病原细菌（精选九篇）
病原细菌 篇1
云南省玉溪市蓝莓一般成熟于6~8月, 属于高温多雨季节, 且蓝莓是呼吸跃变型浆果, 果实糖分含量较高, 采后呼吸作用旺盛, 各种生理代谢加快, 又因含水量较高, 因此采后贮藏过程中果实易发生变质、腐烂等贮藏病害, 造成大量损失, 严重影响其商品性和经济价值。蓝莓耐藏性特别低, 常温下 (18~22℃) 放置5~l5d, 果实易腐烂。Connor等研究表明, 蓝莓果实在22℃温度下, 2~4日开始出现失水萎蔫、软化、褐变、腐烂等症状[4]。目前, 国外关于蓝莓贮藏病害的研究报道, 主要集中在采后病害防治, 而在国内, 蓝莓贮藏病害致病病原菌已经分离鉴定出几种常见的真菌, 包括灰葡萄孢、草酸青霉、褐孢霉、链格孢和枝顶孢[5], 关于蓝莓贮藏期腐败细菌分离鉴定鲜有报道。本试验采用分子、形态鉴定方法, 对蓝莓果实贮藏病害中几种常见腐败细菌进行分离鉴定, 判断其所属种类。本实验结果对蓝莓腐败细菌予以初步识别, 为防治蓝莓果实贮藏病害、延长蓝莓贮藏保鲜期提供了理论依据和技术指导。
1 材料与方法
1.1 材料
蓝莓果实采摘于云南省玉溪市澄江地区蓝莓基地, 蓝莓采后立即运回西南林业大学微生物实验室。选择大小一致、无病虫、无损伤的健康果实作为试验材料, 用蒸馏水清洗后置于室温条件 (温度18~22℃, 相对湿度90%~95%) 贮藏3~7d, 从自然发病果实的新发病害部位获得分离材料。
1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基 (NA培养基) :蛋白胨10g, 牛肉膏5g, 琼脂粉16g, 氯化钠5g, p H值7.4~7.6, 加水补足1 L, 121℃高压灭菌20min。NA液体培养基配方同固体培养基但不加琼脂粉。
1.3 试验仪器
PCR仪, 美国Bio-RAD公司;电子恒温不锈钢水浴锅, 萧山永发电器有限公司沪南实验仪器厂;电泳仪和电泳槽, 北京六一仪器厂;制冰机, 美国Grant雪花制冰机公司;离心机和微量移液器, 德国eppendorf公司;高速冷冻离心机, 德国SORVALL公司;超净工作台, Thermo公司;光照培养箱SPX-300B-G型, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;凝胶成像仪G:BOX, 英国Syngene公司;奥林巴斯光学显微镜。
2 试验方法
2.1 病原细菌的分离与鉴定
从蓝莓新发病害交接处取果皮组织, 用无菌水冲洗3次后, 于NA平板上采用平板划线法分离, 后于恒温培养箱30℃倒置培养2d;将获得的菌落纯化3次以上直至获得单一菌落后, 镜检, 转接到NA斜面, 待菌苔长出后于4℃临时保存。
2.2 病原细菌的显微观察
挑取少量处于对数期的病原细菌菌体制作涂片, 采用革兰氏染色法染色后[6]后在显微镜下观察照相。
2.3 病原菌细菌的分子鉴定
2.3.1 病原菌细菌DNA的提取。
将纯化后菌株接种于NA液体培养基, 30℃振荡培养24h, 13000r/min, 离心1min, 收集菌体。收集的菌体用生理盐水离心洗涤3次, 后用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取试剂盒提取细菌基因组DNA。提取的DNA在含有荧光染色剂的0.8%琼脂糖凝胶上水平电泳检测, 并用凝胶成像系统观察照相。
2.3.2 16s r DNA的扩增。
16s r DNA的PCR扩增采用细菌通用引物27F和1492R, 引物由硕阳生物技术有限公司合成。正向引物27F:5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’;反向引物1492R:5’TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3’。反应采用25μL细菌PCR反应体系, 反应体系见表1。
按上述组分配制好反应液, 混匀后进行PCR扩增, 反应程序:94℃起始变性5min;94℃45S, 56℃45S, 72℃1min30S, 35个循环;72℃延伸5min。
PCR产物在含有染色剂的0.8%琼脂糖凝胶上水平电泳检测, 并用凝胶成像系统观察照相。
2.3.3 16s r DNA的测序及序列分析。
将上述16s r DNA的PCR产物送到北京诺赛基因组研究中心有限公司测序, 测序引物同扩增引物。测序结果利用DNAMAN软件拼接, 拼接好的序列在Eztaxon Server 2.1进行序列比对, 并在Gene Bank的数据库 (http://ww.ncbi.nlm.nih.gov) , 下载相近的参比16s r DNA序列, 用MEGA 6软件构建系统发育树, 并进行序列相似性分析。
3 结果与分析
3.1 病害发生症状
蓝莓果实腐烂初期表面呈浅褐色水渍状病斑, 继而变褐软腐, 3~7d后扩展全果, 使果肉变褐软腐, 表面密生灰白色软毛, 发病部位没有一定的规律, 腐烂部分可深入到果心。
3.2 病原细菌传统形态学鉴定结果及革兰氏染色结果
病原细菌培养后的菌落形态如图1, 菌落形态观察结果:L-5菌落平坦, 不透明, 不光滑, 有粉红色分泌物;L-6菌落平坦, 不透明, 菌落表面有浅桔黄色分泌物;L-7菌落平坦, 不透明。菌落表面有桔黄色分泌物。
细菌采用革兰氏染色显微图像如图2, 菌株L5、L6和L7菌均为短杆状, 革兰氏染色程阳性, 且都具荚膜。
3.3 病原细菌分子鉴定结果
3.3.1 16s r DNA的PCR扩增结果。
以细菌通用引物27F和492R作为引物, 对蓝莓贮藏期分离出的3株病原细菌进行16s r DNA扩增, 扩增的电泳检测结果如图3, 均能得到清晰稳定的条带, 片段约为1500bp。
3.3.2 16S r DNA全序列测定和同源性分析。
将上述所得供试菌株的PCR产物测序, 测序结果用DNA-MAN软件拼接, 拼接结果于Eztaxon Server 2.1进行序列比对, 比对结果如表3, 由表2可知:菌株L-5与Serratia nematodiphila DZ0503SBS1相似性为98.48%;菌株L-6与Microbacterium arborescens DSM 20754相似性为99.09%, 菌株L-7与Curtobacterium albidum DSM 20512相似性为98.93%。根据16S r RNA序列相似性达到97%以上则认为是同一个属[7], 若序列相似性小于96%~97%的可以认为不是同一个种, 小于93%~95%的可以认为不是同一个属[8]的划分原则, 确定分离得到的3株病原细菌L5、L6和L7分别属于沙雷氏菌属 (Serratia) 、微杆菌属 (Microbacterium) 和短小杆菌属 (Curtobacterium) 。在Gen Bank上下载与分离得到的3株病原菌序列相近的菌株序列, 利用MEGA 6软件建立系统发育树, 进行系统发育学分析如图4, 由图4可见L5、L6和L7分别隶属于3个系统发育分支, 分别为沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属分支, 这与序列比对分析结果一致。
