脊髓缺血再灌注损伤

脊髓缺血再灌注损伤（精选十篇）

脊髓缺血再灌注损伤 篇1

1 材料与方法

1.1 材料及动物分组

选用健康雄性兔(济宁医学院实验动物研究中心提供)30只(在实验过程中死亡3只,补3只,共33只),体重2.0～2.5 kg,随机分为三组,每组10只,A组正常饮食(ND)+假手术,只暴露腹主动脉,但未结扎,B组ND+缺血再灌注,缺血30min,再灌注48 h,C组KD(每100 g食物中含脂肪70 g,蛋白20 g,碳水化合物10 g)[2]缺血再灌注,缺血30 min,再灌注48 h。

各组兔分别给予ND或KD 6周后手术。

1.2 模型制作

耳缘静脉注入3%戊巴比妥钠1.0 mL/kg进行麻醉,观察兔无异常后将其仰卧固定于手术台上,术中用烤灯于上方持续加热,使直肠温度保持在38℃左右,常规剪毛,取腹正中切口,消毒,铺无菌巾,逐层打开腹部,暴露腹主动脉并分离至肾动脉水平,用无创伤血管夹在肾动脉起始部远端夹闭腹主动脉,血流阻断,见股动脉搏动消失,下肢颜色发绀。30 min后去掉血管夹,进行再灌注;检查腹腔,见腹主动脉及腹腔均无异常,无明显损伤出血,逐层关闭腹腔,脊髓缺血再灌注损伤模型完成。

1.3 检查指标

1.3.1 神经功能评价

分别于再灌注后48 h后对三组脊髓缺血再灌注损伤模型进行后肢神经功能评分。按照神经行为学功能评分[2]并记录,0级:完全瘫痪;1级:轻微的功能活动;2级:下肢运动良好,但不能站立;3级:能站立,但不能正常行走;4级:可行走,但不灵活;5级:完全恢复。

1.3.2 组织学检测

兔再灌注48 h后,切除L2～4椎板,充分显露L3～4节段硬脊膜,切断周围神经根,剪开硬脊膜,将同一节段脊髓取出,置4%多聚甲醛溶液中固定。将固定组织制病理切片,HE染色,光镜下观察。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.5对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,等级资料采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评价

A组动物活动无异常。B组动物缺血30 min再灌注48 h后均出现不同程度的双后肢瘫痪,神经功能出现明显障碍,在评分上与A组比较,差异有高度统计学意义(P<0.01)。C组动物部分出现后肢瘫痪的状况,与B组比较稍轻,在神经功能评分上比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各组兔神经行为学评分结果见表1。

2.2 组织学观察

A组神经元胞体边缘清晰,细胞呈多极形,细胞核位于中央且正常,核仁无变化,见图1;B组神经元细胞明显肿胀,模糊不清晰,细胞核变浅,出现神经细胞坏死,留下死腔。细胞质出现肿胀,纤维排列不规则,见图2;C组出现轻微的血管充血,较少出现神经元细胞固缩、形态结构改变,见图3。

3 讨论

脊髓缺血再灌注损伤在临床上经常出现,究其原因是多因素引起的不可逆性损伤。能量代谢障碍、氧自由基、钙离子超载等因素在脊髓缺血再灌注损伤中起主要作用[3]。脊髓缺血再灌注损伤过程中,大量多聚不饱和脂肪酸存在脊髓组织中,在氧化攻击中十分敏感,氧自由基有较强的氧化性,进而引起脂质过氧化,使脊髓发生继发性损伤,从而造成炎症反应,导致神经细胞变性坏死[4]。脊髓缺血再灌注损伤是在临床上常见的一种损伤,可致患者双下肢瘫痪等严重并发症,对患者危害极大[5],在医学上仍为一大难题。

本实验结果表明通过神经功能评价C组与B组,结果显示C组神经功能障碍减轻,后肢瘫痪也有所改善。病理组织学观察C组神经元细胞损伤较正常饮食组减轻。说明生酮饮食对兔脊髓缺血再灌注损伤有保护作用。KD是一个高脂、低碳水化合物和适当蛋白质的饮食,它模拟了人体饥饿的状态。脂肪代谢产生的酮体主要是由于糖摄入被严格限制后,脂肪在肝脏氧化产生大量乙酰辅酶A,由于其大于三羧酸循环能力,进而生成β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate,β-HB)、乙酰乙酸(acetoacetate,ACA)、丙酮酸三种酮体。其中D-β-HB和ACA对细胞具有保护作用,因此,KD具有抗凋亡抗、氧化作用。富含脂肪酸的KD还可以明显减轻神经系统损伤后的炎症反应[6],通过研究表明,KD降低了兔脊髓缺血再灌注损伤引起的神经元损伤。

摘要：目的 探讨生酮饮食对兔脊髓缺血再灌注损伤的影响。方法 选用健康雄性兔45只,随机分为三组,A组行假手术,B组给予正常饮食(normal diet,ND)+缺血再灌注,C组生酮饮食(ketogenic diet,KD)6周后+缺血再灌注,B、C组结扎兔腹主动脉(A组只穿线不接扎)30 min后,再灌注48 h,观察三组神经功能评价、病理组织学观察神经元细胞,评价KD对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用。结果 A组神经功能评价、病理组织学观察神经元细胞正常。B组神经功能出现明显障碍,神经元细胞形态异常。C组神经功能障碍程度、神经元细胞形态异常较B组轻。结论用生酮饮食干预后脊髓缺血再灌注损伤减轻。

关键词：生酮饮食,缺血再灌注损伤,兔

参考文献

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脊髓缺血再灌注损伤 篇2

目的 丙泊酚具有脑保护作用,其分子机制尚不清楚.水通道蛋白4 (aquaporin 4,AQP-4)与脑损伤后脑水肿有关.文中探讨大鼠脑缺血-再灌注损伤后AQP-4基因的表达规律及丙泊酚的作用.方法 雄性SD大鼠108只,体重(220±20)g,随机等分为3组,即假手术组:仅开颅,不做缺血再灌注处理;缺血再灌注损伤组(I/R组);丙泊酚组:I/R组、丙泊酚组经右股静脉置管后分别用微量泵持续给予等渗盐水2?ml/(kg・h)和丙泊酚20?mg/(kg・h),在大脑中动脉阻断前开始用药,至再灌注3?h后停止给药,各组又分为缺血2?h后再灌注0.5、1、3、6、12及24?h 6个亚组,每亚组6只大鼠.测定各组大鼠脑含水量,分别用RT-PCR和Western blot检测脑内各时相点AQP-4的mRNA和蛋白水平.结果 再灌注后3?h开始,脑组织含水量即有增加.与I/R组相比,再灌注损伤后3、6、12及24?h 丙泊酚组脑组织含水量均明显下降(P<0.05或0.01) .脑缺血-再灌注损伤后,脑组织AQP-4 mRNA表达升高(P<0.05或0.01),于12?h达峰值,而蛋白则于6?h达峰值.再灌注后24?h AQP-4 mRNA表达仍明显高于假手术组.与I/R组相比,丙泊酚组各点AQP-4 mRNA和蛋白的.表达均明显下降(P<0.05或0.01).结论 丙泊酚可部分抑制脑缺血-再灌注损伤后AQP-4的表达,减轻脑水肿,可能是其脑保护作用机制之一.

