联合细菌培养能够提高下呼吸道感染的确诊率, 具有重要的诊断价值。

关键词：下呼吸道感染,血清降钙素原,细菌培养,诊断

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细菌培养与检测 篇6

采样科室:选取Ⅰ~Ⅳ类环境共计28个临床科室。Ⅰ类环境:手术室。Ⅱ类环境:ICU, CCU, 产房, 导管室, 血液病房。Ⅲ类环境:神经内科, 神经外科, 骨科, 泌尿科, 肿瘤放疗科, 呼吸科, 心内科, 普外科, 妇产科, 血液透析室, 口腔科, 内镜室, 消毒供应中心, 输血科。Ⅳ类环境:感染医学门诊, 检验科微生物室, 体检中心, 门诊输液室, 高压氧科, 中医科, 康复科, 急诊科。

采样部位:各类环境的治疗室台面、床头桌表面、内镜洗消工作台面、采血室台面、供应室打包台面、治疗车、医务人员手等共计采样129个, 物体表面50个、医护人员手79个。为了保证配对资料的有效性, 采集同一工作人员的左右手, 物体表面采集相邻的表面。

方法: (1) ATP生物荧光法:北京创新公司的手持式ATP生物荧光检测仪及配套的采样拭子。采样方法参照仪器说明书。含有荧光素酶的采样拭子对物体表面10 cm×10 cm的区域上进行涂抹采样并读取数据, 对于不合格的结果进行现场干预, 重新消毒后再次采样。 (2) 微生物培养计数法:按照《医院消毒卫生标准》 (GB15982-1995) 的方法进行细菌培养计数。

判断标准: (1) ATP生物荧光检测法:根据ATP生产厂家提供的标准, 物表消毒前:RLU:≤100;警告:100~300;不合格:>300。物表消毒后:RLU:≤30;警告:30~100;不合格:>100。洗手后重点科室:RLU:≤30;不合格:>30。洗手后普通科室:RLU:≤100;不合格:>100。 (2) 微生物培养计数法:Ⅰ类和Ⅱ类环境≤5 CFU/cm2;Ⅲ类和Ⅳ类环境≤10 CFU/cm2。

统计学方法:采用SPSS 19.0进行数据统计分析, 检测结果采用χ2检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

结果

消毒前后物体表面和医务人员手ATP检测结果:全院Ⅰ~Ⅳ环境共采集标本129个点位, 进行消毒前后ATP荧光检测, 对首次检测不合格的样本, 进行现场干预后再次检测, 见表1。

注:*为治疗车、供应室打包台面、手术室工作台面、内镜清洗台面等。

消毒前ATP总值 (536.25±1 239.14) , 消毒后ATP总值 (68.02±243.61) , 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。见表2。

消毒前后物体表面和医务人员手细菌培养计数法检测结果:全院Ⅰ~Ⅳ环境共采集标本129个点位, 进行消毒前后细菌培养计数法检测, 见表3。

细菌培养计数法消毒前总值 (12.82±22.75) , 消毒后总值 (1.30±5.46) , 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 见表4。

消毒后物体表面和医务人员手两种方法比较:全院Ⅰ~Ⅳ环境共采集标本129个点位, 应用ATP荧光检测法和细菌培养计数法同时检测。消毒后ATP荧光检测法的总合格率79.84%, 细菌培养计数法的总合格率99.22%。见表5。

注:*为治疗车、供应室打包台面、手术室工作台面、内镜清洗台面等。

注:*为治疗车、供应室打包台面、手术室工作台面、内镜清洗台面等。

注:*为治疗车、供应室打包台面、手术室工作台面、内镜清洗台面等。

讨论

本研究采用ATP生物荧光检测法和细菌培养计数法对我院Ⅰ~Ⅳ类环境的物体表面和医务人员手进行检测。本研究阐述ATP生物荧光检测法和细菌培养计数法对院感监测的效果评价, 探讨ATP含量 (RLU) 与微生物数量 (CFU) 之间的相关性。