综上所述, 通过平板划线培养分离得到引起蓝莓贮藏期腐烂的3株优势细菌, 经形态学观察结合16S r DNA序列分析, 分别属于沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属。
4 讨论与展望
引起果品腐败的微生物通常包括细菌、霉菌和酵母, 以细菌和霉菌引起的果品腐败最为常见, 其中:细菌中的非芽孢杆菌由于不产生芽孢且热抵抗力较弱, 是新鲜果品中的常见腐败菌。在自然界存在的细菌中, 非芽孢细菌的种类比有芽孢细菌多, 因此污染果品的机会较多。本实验中分离鉴定出引起蓝莓腐烂的3种杆菌分别属于沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属, 实验表明, 非芽孢杆菌的腐败细菌可以导致贮藏期蓝莓腐烂。据报道, 在冬季贮存甜瓜腐烂组织也分离出沙雷氏菌属的菌株。分离的细菌类群中沙雷氏菌属是在自然界中作为人类的条件致病菌, 该属有的种可能与人类菌血症有关[9]。崔慧玲等在鲜切生菜贮藏过程中分离鉴定出腐败细菌微杆菌属的某一种[10], 本实验也从贮藏蓝莓果实腐烂发病部位分离鉴定出1株微杆菌属中的腐败细菌。此外, 本次实验首次从蓝莓果实中分离得到1株短小杆菌属细菌。
上述结果表明, 腐烂蓝莓组织中存在有害细菌类群, 针对此情况, 可以采用低温控制结合化学灭菌的方法进行蓝莓采后贮藏, 具体操作工艺流程有待后续进一步深入研究。
摘要：为明确云南省玉溪市蓝莓果实腐烂的病原细菌种类, 对玉溪市澄江地区蓝莓果实进行致病细菌分离, 对分离的病原细菌进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。实验结果表明, 从发病腐烂的蓝莓果实上分离出3株病原细菌, 初步确定属于沙雷氏菌属 (Serratia) 微杆菌属 (Microbacterium) 和短小杆菌属 (Curtobacterium) 。研究结果对玉溪澄江地区蓝莓贮藏期腐烂病害的防治和进一步深入研究将提供一定的参考理论依据。
关键词：蓝莓,细菌,分离鉴定
参考文献
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一种草鱼细菌病病原的分离鉴定 篇2
关键词：铜绿假单胞菌；感染；草鱼；鉴定
中图分类号：S941 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.014
Identification and Isolation of Bacterial Pathogens from Bacterial Disease of Grass Carp
DENG Wei
（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals， Tianjin 300221，China）
Abstract： An epizootic was discovered in grass carp （Ctenopharyngodonidellus） in earthen ponds in Ninghe. The diseased fish presented with hemorrhaging in the abdominal wall， ascites in the abdomen and pale liver. Strains named PA001 and PA002 were isolated from the moribund fish， and were identified as Pseudomonas aeruginosa according to biochemical tests. The pathogenicity of PA001 was confirmed by infectivity experiments. According to the result of antimicrobial susceptibility testing， florfenicol were used by oral administration， and the result showed that it was an effective measure to control the disease.
Key words： Pseudomonas aeruginosa； infection； grass carp； identification
假单胞菌是鱼类“赤皮病”的病原菌，该病对淡水养殖鱼类危害严重，常引起较大的经济损失[1]。在假单胞菌属之中，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、绿针假单胞菌和变形假单胞菌都能导致鱼类的病害发生[2-5]。然而，有关铜绿假单胞菌能引发鱼类疾病的报道却很少见，尽管其常作为一种人类病原被报道。本研究报道了一例由铜绿假单胞菌引发的草鱼疾病。
1 材料和方法
1.1 病原菌的分离
2013年5月8日，10尾患病草鱼从天津市宁河县某养殖场送至本实验室进行诊断。通过镜检草鱼的鳃和体表，未发现大量的寄生虫。在无菌操作下，从濒死草鱼的肾脏、肝脏和脾脏取样，在LB培养平板上分离病原菌，28 °C培养24 h 后，选取优势菌落进一步分离纯化，分离得到两株优势菌株PA001和PA002。
1.2 细菌的鉴定
菌株PA001和PA002的形态、生理生化特性按文献[6]的方法进行鉴定。同时利用法国梅里埃公司的半自动细菌鉴定仪对菌株进行鉴定。
1.3 人工感染试验
试验草鱼由天津市换新良种场提供，共60尾，体长（12±2.1） cm。草鱼饲养于50 L的圆形塑料桶中，充气，每天按体质量的2%投喂膨化饲料，上下午各投喂1次。暂养2周，确认无病后，开始试验。将PA001用LB培养基培养，5 000 g离心集菌，用PBS洗涤3次后，用麦氏比浊法将菌液浓度调整为1.0×107 CFU·mL-1，腹腔注射草鱼0.2 mL，对照组注射同样剂量的PBS，连续观察2周。
1.4 药敏试验
28 °C培养过夜的PA001用PBS调整浓度至1×108 CFU·mL-1，取100 μL涂布于Mueller-Hinton琼脂平板，然后将药敏纸片（购于杭州微生物公司）贴在平板上，28 °C培养24 h 后测定抑菌直径，按照产品说明书判断敏感度。
2 结果与分析
2.1 病原菌的鉴定