作 者：水祥兵 朱克军 任传路 缪明永 时多 SHUI Xiang-bing ZHU Ke-jun REN Chuan-lu MIU Ming-yong SHI Duo 作者单位：水祥兵,朱克军,任传路,SHUI Xiang-bing,ZHU Ke-jun,REN Chuan-lu(解放军第一00医院麻醉科,苏州,215007)

缪明永,时多,MIU Ming-yong,SHI Duo(第二军医大学生化教研室,上海,33)

脊髓缺血再灌注损伤 篇3

【摘要】 目的:探讨急性下肢动脉缺血再灌注损伤的机制和防治措施。方法:回顾总结了46例急性下肢缺血病例的治疗经验。结果:动脉切开取栓38例,动脉重建术4例。术后行筋膜室切开18例,截肢7例,死亡4例。结论:下肢再灌注损伤可导致严重后果,其损伤程度与术前缺血程度成正相关;早期诊断、及时选择合适的治疗方法对预后至关重要。

【关键词】 下肢缺血;再灌注损伤;筋膜室综合症

【中图分类号】 R743.31【文献标识码】 B【文章编号】 1007-8517(2009)24-0146-01

下肢动脉栓塞可能造成下肢坏死,严重的可能导致截肢甚至危及病人的生命,因此应该尽快恢复有效血供。但再灌注损伤是在治疗中最常见的并发症,恢复血流灌注后下肢常有明显肿胀,严重者会形成筋膜室综合征,由于大量毒素吸收则会造成肾功能损害,严重者可能出现肾功能衰竭。我们回顾分析了我科2002.1~2008.12间治疗的46例病例,总结对于再灌注损伤防治方面经验如下。

1 资料方法

1.1 一般资料 全组病例46例,其中男性32例,女性14例。年龄41~84岁,平均年龄68.3岁。发病时间3小时~4天。栓子来源于心脏28例(风湿性心脏病伴心房颤动18例,冠心病伴心房颤动10例);继发动脉粥样硬化血栓形成18例。

1.2 发病部位 股动脉29例(65.63%),髂动脉8例(18.75%),腹主动脉骑跨血栓2(6.25%)例,胫腓动脉脉7(9.37%)例,。

1.3 临床表现 全组患者均出现典型“5P”征(苍白、疼痛、无脉、感觉异常、功能障碍)。其中下肢出现花斑19例,入院时远端下肢出现坏疽者3例,患肢有缺血性肌痉挛者5例。所有患者均经过彩色多普勒超声诊断及动脉造影检查明确诊断。

1. 4 治疗方法 下肢缺血42例急诊手术,余4例药物保守治疗。38例急症常规经股动脉切开Fogarty导管取栓。其中2例术后三天内再发股动脉血栓,急症再次行股动脉切开取栓。4例患者行人工血管重建。2例入院时已经出现远端下肢明显缺血坏死和缺血性肌痉挛。患肢因缺血时间过长无法挽救而行截肢术。对于缺血时间较长的患者,术中分次间断开放近端动脉,控制再灌注量,术中及术后适当应用甘露醇,速尿及碳酸氢钠碱化尿液保护肾功能。取栓及人工血管重建后继续抗凝、溶栓、解痉、扩血管、碱化尿液及清自由基药物应用。保守药物治疗包括尿激酶、降纤酶溶栓、低分子肝素抗凝、凯时(前列腺E1)扩血管和利尿治疗。

1.5 结果 下肢存活,功能基本恢复35例;截肢7例,其中急症截肢2例,二期截肢5例;病死4例,其中1例死于急性大面积心肌梗塞,2例死于术后肾功能衰竭,1例死于脑梗塞。下肢存活的35例中,血流恢复后足背动脉均搏动良好,提示动脉血供重建良好但术后相继出现不同程度的患肢疼痛、肿胀,并进行性加重,以小腿为重查体见患肢皮肤稍红,皮温较健侧增高,小腿肿胀,明显压痛,足背动脉搏动正常。其中3例出现术后急性肾功能不全,并进行血液透析治疗。全组46例病例中16例缺血时间超过10小时,除2例急症行截肢术,其余14例术后均出现筋膜室综合症,行切开减压,5例2期截肢。4例术后行预防性筋膜室切开,术后恢复良好。

2 讨论

2.1 下肢缺血在灌注的损伤机制 缺血组织再灌注后引起了一系列的复杂反应使组织细胞持续发生损伤并加重,对于

缺血再灌注的发生,目前公认的作用机制有:下肢在缺血过程中,组织内由于有氧代谢受阻而变成无氧代谢,导致ATP减少,乳酸堆积。细胞内发生酸中毒,引起细胞肿胀、凋亡坏

死[1]。在对于缺血再灌注损伤机制的研究中,人们发现缺血再灌注时肌体处于氧化应激状态,在缺血再灌注组织内存在大量活性氧,缺血再灌注组织的活性氧主要来源于实质细胞中的黄嘌呤氧化酶和中性粒细胞的NADPI I氧化酶,这2个酶可产生超氧化物。[2]同时再灌注后组织重新供氧,可形成和激活一系列体液炎症介质,包括活性氧(超氧化物、氢氧自由基、过氧化氢等)、脂类介质(PAF、LTB4),以及多肽类介质(补体C5A),超氧化物和PAF主要来源于内皮细胞,内皮细胞的功能障碍被认为是再灌注损伤的扳机点[3][6],可导致NO释放显著降低,NO分泌下降和化学趋化剂(PAF、.LTB、补体C5A)一起促使中性粒细胞聚集于再灌注部位以及黏附于功能障碍的内皮上,这一黏附作用需要黏附分子的参与,后者缩小了中性粒细胞与实质细胞的距离,从而增强了损伤作用。

缺血再灌注损伤的机体的影响近10年以来,国内国外的学者对于缺血再灌注现象进行了深入的研究,发现缺血再灌注不但会对缺血下肢造成持续损伤,而且会对机体各系统造成危害。有研究表明下肢再灌注损伤可以导致急性肺损伤[4],其损伤的特点与ARDS的病理学特点相似。下肢I/R对于心输出量、外周阻力、动脉压和心率等产生显著的影响。要瑞莉等[5]通过动物实验证实下肢I/ R损伤,作为应激源可引起胃黏膜损伤导致应激性溃疡的发生,产生的自由基在继发胃黏膜损伤起一定作用。对于缺血再灌注肾损伤的病理研究发现,I/R发生后继发引起肾小管上皮细胞肿胀、肾小球舯大,严重者导致肾功能损害甚至肾功能衰竭。

2.2 下肢缺血再灌注损伤的防治

2.2.1 早诊断、早治疗 由于下肢缺血再灌注损伤会对机体带来严重影响,甚至危及患者生命。下肢急性缺血的患者通过下肢血管多普勒、下肢DSA等方法并结合典型的临床表现一般不难诊断。诊断明确后应尽早恢复下肢血供,需要手术治疗的可以选择动脉切开取栓,人工血管转流术。术后密切观察患肢情况,以及早发现缺血再灌注表现以便早期处理。

2.2.2 术中静脉放血 在恢复患肢血供之前经股静脉放血200ml左右,可减少下肢由于缺血产生大量的有毒代谢产物吸收入血,从而减轻肾功能损害,防止急性肾功能衰竭的发生,同时术中应用碳酸氢钠200ml等保护肾功能。

2.2.3 预防性筋膜切开及部分肌肉切除术 下肢严重的I/R创伤可使组织严重水肿,导致骨筋膜间室综合征,增加了肌肉坏死感染及败血症的风险,筋膜切开可有效地减轻组织内压力。因而在下肢严重缺血及大血管损伤修复术后常规行预防性筋膜切开术。部分功能次要肌肉切除,可减轻间室内压力,减少毒素的吸收及全身并发症的发生。本组患者中有14例下肢缺血时间在6小时以上手术后行骨筋膜室切开,4例预防性行骨筋膜室切开,术后恢复顺利。

2.2.4药物治疗 为预防和减轻缺血再灌注损伤,在术中于动脉远端给予尿激酶100万﹗ 及肝素50mg,以疏通微循环。并在术后立即给予甘露醇、碳酸氢钠和速尿以保护肾功能[7]。术后应用小剂量地塞米松抑制白细胞活化抗炎,减少下肢再灌注损伤。另外加用前列腺素娥E1抑制炎性介质的释放和氧自由基的形成,并有扩张血管、抑制血小板聚集的作用。