本研究结果与国内文献报道一致[1,2]。据报道, 诺如病毒、艰难梭菌、不动杆菌等可在环境中长期存活并引发院内感染, 50%院感暴发与环境和手污染有关[3]。本研究分别取医务人员左右手和相邻的物体表面进行采样, 具有一定的可比性, 但由于临床实际操作中左右手和物体表面的污染程度和有机物的污染程度不同, 在一定程度上会影响配对检测的结果。

通过检测发现我院部分科室消毒工作没有严格按照制度和流程进行操作、治疗室台面和病房床头桌消毒不彻底、手卫生不按规范操作等情况。要求临床科室严格按照环境清洁消毒流程、频率及消毒方法执行物体表面的清洁消毒工作;严格按照七步洗手法和快速手消毒法进行规范化洗手。ATP检测值干预前和干预后差异有统计学意义, 说明现场干预起到了监督和指导作用。院感专职人员可根据现场检测结果进行现场干预、指导, 及时发现并纠正常规工作中存在的问题, 分析相关原因, 重新消毒, 再次检测达到消毒合格率100%。

我们采用ATP生物荧光法这种实时检测技术能够提高医院感染管理的执行力, 极大提高医院感染预防控制人员的工作效率。Huang等比较目测、微生物培养及ATP荧光检测法3种环境检测方法, 指出ATP荧光检测法是一种客观、敏感、快速的医院清洁评价方法[4]。Amodio等指出ATP可用于终末消毒的质量评价[5]。但ATP荧光检测法不能确定细菌种类, 与细菌培养计数法联合检测, 可以早期预警医院感染暴发的危险因素, 为及时干预提供科学依据。

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细菌培养与检测 篇7

1 材料和方法

1.1 一般资料

163例布鲁杆菌感染样本均来自源于本院2009年5月至2011年8月住院和门诊患者。其中男127例, 女36例;年龄30～60岁, 平均40岁。临床症状以发热、高烧为主, 并伴有肝脾肿大和关节酸疼。实验室检查以患者转氨酶升高、血红蛋白降低和血沉加快较常见。居住地区分布全疆, 主要集中于畜牧业较发达的疆内地区, 各地区之间无明显差异。临床诊断标准根据卫生部地方病防治司颁布的布病诊断标准[3]。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养与鉴定

临床留取疑似布病患者的静脉血5～10 ml, 接种于法国梅里埃公司生产的血培养瓶中, 放置全自动血培养仪Bacd/Alert 60中进行培养, 阳性报警后转种血平皿或巧克力平皿培养。细菌鉴定采用法国梅里埃公司生产的全自动细菌鉴定仪VITEK- Ⅱ。

1.2.2 琥红平板凝集试验

常规抽取患者血液1～2 ml, 待血液凝固后2 500 r·min-1离心15 min, 获得血清。取清洁脱脂玻片或有凹型孔的玻片, 在玻片上加0.03 ml被检血清, 然后加入0.03 ml琥红平板抗原 (中国CDC传染病所) , 摇匀或用牙签混匀, 在5 min内判定结果。以出现肉眼可见凝集颗粒判定为阳性 (+) , 未见凝集颗粒判定为阴性 (-) 。

1.2.3 试管凝集试验

取5支口径为8～10 mm的小试管, 第1管加入2.3 ml生理盐水, 第2、3、4、5管各加生理盐水0.5 ml, 在第1管中加入被检血清0.2 ml, 混匀后取0.5 ml加入第2管中, 充分混匀, 从第2管中取0.5 ml加入第3管, 以此类推至第5管, 最后从第1管和第5管中各吸取1.5 ml和0.5 ml弃去, 以保持相同反应体积。然后, 在1～5管中各加入10倍稀释的布鲁杆菌菌体抗原 (中国CDC传染病所) 0.5 ml, 每管最终反应体积为1 ml;血清稀释度从第1管至第5管分别为1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200和1∶400, 试管经充分振荡后置37 ℃温箱中孵育20～22 h, 取出后放室温2 h后根据各管中液体的透明程度与标准浊度管进行比对。结果判定:以不加菌液的生理盐水的透明度判为“++++”, 30倍菌液稀释的透明度判为“+++”, 20倍菌液稀释的透明度判为“++”, 13倍菌液稀释的透明度判为“+”, 10倍菌液稀释的透明度判为“-”。待检标本血清效价在1∶100 (++) 以上者为阳性, 1∶50 (+) 为可疑, 以下者为阴性。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 11.0统计学软件进行分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血液培养