PA001和PA002呈现相同的生理生化特征，为革兰氏阴性杆菌，具有运动性，不产生孢子。在LB平板上28 °C培养48 h后，菌落成圆形，湿润，边缘整齐，不透明，淡黄色，菌落直径约为2～2.5 mm。同时，在血平板上，两株细菌都具有β溶血，其他生化反应与铜绿假单胞菌ATCC 27853株具有相同的结果（表1），因此，根据常规生理生化测试可初步判定为铜绿假单胞菌。
利用ATB鉴定系统对PA001和PA002进行鉴定，两株细菌显示完全相同的鉴定结果，都显示为铜绿假单胞菌（表2）。
2.2 人工感染试验
试验组草鱼在感染后第5天出现死亡，至14 d，累计死亡率为67%。人工感染后试验鱼表现为活动减弱，腹部充血，腹腔有积水，个别死亡鱼眼球突出。死鱼解剖检查，可见肝脏发白，同自然发病的症状基本相似，对照组不表现任何症状。从感染后的病鱼肝脏中再次分离细菌，用优势菌PA001-1再次感染草鱼，得到相同的结果。
2.3 药敏试验
根据菌株PA001对12种药物的药敏试验结果，该菌株对妥布霉素、四环素和氟苯尼考等3种抗生素敏感，对链霉素、氯霉素和庆大霉素等3种抗生素中度敏感，对诺氟沙星、氨苄青霉素、红霉素、罗红霉素、卡拉霉素和万古霉素等6种抗生素显示出耐药（表3）。
3 结论与讨论
草鱼是我国的四大家鱼之一，年产量达229.7万t[7]。然而，由于集约化程度和养殖密度的不断提高，草鱼病害也日渐增多。据报道，荧光假单胞菌[5]、柱状黄杆菌[8]、嗜水气单胞菌[9]、霍乱弧菌[6]和拟态弧菌[6]都曾引起草原细菌性病害的暴发。本试验中，铜绿假单胞菌从患病草鱼肝脏中被分离到，且通过攻毒试验证明其对草鱼的致病性，这说明铜绿假单胞菌是引起此次草鱼疾病的病原。然而，由于能对嗜水气单胞菌产生拮抗作用，为了控制嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症，铜绿假单胞被作为一种益生素用于鲮鱼的养殖。由于铜绿假单胞菌对草鱼的致病性，它作为益生素使用的安全性应给予高度的重视。
此次疾病流行了1个月，导致了超过30%的草鱼死亡，根据药物敏感性的试验结果，利用口服氟苯尼考（每尾鱼25 mg·kg-1·d-1）的方法对草鱼进行治疗，3 d后病害得到控制，1周后草鱼停止死亡，这表明药物敏感性试验在治疗药物筛选过程中具有很强的实际意义。所以，在今后的生产实践中，应根据药物敏感性试验结果，做到科学合理地选择和使用药物。
参考文献：
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病原细菌 篇3
1 发病情况
2013年3月, 笔者接到龙岩市某猪场求助, 反映该猪场每批40~80日龄保有猪常出现精神萎顿, 突然死亡, 发病率15%~30%, 病死率高达80%。该猪场按副猪嗜血杆菌病进行治疗, 效果不好。经现场剖检, 采集病料送实验室检测确定为猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病等多病原混合感染。
2 临床症状
患猪食欲减少, 精神沉郁, 呼吸困难, 咳嗽, 气喘, 喜卧, 消瘦, 被毛粗乱, 鼻孔有黏脓性鼻液溢出, 体温升高至40~41℃, 食欲不振、眼睑水肿、眼角分泌物增多。部分猪腹泻, 背部、胸腹部及四肢末梢等处皮肤发红、出血。部分猪耳朵及躯体发绀, 精神沉郁, 采食量下降。个别猪只甚至不食, 卧地不起, 后肢关节肿大。部分猪只尖叫, 四肢划动表现神经症状, 患猪病死率高达80%, 治疗效果很差。也有部分患猪无任何症状突然死亡, 母猪与肥育猪无明显症状。
3 病理解剖
患猪胸腔和心包内有大量淡黄色浑浊积液, 胸腔有大量纤维素样渗出物覆盖心脏;肺脏呈红褐色花斑状, 肺间质增宽、水肿, 呈间质性肺炎, 表面有出血点和出血斑, 肉样变;肝脏、脾脏变硬;胆囊充盈;肾脏呈淡黄色, 表面有散在大小不等的灰白色坏死灶;膀胱积尿、尿液浑浊、黏膜充血;关节肿大、变形, 切开肿大的关节腔, 可见有淡黄色样液体溢出, 关节积有清亮的胶冻样液体。全身淋巴结肿大, 特别是腹股沟、肠系膜和肺门淋巴结肿大较明显, 切面湿润, 充血、出血或呈灰白色, 扁桃体充血。
4 实验室检查
采集该场8头发病典型的保育猪病料送华中农业大学实验室进行检测, 病毒检查结果为:猪瘟、伪狂犬病均为阴性, 6头猪圆环病毒2型阳性, 5头变异蓝耳病病毒阳性, 有4头是两种病毒混合感染;细菌检查结果为:分离到6株副猪嗜血杆菌, 5株链球菌, 有4头是副猪嗜血杆菌和链球菌两种细菌的混合感染 (副猪嗜血杆菌为优势菌) 。
5 药敏试验
按常规纸片法进行药敏试验, 结果是副猪嗜血杆菌对头孢拉定、氨苄青霉素、头孢曲松钠、环丙沙星高度敏感, 对氧氟沙星、阿莫西林、强力霉素、恩诺沙星、壮观霉素、复方新诺明中度敏感, 而对链霉素、庆大霉素、克林霉素、林可霉素、万古霉素、四环素、阿米卡星、新霉素、乙酰螺旋霉素等不敏感;链球菌对头孢曲松钠、阿奇霉素、头孢拉定、氨苄青霉素高度敏感, 对林可霉素、强力霉素、卡那霉素、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星、新霉素、复方新诺明、阿米卡星等中度敏感。对阿莫西林、链霉素、壮观霉素、克林霉素、万古霉素、四环素、乙酰螺旋霉素等不敏感。
6 防治
6.1 治疗
患猪选用易速达 (Excede, 主要成分为头孢噻呋钠) 0.3 m L/头和易康 (免疫复合多肽) 进行治疗, 对发病严重的猪进行隔离治疗。
6.2 饮水
每吨水添加强力多维500 g, 连用5 d。
6.3 拌料
每吨饲料添加雅定兴 (20%替米考星预混剂) 400 g、免疫激活肽 (黄芪多糖) 1 000 g, 连用15 d。
6.4 推荐仔猪免疫程序
10日龄免疫猪蓝耳病和圆环病毒病苗, 15日龄免疫副猪嗜血杆菌病和链球菌病苗, 25~28日龄进行猪瘟苗一免, 35日龄加强免疫副猪嗜血杆菌病和链球菌病苗, 42日龄免疫伪狂犬基因工程苗, 49日龄进行口蹄疫苗一免, 60日龄二免猪瘟苗, 70日龄二免口蹄疫苗, 130日龄进行口蹄疫苗三免。
6.5 推荐药物保健
(1) 断乳仔猪转群前注射1 m L长效头孢噻呋钠。 (2) 断乳后7 d内在饮水中添加电解多维、氨卡西林钠 (含克拉维酸钾) 、优质黄芪多糖。 (3) 保育中后期在饲料中添加酒石酸异戊酰泰乐菌素、氧氟沙星、维生素C, 连用10~15 d。
经采取以上治疗措施, 2周后该场的疫情逐步得到控制。
7 小结与讨论
1) 该猪场检测结果显示猪蓝耳病毒、猪圆环病毒两种病毒在猪群中感染率较高, 其中还存在两种病毒的混合感染, 可见该场保育猪的问题根本在病毒病, 其对猪群应激状态下的隐患及对仔猪免疫力的破坏不容忽视。
2) 根据实验室对临床分离的蓝耳病毒的基因分析, 猪场流行的蓝耳病毒以变异蓝耳江西毒株 (JX-A1) 为主, 建议选择做变异毒株蓝耳疫苗江西毒株, 在使用该苗时一定要注意先保健 (黄芪多糖、替米考星) , 一周后没有问题再打疫苗。