2.2.5 早期透析 对于严重的下肢再灌注损伤,并已经引起急性肾功能不全的患者,或者在手术治疗以前已经出现肾功能衰竭的患者。应该在手术后早期进行血液透析治疗,防止肾功能进一步恶化,加快毒素排出体内。

下肢缺血性疾病是临床常见危重疾病,病情发展迅速,肢体再灌注损伤不仅影响肢体的存活和功能,还可以引起多器官衰竭导致严重后果,是病人术后死亡的重要原因之一[8],其损伤程度与术前缺血程度及缺血时间成正相关;早期诊断、及时选择合适的治疗方法对预后至关重要。

参考文献

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脊髓缺血再灌注损伤 篇4

关键词：远端缺血预处理,脊髓,缺血再灌注损伤,血-脊髓屏障

在临床上,胸腹主动脉瘤修复术可导致脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury,SCIRI),而脊髓损伤后一个灾难性的、不可预知的并发症是截瘫[1]。目前,针对如何有效避免胸腹主动脉瘤修复术后SCIRI的发生,大量的临床及实验研究工作已经开展,然而,截瘫的发生仍不可完全避免。因此,需要探索更加有效的方法保护脊髓免受缺血再灌注损伤。

SCIRI的发生机制主要包括氧自由基介导的脂质过氧化作用、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸的释放、炎性反应及细胞凋亡等。其中,血-脊髓屏障(bloodspinal cord barrier,BSCB)的破坏是SCIRI的一个重要的病理改变,在SCIRI的发生发展中发挥重要的作用[2,3]。BSCB是血液循环和脊髓组织之间的生理和代谢物质扩散的屏障,严格地调控着脊髓微环境的稳态,因此早期修复BSCB对于防治脊髓损伤具有十分重要的意义。研究表明,远端缺血预处理(remote ischemic preconditioning,RIPC)可对心脏、脑、肾脏等多种器官或组织缺血再灌注损伤产生保护作用[4],同时,RIPC对SCIRI的保护作用也在一些动物实验中得到了验证[5],然而,其内在的保护机制仍不十分清楚。之前的研究发现,热休克蛋白、内源性大麻素、活性氧物质触发的抗氧化通路介导了RIPC对脊髓缺血的耐受[5,6,7],但关于RIPC对SCIRI后BSCB的影响还未见文献报道。因此,本研究旨在探讨RIPC对SCIRI后BSCB可能的保护作用及其机制,从而进一步揭示RIPC防治SCIRI的内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源及分组

本实验共纳入36只日本大耳白兔,体重1.5~2.0 kg,雄性,购自武汉生物制品研究所(动物质量合格证号:NO.42000400003600),按照美国国立卫生研究院制订的实验室动物维护、使用指导意见和要求处理动物。每只动物都在各自单独的笼中饲养,环境温度及湿度均适宜,光暗周期为12 h/12 h,可自由摄入食物和水。麻醉前,所有动物的神经功能均完好。采用随机数字表法将动物均分为三组,每组12只:假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和远端缺血预处理组(R组)。于术后24 h处死,其中6只用于BSCB通透性检测,另外6只用于神经功能评价及claudin-5、occludin、BDNF(m RNA)蛋白检测。

1.2 SCIRI模型的建立

经日本大耳白兔耳缘静脉注入3%戊巴比妥钠1.0 m L/kg麻醉动物,取仰卧位固定,保留其自主呼吸。经耳缘静脉留置针输注乳酸林格液4 m L/(kg·h),间断静脉注射戊巴比妥钠维持麻醉。经右侧股动脉置管以持续监测股动脉压和心电图,保持血流动力学稳定。加热毯维持直肠温度为(38.5±0.5)℃。I/R组和R组采用改良的Zivin法[8]创建SCIRI模型:取腹部正中切口,暴露分离腹主动脉,于左肾动脉根部下方0.5 cm处,以无损伤动脉夹夹闭腹主动脉,阻断时以股动脉压力波形消失,远端平均动脉压为0 mm Hg为准,40 min后开放动脉夹,开放时以股动脉压力波形恢复为准。阻断腹主动脉血流前5 min,经耳缘静脉注入肝素150 U/kg预防血栓形成。术毕肌注庆大霉素80 000 U预防感染,逐层缝合皮肤,待动物清醒后归笼饲养观察。S组仅开腹并暴露分离腹主动脉,不阻断其血流,40 min后关腹。

1.3 R组干预方法

SCIRI模型建立前1 h,暴露分离双侧股动脉,采用无损伤动脉夹对双侧股动脉进行2个循环的10 min缺血/10 min再灌注处理。

1.4 神经运动功能评定

所有动物由一名未参与实验分组的课题组人员对兔后肢运动功能进行评分。评分采用改良的Tarlov评分标准[9]:0分,后肢完全瘫痪,没有可觉察的活动;1分,有可觉察的关节自主活动;2分,后肢可自由活动,但不能站立;3分,可站立但无法行走;4分,后肢功能完全恢复,能正常行走。

1.5 BSCB通透性检测

通过定量和定位分析脊髓组织中伊文思蓝(Evans blue,EB)外渗量,可评价BSCB破坏程度和部位[10]。将2%的EB经兔耳缘静脉缓慢匀速注射(10 m L/kg),1 h后将动物再次麻醉,经升主动脉灌注0.9%生理盐水500 m L/kg,取出脊髓。①酶标仪定量:取脊髓节段L4~L6一部分,称重,浸泡在4 m L甲酰胺溶液中,60℃避光水浴抽提24 h。20 000 r/min离心20 min,取上清液,用酶标仪检测(λ=632 nm)OD值,根据标准曲线计算出每克脊髓组织中EB含量(μg/g)。②荧光定位:取脊髓节段L4~L6一部分,置入4%多聚甲醛内固定,1周内沉糖。冰冻切片机上于-20℃连续切片(10μm),在荧光显微镜(Nikon,日本)下观察切片,分析BSCB完整性破坏的程度和部位。

1.6 Western blot法测相关蛋白表达

通过Western blot法检测claudin-5、occludin及BDNF蛋白在脊髓组织中的表达水平。取脊髓节段L4~L6一部分,匀浆后提取总蛋白,BCA定量检测试剂盒(武汉谷歌生物,中国)测定蛋白浓度,从每个蛋白样品中取30μg于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离,电泳完毕转至PVDF膜,将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶封闭1 h,分别加入山羊多克隆抗claudin-5抗体(1∶500,Santa Cruz,美国)、兔单克隆抗occludin抗体(1∶1000,Abcam,英国)、山羊多克隆抗BDNF抗体(1∶500,Santa Cruz,美国)4℃孵育过夜,之后二抗GAPDH(1∶10 000,武汉谷歌生物,中国)孵育30 min。采用ECL试剂显色,曝光后显影、定影。Alpha Ease FC软件(Alpha Innotech,美国)分析目标带的灰度值,以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表达量,并通过归一化处理后比较各组蛋白相对表达水平。

1.7 RT-PCR法测相关m RNA表达

通过实时荧光定量法(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测BDNF m RNA在脊髓组织中的表达水平。引物核苷酸序列由武汉谷歌生物科技有限公司合成,如下所示:BDNF:上游引物5'-CAACGAA-GAAAACAATAAGGACGC-3',下游引物5-'CGCCGGA CCCTCATAGACAT-3';GAPDH:上游引物5'-CGCCT GGAGAAAGCTGCTA-3',下游引物5'-ACGACCTGGTC CTCGGTGTA-3'。取脊髓节段L4~L6一部分,加Trizol试剂(Invitrogen,美国)提取总RNA,按逆转录试剂盒(Thermo,美国)说明书合成c DNA,于PCR仪(ABI,美国)上进行如下循环:预变性95℃,10 min,95℃15 s→60℃60 s,循环40次,溶解曲线每20 s升温1℃,由75℃升至95℃。计算基因的表达量:根据ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCt实验-ΔCt对照,扩增倍数=2-ΔΔCt,计算目的基因与内参基因GAPDH的相对表达量。