163例布鲁杆菌病患者血培养均为阳性:血培养瓶报警时间为3～5 d, 传种在血平板上生长缓慢, 48 h出现针尖样大小菌落;革兰染色为阴性的短小杆菌;经全自动细菌鉴定仪VITEK- Ⅱ鉴定, 辅以形态学检查, 均为马耳他 (羊型) 布杆菌。

2.2 琥红平板试验

所有血培养阳性的患者血清经琥红平板凝集试验测定, 161例阳性, 2例阴性;与血培养比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

2.3 布病试管凝集试验

布病试管凝集试验检测结果发现, 163例病人血清标本中有156例阳性, 7例阴性;与血培养比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

3 讨论

布鲁杆菌病的诊断标准:根据流行病学史, 临床症状、体征, 实验室检查。其中, 实验室检查是布鲁杆菌病确诊的关键环节。布鲁杆菌感染的临床实验室检查有血清学检查和病原菌检查。目前, 病原菌检测是诊断布鲁杆菌病的金标准[4]。

布鲁杆菌为革兰阴性短小球杆菌, 又称布氏杆菌, 两端钝圆, 偶见两极浓染, 无动力, 无芽孢, 无荚膜, 常单个存在;对营养要求较高, 生长缓慢, 初次分离时需5%～10% CO2, 培养基中需含有维生素B1、烟酸、生物素等物质。根据病原性、宿主特性和表型特征的不同, 1985年WTO布鲁杆菌病专家委员会将布鲁杆菌属分为6个种, 即马尔他布鲁杆菌 (B.melitensis) 、流产布鲁杆菌 (B.abortus) 、绵羊布鲁杆菌 (B.ovis) 、猪布鲁杆菌 (B.suis) 、犬布鲁杆菌 (B.canis) 和沙林鼠布鲁杆菌 (B.neotomae) [5]。

本研究将血培养阳性的样本转种血平板, 继续培养48 h获得了针尖大小的菌落;通过革兰染色发现, 其不能很好地被碱性复红染色, 着色弱, 染色后呈现细沙状, 为革兰阴性小杆菌或球杆状, 不形成芽胞, 有时易被忽略;同时, 氧化酶、触酶、尿酶阳性;还原硝酸盐, 分解葡萄糖, 有时不分解阿拉伯糖和半乳糖;硫化氢、精氨酸双水解实验阴性, 符合典型的布鲁杆菌的生化反应特征。经全自动细菌鉴定仪鉴定, 为马耳他 (羊型) 布鲁杆菌。试管凝集试验是布鲁杆菌病诊断的标准方法[6], 利用抗原- 抗体相结合的原理, 在两者比例合适时可形成较大的不溶性免疫复合物, 菌体凝集后上清液清澈透亮, 根据其透明程度间接反映标本中抗体的含量。所用的抗原是商品化的标准抗原, 操作简单、结果可靠, 本试验以检测完全抗体为主 (IgM) , 由于IgM在pH为中性或弱酸性时凝集较为活跃, 因此检测结果的假阴性率较高。本研究163例标本中156例阳性, 7例阴性, 可能与本试验方法的假阴性率较高或患者已过急性期、血清中IgM消失有关。

琥红平板试验是20世纪70年代出现的一种应用于布病血清学筛查的简易、快速检验方法[7]。诊断液 (琥红抗原) 由琥红染料 (rose bengal) ——四氯四碘萤光钠盐和牛、羊、猪三型布氏杆菌混合标化制成, 是一种酸性且具有缓冲能力的染色抗原, 由于其特异性不高, 易受试验温度和凝集时间相对较短等因素影响, 因此不易准确判定结果。本实验163例布病血清标本有161阳性, 2例阴性, 与细菌培养有较高的符合率, 其原因可能是该试验可以同时检测IgG和IgM抗体, 故有较高的阳性率。