3) 由于多数中小型猪场无法实行“全进全出、分区饲养”模式, 而呈现蓝耳病持续感染和抗体依赖性增强现象, 这是当前蓝耳病危害猪场的重要原因。
4) 圆环病毒近年危害日益严重, 在一定程度上超过了蓝耳病毒, 特别是对保育猪造成的多系统衰竭综合征及其引起的种猪繁殖障碍问题。该类病症往往是猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病这几个主要病原以混合感染的形式导致, 圆环病毒在其中则是破坏基础免疫、也是引起发病的主要“元凶”。从各规模化猪场的防治经验上看, 控制猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病时, 若能同时做好圆环病毒疫苗免疫则效果更佳。
5) 单凭临床经验判断很可能只是确定副猪嗜血杆菌病的继发感染而忽视链球菌病的存在, 易漏诊而造成防治效果不好。
6) 治疗该病的方法报道较多, 但关键是早发现、早治疗。在用药过程中, 药量、疗程要增加, 应连续用药 (15 d以上) , 以大剂量维持血液中药物有效抑菌浓度。病情好转并恢复健康后, 还要坚持用药1~2 d, 巩固疗效, 避免复发。药物应用须根据药敏试验结果选择敏感药物进行防治,
7) 猪场细菌型致病病原血清型众多, 猪链球菌有35个血清型, 副猪嗜血杆菌已知有15个血清型以上, 其血清型众多, 并且各血清型间的交叉免疫原性差, 每个地区主要流行血清型都不尽相同。养猪场应根据自场流行特点选择相对应的疫苗免疫。
病原细菌 篇4
【关键词】 老年呼吸道感染；病原性细菌；临床检验分析
文章编号：1004-7484（2013）-12-7748-02
呼吸道感染在医学临床上是经常可见的一种呼吸系统疾病。不管是婴儿、青年或者老年人，患上呼吸道感染疾病特别是肺炎，可对身体带来十分严重的伤害。对于老年人来说，其身体素质比较低，在身体功能及机体免疫的反应能力比不上青壮年，日渐下降，极其容易并发高血压、冠心病及糖尿病等疾病[1]。另外，近年来抗生素在医学临床上泛滥使用导致形成普遍耐药菌的状况。因此，当老年人出现呼吸道感染症状时，对病原性细菌进行诊断就变得特别重要。目前医院对呼吸道感染病原菌的诊断多数凭借对痰进行培养作为检验手段。但如何增加检验手段的合格率就需要依靠质量控制的帮助。质量控制主要指为了符合质量要求而使用的作业技术及活动，其主要透过监控质量产生的整个过程，将导致质量在每个阶段出现不合格或者不如意效果的因素全部清除。
1 资料与方法
1.1 一般资料 抽取我院开展病原性细菌确诊的老年呼吸道感染患者100例，其中男60例，女40例。年龄50-80岁。随机分为实验与比较两组，每组50例，两组患者在一般资料上经过比较差异不存在统计学意义（P>0.05），可进行比较。
1.2 标本采集 进行留取痰标本使用的方法包括自然咯痰、气管穿刺吸取及通过支气管镜抽取等方法。由于气管穿刺吸取及通过支气管镜抽取的方法取痰，操作过程复杂且患者存在一定的痛苦，所以多数医院主要使用自然咯痰方法，但是操作过程中需要确保痰液的新鲜，特别是进行细胞学检查的痰液更加要求新鲜度。留取痰标本的方法：留痰过程中患者先多次使用清水漱口，然后再使劲咳出气管内的痰，留放在事先准备好的玻璃、塑料小杯或者内部涂蜡的纸盒内。而无痰或者痰少的患者则使用经过45℃加温后的100g/L氯化钠水溶液雾化吸入，促使痰液容易被咳出。而小儿患者可使用轻微挤压脑骨柄上方的办法，诱导其将痰咳出[2]。昏迷患者则对其口腔进行清理后使用负压吸引法来吸取气管内的痰液。痰標本需要抽取后马上送检，防止细胞及细菌出现自溶破坏的现象。但是聚合酶链式反应能够形成假阳性的效果，当前对其在临床的运用价值依旧还在研究及观察的过程中。测24h痰量或者观察分层状况时应该将痰咳在无色的广口瓶中，再加少量石炭酸起到防腐的效果。
1.3 检验方法 使用绵羊血、巧克力、麦康凯脂、溴甲酚、十六烷基三甲钱、甘露醇高盐以及巧克力杆菌肤等多种琼脂培养基对老年呼吸道感染患者的痰液标本实行培养。
2 结 果
病原性细菌在每种培养基培养获得的分离数量存在差异现象。绵羊血琼脂培养基的病原性细菌分离数为：绿脓杆菌20，白色念珠菌10，金葡菌2，肠杆菌群菌4，酵母菌2，肺炎链球菌2。巧克力琼脂培养基的病原性细菌分离数为：绿脓杆菌22，白色念珠菌15，流感嗜血杆菌5，副流感嗜血杆菌21，金葡菌2，肠杆菌群菌4，酵母菌2，肺炎链球菌2。麦康凯琼脂培养基的病原性细菌分离数为：绿脓杆菌6，白色念珠菌6，肠杆菌群菌种9，酵母菌3，肺炎链球菌4。溴甲酚琼脂培养基的病原性细菌分离数为：绿脓杆菌离数为23，白色念珠菌14，流感嗜血杆菌5，酵母菌3。十六烷基三甲钱琼脂培养基的病原性细菌分离数为：绿脓杆菌3。甘露醇高盐琼脂培养基的病原性细菌分离数为：白色念珠菌9，金葡菌2。巧克力杆菌肤琼脂的病原性细菌分离数为：绿脓杆菌24，白色念珠菌16，流感嗜血杆菌5，副流感嗜血杆菌12，金葡菌1，肠杆菌群菌4。
3 讨 论
老年人患上呼吸感染的特点跟其他人的患病特点不相同。首先，老年人患呼吸道感染的发病速度缓慢，症状极其不明显，病情开始时患者浑身无力，精神不振或者急躁不安[3]。有些患上肺炎的患者身体无发热症状，偶尔出现心率变快；有些患心脏病的患者出现心力衰竭却无显然的呼吸道感染症状，还有部分患者呼吸道炎症状严重，但其在临床上出现症状却为咳嗽轻度，痰量少。这些现象的产生均由于老年人的自身抵抗力比较低，机体反应能力十分差，反应不灵敏。其次，老年人患上小病也有可能引发肺炎，或者病情更为严重的疾病。老年患者如果对其忽视治疗，不仅可能转变成肺炎，甚至还可引发心力衰竭疾病，出现心律紊乱，糖尿病情变重以及造成肾功能障碍与败血症等状况。第三，患上肺炎的老年人有时候病情十分危险，容易出现中毒性的休克症状，尽管病情很严重，但患者体温却不升高，还由于休克而降低，这些症状是由于老人自身抵抗力比较差，被打击后机体无力反应，如果白细胞增高，这个情况更加危险[4]。根据上述的特点，老年人患呼吸道感染需要重视，一旦出现轻度的症状需要马上到医院进行治疗，避免病情增重以及引发另外的疾病，因此增强病原性细菌的检出率也就变得特别重要。
我院本次试验结果为：铜绿假单胞杆菌几乎在每种培养基中都可以分离，其次，副流感嗜血杆菌、白色念珠菌以及流感嗜血杆菌等的分离数量也不小，和痰标本病的原菌分离培养进行比较存在很大的差异：出现这种现象的原因不仅受到标本留取不恰当的影响，还可由于取样前使用的抗生素、标本存活寄居菌以及不可分离出的致病微生物等因素产生作用而受到影响，同时后一影响差异存在的因素也可证明目前使用的标本采集及检验方法存在局限性，在临床使用上需要重视方法的正确步骤。
参考文献
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[3] 胡祝连.对老年人呼吸道感染的病原分析[J].当代医学，2011，25（10）：65-66.