1.8 统计学方法

采用IBM SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经运动功能评分

三组动物术后24 h的Tarlov评分显示,S组动物的后肢运动功能均完全正常,评分为4分;I/R组的后肢运动功能出现严重缺陷,评分显著低于S组(P<0.01);与I/R组相比,R组的神经功能评分明显提高(P<0.05),表明RIPC可显著改善SCIRI后的后肢运动功能。见表1。

2.2 BSCB通透性检测

BSCB通透性通过EB染料外渗量测定,在荧光显微镜下显示红色荧光的部分即为渗出到脊髓组织中的EB染料。在术后24 h,与S组相比,I/R组EB外渗量显著增加,而RIPC可减少SCIRI后EB外渗量(图1A~C)。同时,脊髓组织中EB含量的定量分析显示,I/R组EB含量[(16.61±1.02)μg/g]高于S组[(1.46±0.40)μg/g],差异有高度统计学意义(P<0.01),而R组EB含量[(7.24±0.78)μg/g]少于I/R组,差异有高度统计学意义(P<0.01),表明RIPC可降低SCIRI后BSCB通透性,减轻BSCB损伤。见图1D。

A~C:三组脊髓组织中外渗的EB荧光图像;A:S组;B:I/R组;C:R组;D:定量测得三组脊髓组织中的EB含量;与S组比较,**P<0.01;与I/R组比较,##P<0.01

2.3 脊髓组织中紧密连接蛋白claudin-5、occludin表达情况

术后24 h,脊髓组织中紧密连接蛋白claudin-5和occludin的Western blot结果显示,与S组相比,I/R组claudin-5、occludin的表达显著下降(P<0.01),而R组的表达含量高于I/R组(P<0.01),表明RIPC可阻止SCIRI后claudin-5、occludin表达的下降,保护BSCB结构的完整。见图2。

2.4 脊髓组织中BDNF(m RNA)蛋白表达情况

术后24 h,脊髓组织中BDNF的Western blot及RT-PCR结果显示,与S组相比,I/R组BDNF蛋白及BDNF m RNA的表达有轻微升高,但差异无统计学意义(P>0.05),而R组的BDNF蛋白及BDNF m RNA表达含量显著高于I/R组(P<0.01)。见图3。

3 讨论

RIPC是指对非靶组织或器官进行短暂的几个循环的缺血再灌注处理可对随后远隔组织或器官长时间持续性的缺血损伤产生保护作用,由于其安全、简便、可重复性强且价格低廉,因而应用前景广阔。本研究结果表明,RIPC可显著改善兔SCIRI后24 h的神经运动功能评分,并通过增加紧密连接蛋白claudin-5、occludin的表达维持BSCB结构完整,降低BSCB通透性,同时可上调脊髓组织中BDNF的表达,从而发挥防治SCIRI的神经保护作用。

与血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)相似,BSCB的主要组成成分包括连续的毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接、基膜、周细胞和星形胶质细胞终足[11]。内皮细胞间的紧密连接结构严格限制血源性分子的细胞旁转运,是维持BSCB完整性的关键结构。claudin-5和occludin是两种重要的紧密连接蛋白,研究表明,二者的表达异常与BBB/BSCB通透性异常密切相关[12,13]。在脑缺血再灌注损伤模型中,BBB的破坏及血管性水肿的形成与claudin-5、occludin的表达下降密切相关[14]。同时,在SCIRI后,BSCB通透性的增加伴随着脊髓组织中occludin表达的下降[15]。本研究结果显示,与S组相比,I/R组脊髓组织EB外渗量明显增多,紧密连接蛋白claudin-5、occludin的表达水平显著下降,而R组脊髓组织EB外渗量明显低于I/R组,claudin-5、occludin的表达水平均高于I/R组,表明RIPC可通过阻止SCIRI后claudin-5、occludin表达的下降,降低BSCB通透性,保护BSCB结构的完整。

BDNF是神经营养因子家族的重要一员,在脑或脊髓的缺血再灌注损伤中发挥抗炎、抗神经毒性、抗凋亡及促神经元再生的神经保护作用[16,17]。本研究结果显示,RIPC可显著增加SCIRI后24 h脊髓组织中BDNF表达含量,而I/R组BDNF含量仅有轻微升高,与S组相比,差异无统计学意义。由于神经元、血管内皮细胞、星形胶质细胞以及小胶质细胞等均可在缺血缺氧时表达BDNF[18],笔者推测,BSCB的破坏损伤这些表达BDNF的细胞,因而影响BDNF表达,减弱其对神经的修复能力,RIPC可在保护BSCB完整性的基础上,增加脊髓组织中BDNF表达,加强对神经的修复能力。

A:三组脊髓组织中claudin-5、occludin蛋白典型的Western blot结果;B:三组脊髓组织中claudin-5、occludin蛋白相对表达含量;与S组比较,*P<0.05,**P<0.01;与I/R组比较,##P<0.01

A:三组脊髓组织中BDNF蛋白典型的Western blot结果;B:三组BDNF蛋白、BDNF mR NA相对表达含量;与S组比较,**P<0.01;与I/R组比较,##P<0.01

脊髓缺血再灌注损伤 篇5

【关键词】雌激素；肝脏缺血再灌注；保护

【中图分类号】R575.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0039-01

肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)常见于临床上入肝血流阻断肝切除术和肝移植。近年来，许多研究发现应用雌激素可以明显改善心、脑缺血再灌注损伤所带来的器官功能损害^[1],那么雌激素在肝缺血再灌注损伤中是否发挥保护作用呢?本实验拟建立大鼠I/R模型，以研究雌激素在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用。

1材料与方法

1.1材料与试剂选用清洁及健康雄性Wistar大鼠12只，月龄2.5个月左右，体重250～270g；雌性Wistar大鼠36只，月龄2～3个月，体重200～240g；17β-雌二醇，美国SIGMA公司提供。

1.2方法

1.2.1动物模型制作实验前12 h动物禁食，自由饮水。2％氯胺酮腹腔内注射麻醉(每100g体重注射0.5m1)，上腹正中切口进腹，入腹后离断肝周韧带，用小号血管夹分别夹闭左、中、右肝蒂，仅保留尾状叶作为门静脉与腔静脉血液回流通道。肝脏缺血90min后，放开血管夹，同时切除尾状叶。

1.2.2实验分组A组直接制作HIRI模型。B组及D组于肝缺血手术前10d切除双侧卵巢；C组也于肝缺血手术前10d作开腹手术，但不切除卵巢；B组和C组于术后每日均给予0.2 ml二甲基亚砜(DMS0)腹腔注射，D组在切除双侧卵巢后每日腹腔注射17β-雌二醇0.1mg/kg(溶于DMSO0.2 ml中)共10d，10d后制作HIRI模型。

1.2.3检测指标各组动物实验完成后下腔静脉取血4ml，测定其中ALT、AST、AKP水平。

1.2.4统计学处理实验数据以±s表示,组间比较采用方差分析。

2结果

各组大鼠血清中ALT、AST、AKP的含量见表1。

3讨论

缺血再灌注损伤是临床各科常需面临的一个问题。国内外有研究发现雌激素对脑、心、视网膜等脏器缺血再灌注损伤有一定的保护作用，而对肝脏缺血再灌注损伤的影响研究较少。本研究结果表明17β-雌二醇能降低肝脏缺血再灌注后血清转氨酶水平，提示雌激素对肝脏缺血再灌注损伤确有一定保护作用。但与假手术组相比，17β-雌二醇处理组转氨酶上升较明显，说明雌激素对肝脏缺血再灌注损伤虽有保护作用但并不能完全消除其所致肝脏损伤。关于雌激素对肝缺血再灌注损伤的保护机制，目前推测有以下几点：① 雌激素可通过非基因途径增加血管内皮源性NO合成酶的活性^[2]，增加NO的合成与释放，而NO是目前所知最强的血管松弛因子之一，NO含量的升高，可使血管扩张，从而改善循环，减轻损伤；② 雌激素不仅可通过NO介导依赖机制减少超氧化物的产生^[3]，其本身也具有抗氧化的特性，因此可从双方面减少I/R的损伤；③有研究表明，在I/R时，应用雌激素可明显增强微血管对乙酰胆碱和苯肾上腺素的应答，从而有助于再灌注期微血管功能的恢复^[4]。