总之, 血培养是布病诊断的金标准, 然而, 血培养的阳性率受病程的影响, 差异较大;如果在感染的急性期 (感染症状出现7 d内) 进行血培养, 阳性率可达80%以上;但如果是慢性感染或单个器官局部感染, 培养阳性率只能达到10%[2]。临床上, 疑似布病患者宜早期行血培养检查。此外, RBPT和SAT结果与血培养结果有很高的符合率 (分别为98.8%和95.7%) , 与血培养结果比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 是简便、快速的辅助诊断方法。因此, 多种方法相互补充, 为临床诊断和鉴别诊断提供了可靠的实验室依据。

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犬细菌性腹泻的细菌分离培养与鉴定 篇8

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

庆大霉素、链霉素、林可霉素、头孢氨苄、菌必治等。

1.1.2 试验器材

生物显微镜、托盘天平、锥形瓶、电炉、载玻片、盖玻片、恒温培养箱、超净工作台、立式圆形压力蒸汽灭菌器、冰箱、接种环、酒精灯等。

1.1.3 试剂

乳糖、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂、胆盐、超纯水、中性红、结晶紫、95%乙醇、硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、拘橼酸盐、尿素、半固体琼脂、葡萄糖产气、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖等。

1.1.4 试验动物

试验犬均来自云南农业大学动物科学技术学院动物医院 (西站) 及康大妈流浪动物收容所。首先进行犬健康状况状况调查, 调查内容包括品种、年龄、性别、体重、临床症状, 引起犬腹泻的原因。根据犬的临床症状:出现呕吐, 慢性肠卡他, 厌食, 稀便, 血便, 渐进性消瘦, 营养不良, 精神不振, 体温升高, 脱水等有典型腹泻症状, 经诊断后排除病毒性腹泻及寄生虫腹泻可能的犬。

1.2 试验方法

1.2.1 粪样的采集

在动物医院里, 由于不可能随时都能采到新鲜粪便样品, 所以采用棉棒采集每只试验犬直肠深部少量粪便直接涂片观察, 并编号记录被检犬的年龄、营养状况、品种、性别等, 并保存待检。本次试验粪样采集时间为0d:2010年4月20日, 采到3个样品分别编号1、2、3。1d:2010年4月21日采到4个样品分别编号4、5、6、7。2d:2010年4月22日采到3个样品, 分别编号8、9、10。本次采样的犬品种不一, 有北京犬、雪橇犬、金毛、博美等。年龄从1月龄至8岁之间。各个体的粪样分别取2份。

1.2.2 培养基制备

麦康凯琼脂培养基制备, 麦康凯培养基用于肠道致病菌的选择性分离培养。配方如下蛋白胨20.0g, 乳糖10.0g, 胆盐5.0g, 氯化钠5.0g, 中性红0.03g, 琼脂14.0g, pH值7.1±0.2, 加热溶解于1000ml蒸馏水中, 121℃高压灭菌15min备用。本次试验使用的是由上海市医学化验所试剂厂生产的麦康凯琼脂培养基, 取样品52g加入1000ml蒸馏水中混合放置10min微火煮沸使之完全溶解, 115℃高压灭菌15min备用。鉴定原理为蛋白胨提供碳氮源、维生素和生长因子;牛胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长;氯化钠维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;乳糖为可发酵的糖类;中性红是pH指示剂, 细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。

1.2.3 粪样检测

每一个样品分别取少量的粪样经无菌纯水稀释后涂于载玻片上等干后用革兰氏染色法[5]染色之后进行镜检。

1.2.4 接种培养

将样品在超净工作台上分别接种到麦康凯琼脂培养基上, 并且标明接种的编号。接种时用采样的棉签轻轻涂抹于培养基的一头, 之后用接种环以“之”字型画开, 每涂过培养皿的一半时旋转90°, 接种环烧白灭菌后继续沿“之”字画开。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱培养24h。

1.2.5 生化鉴定

使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红实验、V-P试验、吲哚等分别配制生化鉴定管[5]。将培养皿中的典型菌种在超净工作台上接种至鉴定管中, 24h后观察结果。

1.2.6 药敏试验

使用药敏纸片呋喃妥因、链霉素、头孢氨苄、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、四环素、氯霉素、菌必治做两组药敏实验。以上药敏纸片均产自杭州天和生物试剂有限公司, 执行标准:WS/T125-1999。