病原细菌 篇5
为更好地治疗AECOPD患者, 本文对本科2010年1月-2011年9月因AECOPD住院的167例患者从血液、痰液标本中分离出的病原菌进行分类分析, 了解本地区AECOPD患者的菌群分布, 指导临床合理使用抗生素。现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
标本来源于2010年1月-2011年9月因AECOPD在本科住院的167例患者 (其中伴发热患者34例的血液、痰液, 对标本进行培养。男112例, 女55例, 平均年龄 (60.3±14.9) 岁。
1.2 方法
167例患者从入院后第一天起, 每天早晨用清水漱口后深咳痰, 取第2口痰标本, 置于专用的痰培养器皿中30 min内送检, 连续3 d, 34例发热患者双手均同时行需氧菌、厌氧菌培养。共获得637份细菌标本。
2 结果
2.1 637份细菌标本共分离出232株病原菌, 培养阳性率为3 6. 4 2%, 细菌耐药率较低。痰液标本阳性率为43.51%, 明显高于血液标本10.29%的阳性率。
见表1、表2。
2.2 革兰氏阳性菌57株, 占24.57% (57/232) , 革兰氏阴性菌1 6 4 株, 占70.69% (1 6 4/232) , 白色念珠菌11株, 占4.74% (11/232) , 与徐平等[2]报告结果 (革兰氏阳性菌占20.71%, 革兰氏阴性菌占65.27%, 白色念珠菌占6.69%) 相似。
见表3。
2.3 占前5位细菌依次为大肠埃希氏菌 (117株) 、金黄色葡萄球菌 (47株) 、铜绿假单胞菌 (36株) 、白色念珠菌 (11株) 、甲型副伤寒 (8株) 。
见表3。
2.4 痰液标本培养阳性率 (43.51%) 比王卓等[3]报道的50.0%低, 可能与送检痰标本合格率低有关, 提示注重留取痰液的质量;血液标本的阳性率 (1 0. 29%) 与林建鹏等[4]报道的1 0. 2 3%相似。
3 讨论
卢家胜等[5]报告细菌感染是引起COPD加重的最常见原因, 合理有效使用抗生素在AECOPD治疗中有重要作用, 及时了解COPD的细菌谱和耐药情况, 有助于临床抗生素的选择。COPD患者感染以革兰氏阴性杆菌为主, 主要为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等, 革兰氏阳性菌以金黄色葡萄球菌为主。痰液培养阳性率明显高于血液标本, 临床医生要及时、正确采集痰液送检, 提高痰标本的合格率, 连续2次以上晨痰细菌培养均为同一优势菌就应视为病原菌, 尤其对于基层医院而言。血液培养检出率不高, 要注意采集标本前是否使用抗生素、足够血量以及双份标本的采集。
前5位细菌大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、甲型副伤寒中前3位与高磊等[6]报告菌群相似。大肠埃希氏菌检出率最高, 可能与大肠埃希氏菌为本院院内感染的主要细菌, 且此类患者年纪偏大、反复住院有关。细菌耐药率及白色念珠菌检出率较低与当地经济生活水平不高, 使用抗菌药物的抗菌谱较窄有关, 而甲型副伤寒的检出则与当地气温较高、喜吃凉菜密切相关。
笔者认为收治AECOPD患者时, 临床医生应及时进行细菌学检查, 痰培养快捷、简便, 价格相对低廉, 只要检出细菌, 对临床医生而言意义重大, 尤其在基层医院可操作性强。同时要以全国细菌耐药监测网报告作为临床使用抗菌药物的指南, 开展当地详细的细菌菌群分布的动态研究, 掌握当地病原菌菌群的变迁, 加强药物敏感性、耐药性的监测, 只有这样, 才能做到合理使用抗菌药物, 避免耐药菌株的增加。
参考文献
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[2]徐平, 宋卫东, 刘媛媛, 等.慢性阻塞性肺疾病急性细菌性加重患者病原菌分析[J].中国感染与化疗杂志, 2010, 10 (2) :108.
[3]王卓, 夏国光, 姚婉贞.慢性阻塞性肺疾病急性加重期病原学研究[J].中国全科医学, 2009, 12 (21) :1942-1944.
[4]林建鹏, 龙淑珍, 马秋儿.发热患者血培养阳性的病原菌分布和耐药性研究[J].检验医学与临床, 2011, 8 (13) :1557-1560.
[5]卢家胜, 李乔, 赵卫星.AECOPD痰培养及药敏分析[J].中外医学研究, 2011, 9 (29) :69.
病原细菌 篇6
水中致病微生物种类繁多, 现在还不能用单一方法来分离和鉴定水中所有致病微生物, 也没有可从饮用水中定量分离出数量很少病原体的有效方法。所以通常以水中指示微生物代替致病微生物进行检测, 从而估计污染状况。所采用的方法主要是经典的滤膜过滤或培养基培养, 用于细菌的计数或根据特殊的物化性质判断病原的存在。已提出的指示微生物包括大肠杆菌、细菌总数、产气荚膜梭菌、大肠杆菌噬菌体、枯草杆菌芽胞黑色变种及脊髓灰质炎病毒等。其中大肠杆菌一直被作为常规的水质细菌学指标[3]。
在我国, 农村小型集中式供水和分散式供水因条件限制尚不能使供水水质完全符合水质常规检验项目极限值, 目前按照《农村小型集中式供水和分散式供水水质要求》执行[4]。根据“标准”规定, 菌落总数不高于500 CFU·mL-1 , 总大肠菌群、耐热大肠菌群及大肠埃希氏菌均不得检出。所检项目中一项指标不合格则判断该水样不合格。
通过检测细菌总数、耐热大肠菌群和总大肠菌群3项细菌学指标的变化, 分析北京农村饮用水中病原细菌的污染特征。
1 材料与方法
1.1 材料
品红亚硫酸钠试剂盒、MFC培养基、KF链球菌琼脂培养基、营养琼脂培养基均购自北京希尔诚公司。
1.2 方法
1.2.1 采样点设置
根据北京市郊区农村地理、人口等分布情况确定52个采样点, 其中怀柔区11个、房山区4个、大兴4个、通州区2个、门头沟6个、昌平6个、延庆区7个、顺义1个、平谷3个、密云8个。从2008年9月～2009年12月对上述采样点采集水样2次共104份水样。所有采样点的位置均用GPS定位。
1.2.2 采样方法
500 mL细口瓶经清洗后高压灭菌。入户采样, 每个样品取500 mL后, 立即封好。贴好水样的标签, 现场水样采集后立即放入冷却箱中保存, 4 h内测定。同时用GPS确定用户的位置。
1.3 检测方法
检测内容包括农村生活饮用水水源类型、取水方式、水温、菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群。细菌总数、总大肠菌群和耐热大肠菌群根据卫生部颁布的《生活饮用水检验规范》[5]进行检测。
2 结果与分析
2.1 集中式供水与分散式供水微生物指标超标率