参考文献

[1]Piacibello W,Sanavio F,Garetto L,et al.Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation[J].Leukemia，1998,12:718-727

[2]Ferrer M,Meyer M,Osol G.Estrogen replacement increases adrenergic-mediated relaxation of rat mesenteric arterises[J].J Vacs Res,1996,33:124-131

[3]Knofer L, Markus W,Angele K,et al.Preservation of splenic immune functions by female sex hormones after trauma-hemorrhage[J].Critical care Medicine,2002,30(4): 888-893

[4]Alkayed NJ,Haruknin I, Kimes AS,et al. Gender-linked brain injury in experiment stroke[J].Stroke,1998,29:159

脊髓缺血再灌注损伤 篇6

关键词：心肌,缺血再灌注损伤,缺血后处理

心肌缺血后如何能早期有效地恢复血流灌注,对挽救因缺血而濒死的心肌进而改善心功能至关重要,但是再灌注又可加重心肌的缺血损伤[1,2],目前心肌缺血预适应被认为可有效的抗心肌缺血再灌注损伤,但由于缺血预适应需在缺血前施予,而临床治疗中经常遇到的是已经发生的心肌缺血,故从临床治疗的角度讲,缺血预适应的真正应用价值有很大的局限性。缺血后处理是在心肌缺血后再灌注前施予,有很大的临床可操作空间,因而具有更为广阔的临床应用前景。本研究利用大鼠在体心肌缺血再灌注模型,探讨缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤的影响及可能的作用途径。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂、仪器 血浆肌酸激酶(CK)、血浆丙二醛(MDA)、血浆超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。血浆cTnI试剂盒购自美国LDI公司。Even’s blue染液及TTC 染液均购自Sigma公司。RM6240B型生理实验系统购自成都仪器厂。HX-300动物呼吸机及BL-2000图像分析系统购自成都泰盟科技有限公司。

1.2 实验动物及分组 健康Wistar大鼠30只,由山西医科大学实验动物中心提供,体重220 g～250 g,雌雄不限。实验动物随机分为4组,每组6只,假手术组:只在左冠状动脉前降支(LAD)下穿线,不结扎;缺血再灌注组:可逆性结扎LAD造成心肌缺血30 min后,再灌注3 h,不做任何处理;缺血后处理组:可逆性结扎LAD造成心肌缺血30 min后,在再灌注前1 min内给予再灌注10 s,再缺血10 s,共3次循环,之后再灌注3 h;缺血预适应组:在心肌缺血前,先可逆性结扎LAD造成心肌缺血5 min,再灌注10 min,之后可逆性结扎LAD造成心肌缺血30 min,再灌注3 h。

1.3 模型制备方法 25%乌拉坦(4 mL/kg)麻醉动物,仰卧位固定于手术台上,颈部正中切口分离气管,穿线备用。分离右侧颈总动脉,游离约2 cm长,结扎远心端,近心端打一活结,靠近远心端剪一小口,插入内径为0.8 mm聚乙烯塑料导管,沿向心方向缓缓插入,经主动脉通过主动脉瓣口进入左心室,以出现特征性左心室压力波为标志,固定插管,导管内充以含肝素(5 U/mL)的生理盐水,接压力换能器,信号输入RM6240B型生理实验系统。行气管插管,机械通气,频率60 /min,潮气量8 mL,吸呼比1∶2。连接心电电极检测Ⅱ导心电图。于心尖搏动处纵行分离皮肤,肌层,剪断2～4肋暴露心脏,打开心包,掀起左心耳,于左心耳根部下方以7-0无创缝合线穿过左冠状动脉前降支(LAD),取双线头共同套过一小段塑料管,沿双线向下压塑料管,以阻断左冠状动脉的血流,并以蚊式止血钳固定,以Ⅱ导心电图ST段明显抬高,心肌颜色变暗为结扎成功标志。松开蚊式止血钳放松线而冠脉血运再通。除假手术组只在左冠状动脉前降支下穿线,不结扎,所有实验组均缺血30 min,再灌注3 h。动物模型的成功须符合下列标准:在心肌缺血再灌注损伤中伴有心电图ST段的改变;再灌注2 h后心率仍大于230 /min; Even’s blue染色后可见结扎线下方心肌有明显未染成蓝色的红色区域。

1.4 指标测定 在再灌注末经颈动脉插管取血2 mL,静置后,以3 000 r/min离心10 min取血浆,冰箱冻存,整批测量。分别依试剂盒要求测定血浆cTnI、CK、MDA及SOD含量。

心肌梗死面积的测定:实验结束后,再次结扎LAD,经颈动脉插管注入20% Even’s blue,1 min后取心脏,低温(-80 ℃)保存。整批取出低温保存的心脏,剪去除左心室外心脏的其余部分。将左心室自心底向心尖垂直于心腔纵轴方向平均切成六片环行的薄片,用1%TTC染色15 min(37 ℃),非危险区为蓝色,危险区未梗死组织染为红色,梗死区不着色。染色结束后取出心脏,放入10%中性甲醛溶液中固定。用图像分析仪对心肌梗死面积进行分析,以梗死区面积与危险区总面积的比值来表示心肌梗死面积大小。

1.5 统计学处理 实验数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,使用SPSS12.0统计软件对实验结果进行统计学处理,多组样本比较用单因素方差分析和重复测量的多因素方差分析,P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组心肌梗死面积的比较(见表1)

缺血再灌注组心肌梗死面积为(52.0±3.4)%,与缺血再灌注组相比,缺血后处理组为(34.8±2.3)%,缺血预适应组为(23.8±4.3)%,两组均较缺血再灌注组有明显减小(P<0.05)。

2.2 各组生化指标的比较(见表2)

缺血后处理组、缺血预适应组血浆cTnI、CK和MDA含量在再灌注末与缺血再灌注组比较均显著性下降(P<0.05),血浆SOD含量与缺血再灌注组比较均升高(P<0.05)。

3 讨 论

1986年由Murry等[3]首次提出,冠状动脉反复短暂的缺血,使心肌增强了对其后缺血刺激的耐受性,以至明显延长了产生不可逆心肌损伤的时间,使心肌在后续更长时间的缺血中得到保护,并将此现象称之为缺血预适应。1999年高峰[4]对已缺氧的大鼠心肌细胞复氧前经多次短暂的复氧停氧处理,发现可明显提高细胞存活率,故而提出缺氧后处理的概念。2003年Zhao等[5]在对狗的缺血再灌注及Yang等[6]对兔离体心脏缺血模型的研究中,均发现缺血后处理可以显著减少心肌梗死面积,减轻内皮损伤。本研究中也发现,在再灌注时给予反复短暂的再灌注/再缺血,可使缺血后处理干预组的心肌梗死面积较缺血再灌注组减少约17%,同时在再灌注末测定反映心肌损伤的金指标-血浆肌钙蛋白I及血浆肌酸激酶,两者含量均有所降低,心肌酶学的结果也进一步证实了缺血后处理具有心肌保护效应,这与目前文献报道的结论相符[5]。

已有研究报道,再灌注时氧自由基的爆发是心肌缺血再灌注损伤的重要发病机制之一[7,8]。本实验显示,经过缺血后处理干预后,血浆丙二醛含量降低,血浆超氧化物歧化酶活性增加,由此推测,缺血后处理对心肌的保护效应有可能与通过抑制或减轻再灌注时氧自由基的大量释放,进而减轻心肌损伤有关。据Zhao等[5]及Kin等[9]研究报道,缺血后处理可以降低缺血区中性粒细胞的聚集,减少活性氧类物质的产生和氧化剂介导的生化反应,抑制危险区的炎症反应,保护冠脉内皮功能,这也与本研究结论相符。

参考文献

[1]Goldhaber JI,Weiss JN.Oxygen free radicals and cardiac reperfu-sion abnormalities[J].Hypertension,1992,20:118-127.