1.2.7 注意事项

在操作中严格按照无菌操作, 使用明火、电时注意自身安全。实时记录试验数据。严格按照操作规程操作, 注意保护设备安全完整。

2 试验结果

2.1 粪样检测结果

在每一个便样的镜检中视野内大量存在革兰氏阴性、中等大小、两端钝圆的短杆菌, 呈单个或多个散在排列。从形态和革兰氏特性上判断在视野中的细菌为大肠杆菌[6] (图1) 。

2.2 接种培养结果

所有麦康凯培养基中均有均匀红色, 边缘整齐, 中心突起, 中等大小, 表面光滑湿润的散在菌落长出。其中1号培养皿有菌落200个, 2号有菌落185个, 3号有菌落50个, 4号有菌落130个, 5号又菌落70个, 6号有菌落150个, 7号有菌落134个, 8号有菌落124个, 9号有菌落125个, 10号有菌落113个 (图2) 。

2.3 生化实验结果

见表1。

注:“+”产酸;“—”阴性;“○+”产酸产气。

2.4 药敏试验结果

见表2。

注:敏感度按《抗菌药物药敏试验判断标准》抑菌圈大于等于20mm为极敏, 大于等于15mm小于20mm为高敏, 大于等于10mm小于15mm为中敏, 小于10mm为耐药。

3 讨论

3.1 生化分析

生化试验结果与动物传染病书上大肠杆菌基本特性相符[8], 而且与王云峰等[9]、孙善发等[10]的试验结果相一致。该菌能够分解麦芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸, 产酸产气, 不能产生硫化氢。因此从生化结果来看此菌种为大肠杆菌。

3.2 药敏分析

从药敏试验的结果来看, 该菌对头孢类, 和喹诺酮类[12]抗生素高度敏感, 但是林可霉素、四环素、庆大霉素的治疗效果不佳。这与有关的报道相符[11]。药敏试验说明该菌种已经对常用的药物产生耐药性。当前在犬细菌性腹泻的治疗中常常出现乱用抗生素, 或者使用了合适的抗生素却达不到良好治疗效果的现象。

3.3 犬病治疗中的误区

误区一:一泻就用止泻药。过早的服用止泻药, 或者是止泻药服用不当, 反而会延误病情, 甚至可以导致严重的并发症。误区二:先镇痛缓解腹泻, 感染性腹泻时可能会出现腹痛的现象, 一些犬主则习惯给犬服用654-2、颠茄片等止痛剂, 而且不按犬的的月龄, 随意使用。这种做法非常不安全, 因为止痛后, 不让肠蠕动, 会导致肠道蠕动功能瘫痪, 肠音消失或减弱, 容易引起肠黏膜脱落, 便血。误区三:一泻就吃消炎药, 许多人一看到犬腹泻, 就使用复方新诺明或诺氟沙星等抗生素。其实这种做法是不合适的。因腹泻有感染性和非感染性两类, 非感染性腹泻可由饮食不当、食物过敏、生活地域的改变、气候突变等原因引起, 此类腹泻使用抗生素治疗是无效的, 而应当服用一些助消化药或采用饮食疗法等。即便是感染性腹泻, 在选用抗生素时, 最好先做大便细菌培养, 明确致病菌种类, 再选用对细菌最敏感的抗生素进行治疗。切不可滥用抗生素。误区四:泻止就停药, 有的人腹泻常依症状服药, 即腹泻重时多服药, 腹泻轻时少服药, 稍有好转就停药。这样做很容易造成治疗不彻底而使腹泻复发, 或转为慢性腹泻, 给治疗带来很多困难[7]。正确的使用抗生素后, 就不能随便停用, 否则就容易使细菌产生耐药性。

3.4 试验犬与健康犬肠道菌比较

通过对引起犬细菌性腹泻的细菌进行分离鉴定得出的结果与健康犬的常规肠道菌进行对比发现。在正常的犬肠道内存在着许多种类的细菌其中包括需氧、兼性厌氧、厌氧细菌、真菌在内的45个菌属的约164种菌。涉及菌种包括链球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、埃希菌、双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌与链格孢霉等[13], 通过对正常犬只的大便进行培养也证明了这点。而引起这次细菌性腹泻的细菌培养后主要得到的是大肠杆菌, 说明了这些犬的细菌性腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起的。