所采集的104份水样中, 集中式供水采样14份, 占总采样份数的13.46%, 分散式供水采样90份, 占86.54%。经检测, 集中式供水菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群3项指标的超标率平均为0, 57.14%, 21.43%。分散式供水菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群3项指标的超标率平均为6.67%, 84.44%, 25.56%。集中式供水的细菌学指标超标率均低于分散式供水 (见表1) 。
2.2 分散式供水中不同取水方式微生物超标率
所采集水样按取水方式分, 采用机器取水、压水井 (手压泵) 、缸内储水的农户分别占总采样数的66.67%、8.89%和24.44%。3种取水方式中, 采用手压泵取水水样的微生物指标超标率最高, 采用缸内储水水样的细菌学指标超标率最低 (见表2) 。
2.3 不同水源类型微生物超标率
采用机器取水方式采60份水样, 按饮用水水源类型分为浅井水、深井水、山泉水, 其中以浅井水为饮水水源所占比例最大。饮用浅井水的农户占采样总数的40.38%, 饮用深井水的农户占13.46%, 饮用山泉水的农户占3.84%。经检测, 分散式供水不同水源类型微生物指标超标率由低到高依次为深井水、浅井水、山泉水, 其超标率分别为38.10%、42.06%和50.00% (见表3) 。
2.4 各检测微生物指标的超标率
分散式供水监测的3项细菌学指标中, 细菌总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群平均超标率分别为5.67%, 80.77% 和 25.00%。总大肠菌群的平均超标率最高, 集中式供水超标率为57.14%, 分散式供水超标率为84.44%;其次是耐热大肠菌群, 集中式供水超标率21.43%, 分散式供水超标率25.56%;细菌总数的平均超标率最低, 集中式供水没有检出超标, 分散式供水超标率为6.67%。
3 讨论
通过研究, 水样中细菌总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群的数量均存在超标现象, 其中, 总大肠菌群的平均超标率最高, 其次是耐热大肠菌群, 最低的为细菌总数。尽管国家对农村地区的居民饮用水标准已经较城市水质标准有所放宽, 但是通过检测发现, 农村生活饮用水中某些细菌学指标合格率仍较低。吕亚荣等人[6]也指出农村饮用水安全问题较之城市更为突出。分析其原因有3个方面。
3.1 农村地区多为单村供水
长期的卫生习惯及基础设施滞后, 对饮用水水质造成威胁。农村污水和雨水排放系统还不完善, 村庄排水多为地表漫流, 生活污水随意排放, 未经处理的污水就近排入沟渠、河道、渗井, 对地表水源和地下水源造成影响。此外, 水源卫生防护较差, 井盖封闭不严;有的水源周围30 m范围内有牲畜圈、渗水沟、垃圾堆等, 水源受到畜禽粪便和生活垃圾等污染。
3.2 自然条件限制
北京农村以地下水作为居民主要供水水源, 其供水方式分为集中式供水和分散式供水。农村集中式供水系统较城市供水系统不完善, 消毒不规范甚至不消毒。已有报道指出, 北京市通州区[7]、怀柔区[8]安装消毒设施的仅占2.57%、5.40%, 绝大部分水源水未进行过滤消毒。同样, 与城市供水一样, 集中式供水的二次污染也是造成饮用水污染的原因之一, 在集体供水的管网中, 长距离管道运输, 管道陈旧生锈, 蓄水池不清洁或常年不消毒, 都可造成二次污染。二次污染使细菌、病毒和藻类繁殖, 再加上原有的氯及氯化物、铁锈、重金属、放射性物质使水体浑浊、有异味[9]。
3.3 北京农村供水方式以分散式供水为主
在菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群3项细菌学指标检测中, 分散式供水的超标率均高于集中式供水, 在更大程度上存在着被细菌污染的风险, 这也与赵艳华等人[10]的研究结果一致。
从对分散式供水不同取水方式的研究结果来看, 各种方式的水样细菌学指标的超标率均较高。手压泵取水的水质超标率最高, 主要是由于水源开放式取水易受污染[11]。在采样中, 许多农户采用缸内储水, 在本次研究中占全部采集水样的24.44%。由于存在季节性缺水, 到了冬季, 缸内储水所占的比例还会进一步增加。通过检测, 缸内储水水样的细菌学指标超标率较手压泵和机器取水低, 但平均超标率仍达到了31.82%, 总大肠菌群的超标率更达到了77.27%, 分析原因主要是缸内的水由于存放时间过长, 一定程度上导致了微生物繁殖概率的增加, 容易导致细菌学超标, 饮用水质无法保证。因此缸内储水被微生物污染的风险也不容忽视, 是引起农村居民饮用水超标的原因之一。
按饮用水不同的水源类型, 微生物指标超标率由低到高依次为深井水、浅井水、山泉水。分析其原因为泉水属地面水, 较深水井, 泉水与浅层井水水源更易受到人、畜、禽等粪便的污染。
分散式供水超标率较集中式供水偏高, 可能与下列原因有关:①集中式供水由村管水员统一管理, 定期维护, 可及时发现和排除水源安全隐患;②分散式供水的水源散布在各家各户, 而且多数居民家中有渗水厕所、家禽饲养等污染源, 村中虽然有管水员, 但不能进行有效的管理。
王小英等[12]也对不同季节饮用水水质做了研究。其研究表明, 每年的枯水期和丰水期监测结果差异均无统计学意义, 地下水不随季节变化而变化。这与该研究的结果相同。从延庆、怀柔等地区具体情况来看, 细菌学指标超标的程度较大, 最高达到超出限值540%。
综上所述, 北京农村地区的饮用水安全问题较之城市更为突出, 应引起重视。加强水源保护, 减少污染源对水源水质造成的潜在危险;规范集中式供水制水工艺;加强农村饮水卫生监测, 为改善饮水水质提供科学依据。
参考文献
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病原细菌 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年7月至2015年5月在我院治疗老年呼吸道感染患者122例作为研究对象。其中男65例,女57例;年龄61~79岁,平均(70.23±1.02)岁;患者病程1~12 d,平均(5.98±1.12)d。
1.2 方法
1.2.1 标本采集方法
在进行采集工作之前,患者需进行多次漱口工作[1],确保口腔干净之后用力咳出气管深处的痰液,采集患者的痰液之后将其置于无菌容器中。
1.2.2 检验方法
标本采集完成后需尽快对其进行药敏测定,药敏结果的判断标准则采用CLST标准,应用生化实验卡进行药敏试验,按照规定进行操作[2]。应用青霉素、左旋氧氟沙星、复方新诺明等药物进行革兰阳性菌测定,应用庆大霉素、阿米卡星、亚胺培南、环丙沙星等药物进行革兰阴性菌测验,1周后应用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等质控菌株进行药敏质量控制[3]。
2 结果
2.1 痰细菌培养结果
122例中,革兰阳性菌共40株:21株金黄色葡萄球菌占17.21%;12株屎肠球菌占9.83%;7株肺炎链球菌占5.74%。革兰阴性菌共64株:23株铜绿假单胞菌占18.85%;21株肺炎克雷伯菌占17.21%;12株鲍曼不动杆菌占9.83%;8株大肠埃希杆菌占6.56%。真菌共18株:10株白色假丝酵母菌占8.2%;8株毛霉菌占6.56%。