[2]Bolli R.Marban E.Molecular and cellular mechanisms of myocardi-al stunning[J].Physiol Rev,1999,79:609-634.

[3]Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemi-a:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circula-tion,1986,74:1124-1136.

[4]高峰.缺氧后处理对大鼠缺氧复氧心室肌细胞的保护作用[J].心功能杂志,1999,11(4):241-243.

[5]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardialinjury by ischemic post-conditioning during reperfusion:Compari-son with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart CircPhysiol,2003,285:H579-H588.

[6]Yang X,Downey JM,Cohen MV.Multiple,brief coronary occlu-sions during early reperfusion protect rabbit hearts by activation ofERK and production of nitric oxide[J].Circulation,2003;108(supplⅣ):158.

[7]Ferrari R.The role of mitochondria in ischemic heart disease[J].JCardiovasc Pharmacol,1996,28(suppl 1):1-10.

[8]Griending KK,Alexander RW.Oxidative stress and cardiovasculardisease[J].Circulation,1997,96:3264-3265.

脑缺血再灌注损伤相关基因研究进展 篇7

1 促凋亡基因

促凋亡基因编码的蛋白质产物可直接或间接参与凋亡的调控。研究表明, 促凋亡基因半胱氨酸蛋白水解酶、肿瘤抑制基因 (p53) 和癌基因 (Bcl-2) 三者之间形成一种网络调控构象, 调控细胞凋亡。

1.1 半胱氨酸蛋白水解酶 (caspases)

研究表明, caspase家族在缺血性脑损伤中发挥重要作用, 是哺乳动物凋亡的启动和执行者[1]。其中caspases1、5、和11与炎症/细胞因子处理有关, caspases2、3、6、7、8、9和10调节凋亡, 而caspase-3是caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡蛋白酶, 在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。脑缺血损伤诱导神经元凋亡途径包括线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激途径[2,3], 这 3条途径最终都激活caspases-3, 导致了神经细胞的凋亡。

1.2 肿瘤抑制基因 (p53)

p53作为一种重要的转录调节因子, 在细胞凋亡过程中起重要作用, 是公认的促凋亡基因。p53可以直接引起细胞凋亡, 也可以通过调节其他凋亡相关基因表达间接导致细胞凋亡。p53促细胞凋亡的活性主要是归因其转录依赖机制, 如p53上调促细胞凋亡的分子:Bax、Puma、Noxa、Bid、caspases、PTEN、Fas/CD95和产生活性氧的线粒体酶, 下调抗细胞凋亡分子:Bcl-2和surviving[4]。另一方面, p53通过转录非依赖通路促进细胞凋亡, p53在细胞质膜积聚能够直接激活Bax触发细胞凋亡[5]。脑缺血再灌注可扰乱脑的氧供和能量代谢, 产生大量氧自由基, 对DNA造成损伤。DNA损伤是氧化损伤导致凋亡的重要启动点。DNA出现损伤时, p53表达增加, 首先引起细胞周期阻滞, 使损伤的DNA得以修复, 修复失败时p53则使神经元进入凋亡过程。

1.3 癌基因Bcl-2家族

Bcl-2是Tsujimoto等从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的一种癌基因, 即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因 (B cell Lymphoma/Leukemia-2) 。bcl-家族成员分为两类:一类促进细胞凋亡, 有bax、bcl-S、bad、bak、Bim等;一类抑制细胞凋亡, 有bcl-、bcl-1、mcl-、bag-、A1、ced-和一些病毒基因。Bax是Bcl-家族中最重要的凋亡诱导基因[6], Bcl-2和Bax可形成异二聚体, 当Bax表达占优势时促进细胞凋亡, 而Bcl-2表达占优势时阻止细胞死亡。Bim也已经被证明能从动力蛋白释放出来并转位到线粒体, 导致细胞色素后缺氧诱导因子 (HIF) -let的转录活性上调, 这是p53非依赖方式, 然后Noxa通过ROS和线立体通路来诱导神经细胞凋亡[7]。

1.4 线粒体产物

线粒体是双层膜的囊状结构, 膜间包含细胞凋亡相关因子如Cyt-C、某些caspases前体和凋亡诱导因子 (AIF) 。因在细胞凋亡信号中的调节和放大作用, 线粒体被认为是细胞凋亡信号传递过程中最重要的细胞器。凋亡时线粒体释放的caspase活化物主要有Cyt-C、AIF、核酸内切酶G、Smac/Diablo fsecond MT-derived activator of caspase/directIAP-binding protein with low PI) 、Omi/HtrA2 (High-temperaturerequirement Selene protease A) 等。其中, 研究最多的是Cyt-C。研究表明, 脑缺血后胞质Cyt-C释放动力学与梗死区caspases-3的表达及随后的PARP (caspase-3的特异性底物之一) 切割呈现很好的一致性。Cyt-C从线粒体释放出来以后, 参与脑缺血后细胞凋亡的线粒体途径, 最后引发细胞凋亡。AIF是线粒体中间膜上存在的黄素蛋白, 一旦从线粒体释放出来, AIF就会转位到核内, 诱发大规模DNA断裂和细胞凋亡。凋亡线粒体的AIF途径是独立于caspases的一条凋亡途径[8]。细胞发生凋亡时, Smac/Diablo从线粒体释放出来并与凋亡抑制蛋白 (apoptosis inhibiting protein IAP) 结合, 取消了IAP对caspase的抑制效应从而促进细胞凋亡[9]。

2 钙超载相关基因

缺血组织恢复血供后使细胞内Ca2+含量显著增高, 并引起细胞损伤的现象称为钙超载[10]。脑缺血再灌注中Ca2+超载是各种因素综合作用的结果, 也是造成脑缺血损伤过程中各种因素作用的共同通路。细胞内Ca2+超载在缺血性神经元凋亡的发生中起关键作用。Ca2+的升高参与了凋亡早期信号转导和凋亡的执行阶段, 细胞凋亡早期, 线粒体出现内膜渗透性改变、通透性增加、Ca2+的摄入、跨膜电位降低、细胞色素C和凋亡诱导因子的释放等, 最终导致细胞凋亡的发生[4]

2.1 内质网应激反应﹙endoplasmic reticulum stress response, ERS) 内质网是细胞内重要的细胞器, 又是细胞内钙储存器。

糖饥饿、钙平衡紊乱、糖基化抑制、二硫键结合减少和突变蛋白质的表达等情况引起内质网腔内未折叠、错折叠蛋白聚集, 导致内质网的应激反应, 过强的内质网应激反应诱导的细胞凋亡。研究表明, 脑IRI也可损伤内质网, 导致内质网应激反应 (ERS) , 引起神经细胞的凋亡[11]。

2.2 兴奋性氨基酸毒性

在局部脑缺血过程中, 兴奋性氨基酸 (EAA) 的神经毒性作用是损伤脑组织的启动因素和执行因素。该机制不仅直接导致细胞坏死, 同时可诱导细胞凋亡。EAA造成的神经毒性作用主要包括两个方面, 一是缺血后EAA介导的大量Na+、Cl-及H2O的内流, 造成细胞毒性脑水肿;二是通过激活NMDA受体, 介导Ca2+大量内流以及IP3增多, 使细胞内钙库贮存的Ca2+释放增加, 导致细胞内Ca2+超载, 激发一系列瀑布样病理生理过程, 进一步导致神经元的迟发性死亡[12]

2.3 钙蛋白酶 (calpain)