4 结论

细菌学检验在医院感染检测中的作用 篇9

【关键词】 细菌学；医院感染；临床检测

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.723 文章编号：1004-7484（2013）-06-3455-02

医院感染也称为医院内获得性感染或者院内感染，其因医院的存在而出现的，近年来感染率明显的上升，不但使患者的痛苦感增加，同时也增加了患者的死亡率。医院感染主要分为三个部分，分别为：传染源的存在、传播途径以及易感人群，每个环节都与微生物学检查息息相关。医院内出现感染主要有两种类型，分别为外源性感染以及内源性感染。想要对每种类型的感染做出相应的诊断，就必须进行微生物学检查。本文选择2009年10月——2012年10月间出现院内感染的患者，对其细菌学检验结果进行分析，现总结如下。

1 对各种临床标本做出正确的病原学诊断

医院感染不是单独某个科室，包括临床上的所有科室，因现今介入性治疗的应用越来越多，放疗及化疗的不断开展，激素和抗菌药物的使用，尤其是不合理的使用抗菌药物，以及临床消毒灭菌中存在着一些问题等等，都会引起医院内出现感染现象，想要对其进行有效的预防、隔离以及治疗，就必须明确病原学诊断。现今，对细菌进行培养鉴定的技术种类很多，各种仪器也不断的完善和更新，这为病原学的鉴别提供了有力的保证，但是也不可忽视基本操作技术以及工作中积累的经验。例如正确的对下呼吸道分泌物进行采集，进行涂片、革兰染色镜检，穿刺液的涂片镜检，脓性分泌物的涂片镜检，运用简单的操作方法就能够做出初步的诊断，这为临床诊断提供了可靠的理论依据。

2 加强区域性细菌耐药监测

建立流行病学资料细菌的耐药状况有时间和地点的特异性，每种细菌在不同国家，不同区域表现出的耐药性有所不同，即使是在同一个区域，不同的时间段，表现的耐药性也有所不同。细菌耐药性的特点就对我们提出了一个要求，要实时的对细菌耐药性进行监测，建立自己的流行病学资料。这些资料可以指导临床抗感染用药，同时制定出使用抗生素的管理方法，这些都会对临床产生一定的指导意义。

3 定期向临床科室报告病原学鉴定结果以及细菌对抗菌药物敏感性试验结果

由于临床医生要对本院导致感染的常见致病菌以及相应的抗菌药物进行全面的了解，所得的数据就可作为临床医师在得到实验室明确诊断及药物敏感试验结果之间的参考数值。大家都知道，在对病原学进行诊断时，虽然运用很多方法来缩短化验的时间，但是仍然需要一定的时间。因而，定期对本院的病原学进行检查，常常可以将此结果作为临床医生的指导用药，等病原学检查结果出来后，在根据具体的细菌，调整用药。卫生部相关文件中对于医院感染管理委员会的职责指出，每隔半年要上报一次本院导致感染性疾病的病原菌，同时对抗病菌的敏感药物。

4 对医院以及重点科室的环境和医护人员的手进行病原学监测

导致医院发生感染的病原菌可存在于医院的环境中，也可以存在于医护人员和患者的身上，因而对医院进行微生物学监测非常有必要，例如对发生院内感染几率较高的科室或者病房内的物品及空气进行微生物学调查，尤其是一些比较特殊的部门，如手术室、换药室、婴儿室、产房以及ICU等等均需要密切进行微生物監测，同时要达到卫生部门的标准，在层流手术室的空气中，细菌的数量不应高于200CFU/m3。另外，医护人员要注意双手的消毒，这对预防医院感染具有重要的临床意义，因而要定期不定期的对医护人员的双手进行细菌学检测，同时要达到卫生部门的相关标准。医护人员的双手带菌情况根据科室的不同有所不同，一般要求不超过5-15CFU/cm2。如果出现医院流行性感染时，除了要对临床各项标本进行微生物学检查，同时还应对医院环境、隔离措施以及传播途径等方面进行微生物学监测和检查。