2.2 药敏结果
革兰阳性菌对青霉素耐药率为63.6%~90%,但其耐受万古霉素能力较差;革兰阴性菌对头孢曲松(43.8%~77.8%)和氨苄西林(92.0%~100%)有着较高的耐药性。
3 讨论
呼吸道感染是一种可由细菌和病毒引起的常见感染性疾病,但由于老年患者自身抵抗力及机体能力下降且同时伴随着糖尿病、冠心病等原因,在进行药物治疗时存在着较大的风险[4]。老年患者若患上该病,不仅会出现休克、中毒等现象,甚至还会导致患者死亡[5]。在进行医学检验时,应该严格按照规定执行,保证各检验科室的配合度,进而提高检验的准确性[6]。
本研究结果显示,革兰阳性菌存在量大的主要原因是其能够较强的耐受青霉素,但其耐受万古霉素能力较差;革兰阴性菌存在量最大的原因是其对头孢曲松和氨苄西林有着较高的耐药性。
综上所述,老年呼吸道感染患者病原性细菌中,革兰阴性菌所占比例最大,主要是因为其耐药性强,因此在治疗时应该根据患者的具体药敏情况采用合适的抗生素进行治疗,以提高患者的康复速度。
参考文献
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病原细菌 篇8
1 资料与方法
1.1 临床资料
回顾性分析我院2013年1月-2014年12月收治的126例呼吸道感染患者。其中男73例, 女53例, 男女比例1.38∶1;年龄41~79岁, 平均年龄 (62.5±5.2) 岁;住院时间4~23d, 平均住院时间12.6d。患者因咳嗽、咳痰、呼吸困难, 伴或不伴发热收住入院。
1.2 方法
1.2.1 痰标本采集:
痰液检查是诊断呼吸系统疾病病因、进行疗效观察及判断预后的重要检查。痰标本的采集主要有以下两种方法: (1) 自然咳痰法:患者于清晨清醒后用清水漱口数次 (以免口腔杂菌污染痰标本) , 用力咳出深部第一口痰 (不得少于1ml) , 留于无菌容器内用于送检, 应尽量避免或减少唾液及鼻咽部分泌物的混入, 影响检验结果。咳痰困难者可于雾化吸入或口服祛痰剂后留取痰标本。自然咳痰法因其方便患者自己实施而成为最常用的痰标本采集法, 但此法取标本容易污染。 (2) 经环甲膜穿刺气管吸引或经纤维支气管镜 (简称纤支镜) 防污染双套管毛刷取标本可防止咽部寄生菌污染, 对肺部微生物感染的病因判断和药物选择有重要价值。痰标本送检1次/d, 连续2~3次培养为同一菌株方可认为是致病菌[2], 为了确保检测结果的准确性及可信性, 一般24h内不重复采集标本。
1.2.2 致病菌培养鉴定及药敏检测:
痰标本采集后需尽快 (2h以内) 送至检验室, 不及时运送可导致流感嗜血杆菌等致病菌由于不适应外界环境和自溶现象而死亡, 或由于细胞代谢或酶失活等原因影响检测结果准确性。将留取合格的痰标本接种于血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基、麦康凯琼脂培养、十六烷基三甲钱琼脂、巧克力杆菌肤琼、甘露醇高盐琼脂等多种培养基上, 将涂板后的痰标本置于37℃培养箱进行培养。痰标本培养鉴定过程严格按照《全国临床检验操作规程》要求进行。在培养分离菌株时, 使用Microscan全自动细菌鉴定及药敏系统检测, 根据CLSI标准来判定药敏实验结果。测定抗革兰阳性菌药物, 包括青霉素、克林霉素、万古霉素、复方新诺明及左氧氟沙星, 测定抗革兰阴性菌药物, 包括庆大霉素、头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、阿米卡星、左氧氟沙星、亚胺培南、妥布霉素、氨节西林及氨曲南。
2 结果
2.1 呼吸道病原菌的分布情况
126例患者共培养分离出病原菌148株:革兰阳性菌85株 (57.43%) , 革兰阴性菌46株 (31.08%) , 真菌17株 (11.49%) 。本院收治的126例呼吸道感染患者, 最常见的感染菌株为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和肺炎克雷白杆菌。见表1。
2.2 致病菌药敏情况
药敏结果显示:主要革兰阳性菌对青霉素耐药率达57.8%~72.6%, 而对万古霉素缺乏耐受性。主要革兰阴性菌对氨苄西林耐药率达90%以上, 约90.7%~99.6%, 同时, 革兰阴性菌对头孢曲松耐药率也较高, 约58.9%~74.8%。
3 讨论
呼吸道感染作为临床上一中常见的疾病, 在各年龄阶段均有发病。呼吸系统疾病在农村人口死亡原因中占第一位, 而城市也有较高的发病率和致死率。同时由于人体各系统相辅相成, 呼吸道感染极有可能引起其他系统的疾病, 进而加重其他系统疾病, 使其他系统疾病发病率和死亡率明显增加。由于呼吸道感染致病菌种类的庞大, 以及抗生素滥用而引起的致病菌耐药性日益增加, 导致呼吸道正常菌群失调, 呼吸道感染致病菌中革兰阴性菌和真菌感染所占比例不断上升[3], 使呼吸系统疾病的治疗面临着更加严峻的挑战。对于呼吸道感染患者, 通过临床检验研究确定致病菌, 对临床治疗过程中用药具有指导性意义。因此, 定期对医院呼吸道感染患者的病原菌进行检验检测对患者康复起到至关重要的作用[4]。同时, 医务工作者也应致力于研究新的致病菌检验方法, 使检验结果更加具有可信度。只有在确定致病菌种的情况下, 医护人员才能根据每个患者不同的情况, 给予不同的药物治疗, 使药物使用更加合理化、规范化。
而就细菌耐药性而言, 越来越多的细菌产生耐药性, 且耐药水平越来越高, 细菌耐药性播散迅速, 已成为一个严重的全球性公共卫生问题。细菌耐药性的出现, 造成现存有效抗菌药不断失效, 进而限制治疗方案的选择。耐药菌感染导致患者住院时间延长, 医疗费用增加, 医院感染发病率和病死率增高, 人类面临着抗生素耐药性危机。因此, 科学、有效地控制细菌耐药性的产生和扩散显得尤为必要。细菌耐药性的防治, 可从以下几方面入手: (1) 加强细菌耐药性的监控, 减少选择压力; (2) 科学合理 (“合理”是指:严格掌握抗菌药物应用的适应证;正确选择抗菌药物和配伍;正确掌握剂量、疗程和给药方法) 用药, 防止耐药菌株产生; (3) 严格执行消毒隔离制度, 防止耐药菌的交叉感染; (4) 寻找新型抗菌药物和新的抗感染方法。
因此, 对呼吸道感染患者进行病原菌检测, 针对致病菌种正确合理地使用抗菌药物, 促进患者早日康复, 是每一个医护工作者的责任。同时, 尽管致病菌检测对临床治疗更合理用药提供了理论依据, 但是, 在临床工作中, 应结合患者的病情及经济状况选择更加合适的治疗方案, 为患者减轻负担的同时, 节约医疗资源[5]。
参考文献
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[4]周阿旺, 徐静.下呼吸道感染的病原菌分布及耐药性分析〔J〕.中华医院感染学杂志, 2012, 22 (19) :440-444.