研究发现脑缺血后1 h脑内的钙蛋白酶活性开始增加, 再灌注36 h时达高峰, 而活性增加的部位主要在敏感神经元的树突区域[13]。目前认为, 激活后的钙蛋白酶对神经元的损伤主要通过水解细胞骨架蛋白、膜蛋白及多种与代谢有关的酶引起神经元死亡。

3 炎性因子

炎性反应是IRI的重要机制之一[14], 在IRI中, 中性粒细胞及红细胞、纤维蛋白沉积物、血小板的积聚能导致毛细血管堵塞、渗漏及减少微血管血流, 甚至导致缺血区域的血液停滞现象, 即所谓的再灌注后的“无复流”现象。

3.1 白细胞介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β) IL-1β是触发免疫和炎症反应的重要介质。脑缺血再灌注缺血侧脑组织在再灌注后3 h后IL-1β含量明显升高, 再灌注后12 h后IL-1β含量达到高峰。IL-1β可能通过促进白细胞的活化, 促进钙超载途径和激活胶质细胞、白细胞呼吸爆发等机制在缺血再灌注脑组织中产生大量氧自由基, 从而加重脑缺血再灌注部位的炎症反应。IL-β触发炎症反应, 随后趋化因子IL-6和IL-8亦释放, 这些细胞因子与其他炎性代谢产物共同促使白细胞释放大量的蛋白水解酶、氧自由基和其他效应分子, 这是造成脑损害的重要病理机制之一[15]。

3.2 Toll样受体 (Toll-like receptors, TLRs) 自发现TLR4以来, 现已克隆出11种TLRs, 其中TLR4作为“门户”蛋白启动机体的炎症链式反应, 在跨膜信号转导受体家族TLRs中占有重要的位置。脑梗死时缺血缺氧所促发的血管内皮通透性改变及脑组织坏死物质释放, 吸引外源性的单核/巨噬细胞、淋巴细胞趋化聚集, 成为加剧炎性损伤的效应细胞, 这些细胞均有丰富的TLR4表达。奉俊敏等[16]发现脑梗死患者急性期外周血单核细胞TLR4 mRNA 表达上调, 由此通过促使炎性因子分泌增多来介导脑缺血炎性损伤。

3.3 肿瘤坏死因子 (Tumor necrosis factor, TNF-α) TNF-α能增强血脑屏障的通透性, 引起白细胞浸润、炎症因子聚集, 诱导细胞间黏附分子 (ICAM-1) 表达, 加速细胞凋亡。Zou等[17]研究发现TNF-α增强亚剂量谷氨酸的神经兴奋毒性损伤可能是神经炎症反应的重要机制之一, 且表明TNF-α和谷氨酸对神经元死亡有协同作用。TNF-α抑制星形胶质细胞对谷氨酸的摄取, 增高细胞外谷氨酸的浓度。

脊髓缺血再灌注损伤 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

38例患者中, 男30例, 女8例, 年龄32~85岁, 平均60.8岁;上肢6例, 下肢32例;急性肢体动脉栓塞29例, 动脉硬化性闭塞症继发急性血栓形成9例。缺血时间2~30d, Ⅰ期缺血11例, Ⅱ期缺血24例, III期缺血3例。术前上肢肿胀不明显, 下肢术前不同程度肿胀17例。

1.2 方法

38例患者中, 单纯球囊取栓术治疗26例 (截肢3例) , 球囊取栓+股动脉内膜剥脱5例, 球囊取栓+股动脉内膜剥脱+股深动脉成型3例, 球囊取栓+股动脉+动脉人工血管搭桥1例, 自体大隐静脉搭桥1例。球囊取栓+肱动脉-桡动脉人工血管搭桥、人工血管+尺动脉自体静脉搭桥+腋动脉球囊扩张成形1例, 球囊取栓+股动脉成形内支架术1例。动脉取栓完成后, 向远端动脉灌注尿激酶20万U, 几分钟后, 向动脉远端灌注肝素盐水, 罂粟碱60mg, 复方丹参液16m L或川青注射液240mg, 甘露醇、七叶皂甙纳等药物。解除患肢动脉阻断前, 静脉快速输入碳酸氢钠100~250m L, 开放动脉血流同时, 阻断患肢主干静脉并放出最初静脉血200~800m L丢弃或洗涤后将红细胞回输。分次间断开放近端动脉, 控制再灌注压力及流量。术后给于抗凝、溶栓、扩血管, 降纤治疗, 同时静脉输入甘露醇, 前列腺素, 以及丹参或川青, 七叶皂甙钠等疏通微循环, 抗氧自由基治疗。术后密切观察患肢肿胀程度, 皮温、皮色、感觉及运动功能变化, 监测血气分析、血电解质、肌磷酸激酶 (CPK) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、谷草转氨酶 (SGOT) 、MDA、尿常规检查。及时对缺血再灌注损伤作出诊断和治疗。肢体疼痛与肿胀进行性加重, 及时行肌筋膜切开减压。4例术后给于血液透析。

2 结果

65例急性肢体动脉缺血再通术后出现再灌注损伤38例, 上肢6例, 下肢32例。上肢急性动脉缺血再通术后再灌注损伤程度较下肢轻, 肢体急性动脉栓塞再通术后再灌注损伤程度较动脉硬化闭塞症继发急性血栓形成重, 再通术后再灌注损伤程度与术前缺血时间、缺血程度及再灌注速度有关。再通术后38例肢体出现不同程度的肿胀、疼痛、麻木, 72h内达高峰, 以后开始缓解。出现肌红蛋白尿18例, 少尿4例, 肌筋膜切开3例, 死亡2 (截肢1例, 拒绝截肢1例) 例, 死亡率5.2%, 药物治愈33例。

3 讨论

急性肢体动脉缺血常为肢体急性动脉栓塞或动脉硬化闭塞症继发急性血栓形成所致, 再通术后再灌注损伤为手术治疗后常见的并发症。

近年来, 国内外对肢体缺血再灌注损伤机理研究较多, 对肢体缺血性损伤的治疗上侧重在尽快恢复血循环、改善微循环, 而对缺血后再灌注损伤注意不够。事实上, 大量的动物实验和临床实践研究证实, IR常常较单纯缺血所造成的后果更为严重[1]。急性动脉阻塞后患肢因组织缺血缺氧导致肌纤维内无氧代谢和一些毒素产生及肌纤维膜的通透性增加, 随着肢体缺血时间的延长, 产生大量氧自由基和脂质过氧化物[2], 可破坏微血管内皮细胞, 形成微循环栓塞, 使远端组织灌注不良, 同时过氧化氢在肌肉中积聚增多, 可引起骨骼肌细胞变性、坏死。临床上可出现肢体末端疼痛、关节僵硬、感觉异常等缺血表现。当患肢血运重建后, 高速高压的血流冲击可使血管内皮细胞损伤进一步加重, 血管通透性增加, 大量液体通过血管壁渗入组织间隙, 使组织内张力明显增高。可造成骨筋膜间隙综合征, 使肢体缺血进一步加重。同时大量氧自由基、酸性代谢产物等有毒物质进入血液被运送至远隔组织器官 (肺、肾、脑) 或通过激活中性粒细胞造成远隔器官损伤[3]严重者引起代谢性酸中毒, 高血钾症和急性肾衰, ARDS及精神症状。导致肌病肾病代谢性综合征 (Myonephropathic-Metabolic Syndrome MMS) 。是围手术期死亡和截肢的主要危险因素。有效的预防和及时处理该并发症对降低急性肢体动脉缺血患者的死亡率和截肢率具有非常重要的意义。