5 对消毒灭菌效果进行生物指标监测

在院内能够应用的消毒灭菌方法有很多种，例如干热灭菌、辐射、紫外线以及高压蒸汽灭菌这些成为无力灭菌法，洗必泰、环氧乙烷、戊二醛、季胺盐、甲醛以及碘伏等这些属于化学消毒法。有很多方法可以检测消毒灭菌的效果，如压力表检测法、留点温度计法以及化学指示剂法等等，但是最可行的方法还是生物指标，也就是说运用一些特异的菌种作为指示菌，将其被杀死的程度作为消毒灭菌的指标，例如嗜热脂肪芽孢杆菌作为压力蒸汽灭菌的生物指示剂，紫外线杀菌运用枯草芽孢杆菌黑色变种，运用枯草芽孢杆菌黑色变种和金黄色葡萄球菌作为化学消毒剂杀菌的指示菌。最近几年，出现的几起重大医院感染事件均与消毒灭菌是否彻底相关。

医院感染已经作为一门新的学科，我国监控及管理医院感染也只是10几年的时间。我国医院感染的发病率相对较高，抗生素的滥用情况比较突出，对手术室等消毒灭菌工作还存在着一些问题，一次性医疗物品的管理和适用还需要进一步完善，临床微生物学检验与医院感染的关系非常密切，也需要进一步加强。我们面对的任务还很艰巨，但是我们相信所有的医务人员都能通过自己的努力把我国医院感染的几率降到最低水平，将医院感染监控及预防工作上升到一个新的阶段。

参考文献

[1] 王建国，廖洋，杨静.2007年我院细菌流行分布及耐药情况分析[J].临床和实验医学杂志，2009，（09）.

[2] 宋艳文，张相萍.布氏菌病患者抗体测定与细菌学检验结果的对比分析[J].检验医学与临床，2008，（10）.

细菌培养与检测 篇10

副猪嗜血杆菌为革兰氏染色阴性, 有荚膜, 具有多种不同的形态。该菌生长时严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD或V因子) 。流行菌株在TSA平板的菌落呈针尖大小、灰白色、透明。本菌至少有15 种血清型, 另有大量分离株血清型不可定型, 目前在我国的主要流行菌株是4、5、14 和15 型等, 且不同地区不同分离菌株致病力差异较大。14~120日龄的猪均易感, 但通常见于5~8 周龄的猪发病。发病率10%~15%, 严重时死亡率可达50%~60%。

因此为了保证诊断的准确性, 在最短的时间内对猪群进行处理, 继而降低经济损失, 我们采取细菌分离与PCR结合的方法来对其进行研究。

1 材料

1.1 实验动物

某发病猪场的病猪及送检病、死猪。

1.2 临床症状

发热、食欲不振、厌食、反应迟钝、呼吸困难、咳嗽、疼痛 (尖叫) 、关节肿胀、跛行、颤抖、共济失调、可视黏膜发绀、侧卧, 消瘦和被毛凌乱, 随之可能死亡。急性感染后可能留下后遗症, 即母猪流产、公猪慢性跛行。肉眼病变主要是全身性浆液性、化脓性、纤维素性炎症, 包括心、肺、肝等内脏器官、腹膜、心包膜、胸膜、及其关节表面 (图3~6) 等, 尤其是腕关节和跗关节, 出现浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物。诊断本病时应注意与链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、支原体多发性浆膜炎和关节炎等相区别, 本病确诊有赖于细菌学以及分子生物学检查。

2 细菌学检测

2.1 主要试剂与仪器

牛血清、TSA、辅酶I (烟酞胺腺嘌呤二核苷酸NAD) 、培养基、培养箱、电子秤、摇床、高速冷冻离心机等。

TSA固体培养基: 准确称取胰蛋白大豆琼脂 (TSA) 40g, 加入940m L蒸馏水, 充分摇匀后加热至充分溶解, 高压蒸汽灭菌15min, 加入50m L过滤除菌的牛血清、10m L过滤除菌的0.01%NAD, 充分摇匀后倒平皿。