病原细菌 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土壤样本采集
在作物生长季节,分别采集不同生态区农田及林区5~10cm耕层土壤16份,置无菌纸袋中,于实验室内自然风干。取风干土样5g置于研钵中,充分研磨成微小颗粒(土壤粉末),用于微生物的分离。
1.1.2 供试植物病原菌
大豆根腐茄镰孢菌(Fusarium solani)、大豆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、菜豆根腐病菌(Fusarium solani)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)和马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)等由本单位植物免疫室保存提供。
1.2 方法
1.2.1 植物病原诱导菌及菌液制备
以番茄枯萎病菌、大豆根腐病菌、小麦赤霉病菌和大豆菌核病菌作为分离拮抗细菌的诱导菌。分别将上述植物病原真菌PDA平板培养基中,加入适量无菌水,制成病原菌孢子悬液待用。
1.2.2 拮抗细菌的分离
采用土壤颗粒撒布法[6,7]进行拮抗菌的分离。取50μL病原指示菌菌液,均匀涂布于PDA平板上,室温放置30min。取各土壤粉末样本少许,用吸耳球吹散土样,使其飘落在涂布有指示菌的培养基表面,28℃培养48h后,挑取产生抑菌圈的菌落,经分离、纯化得到单菌落,于4℃保存于LB斜面培养基上。
1.2.3 拮抗菌抑菌能力测定
1)拮抗细菌及植物病原菌的培养。植物病原菌番茄枯萎病菌、大豆根腐病菌、小麦赤霉病菌和菜豆根腐病菌分别在PDA平板28℃培养7d长满平板后待用。待测细菌菌株接入King’s B培养基(蛋白胨20g·L-1,磷酸氢二钾1.5g·L-1,硫酸镁1.5g·L-1,pH7.2),28℃180r·min-1振荡培养48h待用。
2)双重对峙培养。待测菌株接种液,均匀三点接种于PDA培养基边缘(各接种点距PDA培养基中心点相同),每点20μL,设无菌King’s B培养基为对照。28℃培养24h后,将病原菌5mm菌饼置于PDA培养基中央,重复3次。28℃培养7d后,测量病原菌菌落直径,并计算抑菌率。
抑菌率(%)=(R-r)/R×100
式中:R为相向待测拮抗菌株的病原菌菌丝生长最大半径;r为相对待测拮抗菌株的病原菌菌丝生长半径。
1.2.4 拮抗菌发酵滤液抗植物病原真菌活性测定
1)拮抗菌株发酵滤液的制备。拮抗菌株接入King’s B液体培养基,28℃180r·min-1振荡培养72h后,将发酵液离心(4℃,8 000r·min-1,20min),收集上清液,并用0.22μm滤膜过滤除去菌体,制成无菌发酵滤液待用。
2)植物病原菌平板制备。6种植物病原真菌PDA平板培养基中,加入适量无菌水,制成病原菌孢子悬液,取400ul孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板上晾干,待用。
3)抑菌活性测定。采用平板扩散测定法。制备好的病原菌平板,用打孔器(φ=5mm)每板均匀分布3点打孔,孔内加入100μL拮抗菌无菌发酵滤液,以无菌的King’s B培养液为对照,重复3次。置28℃培养,待对照菌落长满培养皿时,采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
2 结果与分析
2.1 拮抗细菌的分离与纯化
以大豆根腐病原菌、大豆菌核病菌、番茄枯萎病菌和小麦赤霉病菌4种植物病原菌为诱导菌,采用撒布土壤微小颗粒于病原菌平板表面的方法,从不同生态区土壤样本中,共获得55株拮抗菌株(见表1)。菌落形态特征多为灰白色、少数为黄色、不透明菌落,大小不等、扁平状,表面干燥、有皱褶,呈火山口状、放射状或不规则状。
表1 拮抗菌株、植物病原诱导菌及土样来源Table 1 Antagonistic bacteria,indicators and the source of soil samples
2.2 拮抗菌株的抑菌作用
以镰刀菌属(Fusariumspp.)引起植物土传病害的菜豆根腐病菌、小麦赤霉病菌、番茄枯萎病菌和大豆根腐病菌为目标菌,采用双重对峙培养法,分离获得的细菌菌株对病原真菌抑菌能力测定结果表明,对菜豆根腐病菌抑菌率≥36.0%的有35株,达60%以上1株;对小麦赤霉病菌抑菌率≥40.0%的38株,达60%以上菌株有12株;对大豆根腐病菌抑菌率≥33%的32株,达50%以上3株;对番茄枯萎病菌抑制率≥38.9%的36株,达60%以上菌株有8株。除QBN1菌株仅对小麦赤霉病菌表现出一定的抑菌活性外,其余菌株均对供试的4或3种病原菌表现出一定程度的抑制作用(见表2)。
表2 拮抗菌株对几种土传病原真菌菌丝生长的抑制率Table 2 The mycelial inhibition ratio of antagonistic bacteria against several soil borne pathogenic fungi
同列数字后的不同字母表示邓肯氏测验差异达0.05显著水平。下同。Different lowercases in the same column indicate significant difference at 0.05level by Duncan’s new multiple range test.The same bellow.
2.3 拮抗菌株发酵滤液对植物病原真菌的抑制作用
6种植物病原菌在42株拮抗菌发酵滤液平板上生长时,均受到不同程度的抑制(见表3)。对大豆菌核病菌表现出有抑菌活性的菌株24株,抑菌圈直径大于25 mm的12株。其中,TY、YY3C和YFHW2菌株抑菌活性最高,抑菌圈直径分别为34.0、31.8和30.0 mm。对水稻稻瘟病菌表现出有抑菌活性菌株26株,抑菌圈直径大于25mm的11株,BQD1和LFY4菌株抑菌活性最高,抑菌圈直径分别为31.0和29.2 mm。对玉米大斑病菌表现出有抑菌活性的菌株36株,抑菌圈直径大于40mm的11株,YS7和TY菌株抑菌活性最高,抑菌圈直径分别为56.2和50.7mm。对小麦根腐病菌表现出有抑菌活性的菌株36株,抑菌圈直径大于30 mm的12株,YS7和TY菌株抑菌活性最高,抑菌圈直径分别为41.8和41.3mm。对水稻恶苗病菌表现出有抑菌活性的菌株31株,抑菌圈直径大于25mm的5株,NH2、YS7和LFY5菌株抑菌活性最高,抑菌圈直径分别为28.7、28.7和28.1mm。对马铃薯早疫病菌表现出有抑菌活性的菌株18株,抑菌圈直径大于25mm的5株,NH2、BQD1和YF-HW1菌株抑菌活性最高,抑菌圈直径分别为37.7、35.3和34.0mm。
拮抗菌株代谢产物对6、5或4种拮抗对象表现出有抑菌活性的拮抗菌分别有9、11和7株,分别占供试拮抗菌的21.4%、26.2%和16.7%,表明这27株菌株代谢产物的抑制作用具有广谱性(见表3)。从6种拮抗对象的菌丝生长抑菌圈直径大小来看,供试菌株的代谢产物对玉米大斑病菌的拮抗作用最强,平均抑菌圈直径34.1mm,其次分别为小麦根腐病菌(25.6mm)、大豆菌核病菌(24.8mm)、水稻稻瘟病菌(23.8mm)、马铃薯早疫病菌(20.1mm)和水稻恶苗病菌(18.3mm)(见表3)。
表3 42株菌株代谢产物对植物病原真菌抑菌活性Table 3 The antifungal activity of metabolites of 42 antagonistic bacteria strains against plant pathogens
表4 42株菌株代谢产物抗菌谱等级划分和统计分析Table 4 The antifungal spectrum classification and statistics of metabolites from42 strains
a:拮抗谱等级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分别指抗6、5、4、3、2及1种病原真菌。b:括号内的数值为某一等级拮抗菌的株数占抗某种靶标病原真菌拮抗菌总株数的百分率。a:Antifungal spectrum gradeⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵrepresented against 6,5,4,3,2and 1kind of pathogenic fungi,respectively.b:The numerial values in bracket represented the percentage of a certain grade of antagonistic bacteria number for the total number of antagonistic bacteria against the target pathogenic fungi.
3 结论
以大豆根腐病原菌、大豆菌核病菌、番茄枯萎病菌和小麦赤霉病菌4种植物病原菌为诱导菌,撒布采自不同生态区土壤样本的微小土壤颗粒于病原菌平板表面,快速有效地分离筛选到55株拮抗菌株。
获得的菌株,对以镰刀菌属(Fusariumspp.)植物病原菌引起的土传病害菜豆根腐病、小麦赤霉病、番茄枯萎病菌丝抑制率达60%以上的拮抗菌株,分别有1、12和8株,对大豆根腐病菌丝抑制率达50%以上的有3株。
9株菌株发酵滤液对6种植物病原菌均具有不同程度的抑菌效果,表明菌株发酵产物的抑制作用具有广谱性。YS7菌株发酵产物对玉米大斑病菌、小麦根腐病菌、水稻恶苗病菌表现较强的抑菌活性,抑菌圈直径分别为56.2、41.8和28.7mm。TY、BQD1和NH2菌株发酵产物,分别对大豆菌核病菌、水稻稻瘟病菌和马铃薯早疫病菌抑制作用最强,其相对应抑菌圈直径分别为34.0、31.0和37.7mm。
参考文献
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