2.2 实验方法

无菌采集胸膜、胸腹腔积水、心包积液、关节液等病料, 分别接种于自制的TSA固体培养基平板, 置于5% ~10% CO2中培养, 37℃ 恒温箱培养24~48h后, 检查其在培养基上的生长表现、菌落特征等培养特性, 结果显示菌株在TSA平板的菌落呈针尖大小、灰白色、透明 (图1) , 然后纯培养与鉴定。

对培育菌株进行革兰氏染色以及培养后接种于脉酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等微型生化鉴定管等进行生化指标的测定, 37℃培养, 24~48h后观察现象。革兰氏染色阴性, 多种不同的形态的小杆菌 (图2) 。

将培育菌株划线接种于鲜血琼脂平皿, 用纸片法将20 种药物进行药敏试验, 37℃ 胚培养24~36h, 观察结果显示:本菌对头孢类抗生素、氨苄西林、氟喹诺酮类, 但对红霉素、氨基甙类、壮观霉素和林可霉素有抗药性。

3 P CR检测

3.1 主要试剂与仪器

电泳缓冲液TAE、PBS、DNA marker、EB、各种型号移液器及滴头、氯仿以及其他分析纯等。

PCR仪、电泳仪、电子天平、超净工作台、水浴锅、高速低温离心机、高压灭菌锅等。

3.2 实验步骤

将被检菌液12000r/min离心5min, 弃上清液, 用无菌水悬浮, 涡旋后于沸水中水浴10min后, 再放置- 20℃冻结, 然后12000r/min离心5min, 取上清液作为DNA模板。根据副猪嗜血杆菌序列设计引物, 由上海生某公司合成。

(1) 采用50μL反应体系: 上下游引物1.5μL, 2.5mmol d NTPs 4.0μL, Exbuffer 5.0μL, Ex Taq酶0.5μL, 模板DNA 8.0μL、灭菌双蒸水30μL。反应循环参数:94℃预变性5min, 94℃变性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸40s, 共30 循环;最后72℃延伸10min, 4℃保存。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的大小。

(2) 1%琼脂糖凝胶的配制:称取3g琼脂糖, 加入300m Llx TAE溶液, 微波炉加热至完全溶解。稍微冷却, 加入溴化乙锭 (EB至终浓度为5μg/m L) , 趁热倒入制胶槽, 高度约0.5cm, 自然凝固后, 小心拔出梳子, 将平板放入电泳槽中, 加样孔一端朝向阴极。电泳槽内倒入足够的1XTAE溶液, 使之正好没过制好的琼脂面。

(3) 加样:PCR产物15μL与3μL 6X加样缓冲液混合均匀, 用微量进样器吸取混合液, Tip头伸入液面以下, 对准加样孔, 缓慢推出使样品垂直落入加样孔内。电泳:盖上电泳槽电泳40~50min, 然后在凝胶成像仪中观察结果。

3.3 实验结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳, 获得一约822bp的特异性片段, 与预期结果相符。经序列测定, 其序列与目的基因序列一致。

4 结论

4.1 近年来, 该菌在我国猪群普遍存在 (感染率呈明显的上升趋势) , 且临床症状又与链球菌、胸膜肺炎放线杆菌等疾病极其相似不易区分, 因此必须通过细菌分离及PCR检测的方法进行确诊, 避免因误诊造成不必要的损失。

4.2 副猪嗜血杆菌抗药性日渐增强也已成为不可忽视的问题, 疾病发生的早期, 治疗或保健性预防用药效果明显, 但一定要选择敏感的抗菌素药物。大多数副猪嗜血杆菌对头孢类抗生素、氟苯尼考、替米考星及喹诺酮类高度敏感, 但对一些氨基甙类、壮观霉素和林可霉素有抵抗力, 所以说, 对猪场副猪嗜血杆菌进行定期的敏感性药物监测, 有利于减少经济损失, 保证猪群健康。

4.3 接种副猪嗜血杆菌疫苗是预防该病最有效的方法之一, 但不同血清型菌株之间的交叉保护率相对较低, 因此, 疫苗的使用具有一定的区域性和局限性, 一定要有血清型的针对性才能取得良好的防疫效果。从当地分离的菌株制备灭活苗, 可有效控制副猪嗜血杆菌病的发生。同时做好猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病、口蹄疫等预防免疫工作, 大大有利于减少本病的发生。