肢体缺血再灌注损伤程度与缺血时间、缺血程度及再灌注速度有关。缺血时间越长及缺血程度越重, 再灌注损伤的程度就越重。此外, 缺血肢体血液恢复灌注时如灌注速度过快、灌注量过大可加剧血管内皮的损伤, 加重损害程度。术后肢体肿胀、疼痛等缺血再灌注损伤的症状也相应较重。所以, 及时解除肢体动脉的阻塞, 尽量减少缺血时间, 同时采取各种有效措施早期预防和减少缺血再灌注损伤是治疗的关键。基于对缺血-再灌注损伤机制的认识, 不少学者从减少氧自由基产生, 加速氧自由基排出方面进行了大量研究。Wright[4]和Robert[5]的研究证实:限制再灌注血流量、低温、或者血液肝素化等方法均可减轻缺血-再灌注损伤。更多的学者则集中在对氧自由基清除剂的研究上, 目前普遍认为, 再灌注后, 细胞内产生的毒性氧自由基是骨骼肌缺血再灌流损伤的主要原因[1]实施各种氧自由基清除剂治疗是提高肢体缺血再灌注损伤治疗有效性的根本措施。缺血预适应和基因治疗被认为是最有价值的治疗手段, 但因受到多种因素限制在急性动脉栓塞的治疗中并未显示优势。本组65例急性肢体动脉缺血患者, 再通术后出现再灌注损伤38例, 患者大部分再通术后30min出现不同程度再灌注损伤, 出现患肢肿胀及肌红蛋白尿;72h内达到高峰, 然后开始缓解, 病程持续时间8~15d, Ⅰ期缺血的患者仅出现手部或下肢胫前肌群的肿胀, 少部分Ⅱ期及III期缺血的患者可出现严重的肌病肾病性代谢综合症。肌筋膜切开3例。动脉硬化闭塞症继发血栓形成患者均有不同程度的慢性缺血病史, 再通术后再灌注损伤程度较肢体急性动脉栓轻。有3例出现胫前神经受压症状, 通过药物治疗后缓解, 无明显的后遗症。

我们在术前给患者肝素治疗外, 静脉输入甘露醇250m L, 维生素C5.0g, 取栓术后, 向远端动脉灌注尿激酶, 用肝素盐水灌洗动脉远端, 使灌洗液从静脉流出, 减少毒素吸收[6]然后向远端动脉灌注罂粟碱、复方丹参液或川青注射液以及甘露醇、维生素C等药物, 术前、术中尽早应用这些药物旨在改善微循环, 有效的清除氧自由基, 降低脂质过氧化程度, 川芎嗪还是钙的拮抗剂-可阻断钙离子内流, 防止血小板聚集[7], 降低毛细血管通透性、减轻组织水肿。保护细胞并提高机体应激能力, 减轻肌体的缺血再灌注损伤, 可以降低术后截肢率及缺血性肌挛缩[8]。恢复血流前, 立即用Na HCO3碱化尿液, 纠正代谢性酸中毒, 有助于预防毒素吸收造成的心律失常、心跳骤停、肾功能衰竭的发生。恢复血流时采取分阶段开放近端动脉[9], 控制再灌注量, 灌注压力以减轻高速高压的血流冲击进一步加重血管内皮细胞损伤, 能明显减轻骨骼肌损伤, 让肾脏有充分排泄的间隙。恢复循环同时, 采取阻断患肢静脉放血, 放出适量含有大量代谢废物的血液或血液净化处理后回输, 血液透析及应用利尿剂可减少聚积在缺血肢体的代谢产物大量进入全身血循环中, 减轻代谢性酸中毒及氧自由基等毒性物质对心肾、肺等脏器的损害。在血管复通术后则应加强观察, 及早发现缺血再灌注损伤表现。其早期临床表现主要有肢体胀痛、皮肤感觉异常、局部皮温增高、肢体肿胀张力增高、趾、踝关节活动受限等。一些实验室指标, 如血钾、肌磷酸激酶 (C P K) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、谷草转氨酶 (SGOT) 等升高均提示肌肉有坏死情况可助监测, 根据临床表现并结合实验室检查, 可对缺血再灌注损伤作出及时诊断, 及时给予有效的治疗, 以尽可能减轻缺血再灌注造成的损害。轻症患者给予抬高患肢, 小腿局部适度按摩以促进静脉回流和渗出液的吸收。同时继续应用丹参、川青、七叶皂甙钠等氧自由基清除剂, 减轻缺血再灌注损伤。如肢体疼痛与肿胀进行性加重, 则应积极行筋膜室切开减压术。如肌肉大部已呈坏死状则应果断行截肢术, 以保全生命。本组死亡的1例即因患者拒绝截肢, 以至并发肾功能衰竭, 进而引起多器官功能衰竭而死亡。

摘要：目的探讨急性肢体动脉缺血再通术后再灌注损伤的有效治疗方法。方法回顾性分析65例急性肢体动脉缺血再通术后再灌注损伤治疗患者的临床资料, 上肢8例, 下肢52例。结果65例急性肢体动脉缺血再通术后出现再灌注损伤38例。肢体急性动脉栓塞再通术后再灌注损伤程度较动脉硬化闭塞症继发急性血栓形成重, 再通术后再灌注损伤程度与术前缺血时间及缺血程度成正比关系。动脉再通后30min出现再灌注损伤, 24h达到高峰, 72h后开始缓解, 时间8～15d。肌筋膜切开3例, 死亡2例, 药物治愈33例。结论及时实施再通术是预防再灌注损伤的关键, 再通术前后的有效治疗能够有效缓解再灌注损伤的发生和减轻再灌注损伤的症状。

关键词：急性动脉缺血,再通术,灌注损伤

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内质网应激与脑缺血再灌注损伤 篇9

1 ERS

1.1 ER的结构与功能

ER在细胞内分布广泛, 是真核细胞中一个动态的膜性细胞器, 是真核细胞中蛋白质翻译合成和储存钙离子的场所, 分为粗面ER和滑面ER, 其中粗面ER是蛋白质合成的场所, 表面附着核糖核蛋白体, 滑面ER不参与蛋白质的合成, 但其功能更为复杂。ER是细胞内重要的器官之一, 所有分泌性蛋白和膜蛋白都在此翻译或翻译后转运至ER腔, 经修饰、折叠及低聚体化作用后运送至高尔基复合体[2]。ER参与重要的生理功能的维持, 其基本生理功能包括蛋白质和脂质合成、信息储存及传递、物质运输、糖类代谢及解毒作用, 调节细胞内蛋白质的合成后折叠与聚集, 维持细胞内钙离子的水平。ER腔内钙离子能够进行信号传递并保持动态平衡, 是决定ER合成和处理蛋白质、防止触发ERS反应的关键因素[3]。

1.2 ERS与信号传导途径

ERS主要激活三条信号通路[4]: (1) 未折叠蛋白质反应 (unfolded protein response, UPR) ; (2) ER超负荷反应 (ER-overload response, EOR) ; (3) 固醇调节级联反应。其中前二者为蛋白质加工紊乱所致, 后者则为ER表面合成的胆固醇损耗所致[5], 不同类型的ERS途径也有所差异。

1.2.1 UPR

UPR是由于错误折叠与未折叠蛋白质不能按正常途径出ER从而在其腔内滞留所致, 是目前认识最为清楚的ERS所活化的信号转导通路之一[6]。UPR的启动因子是ER的Ⅰ型跨膜蛋白 (Ire1P) 。哺乳动物的UPR通路较复杂, 目前较为明确的有三条相互联系的通路, 即:IRE1-XBP1通路、ATF-6通路、PERK-el F2α磷酸化-ATF4通路[7]。

1.2.1.1 IRE1-XBP1通路

哺乳动物细胞有两个IRE1同源物-IRE1α和IRE1β, 二者的核酸内切酶活性作用的底物是X盒结合蛋白-1 (XBP-1) 的m RNA。应激状态下, 活化转录因子-6 (ATF-6) 上调XBP-1 m RNA的转录, 同时IRE1α活化, N端和BIP分离, C端具有核酸内切酶活性, 能特异性的剪接转录因子XBP-1 m RNA, 并迅速翻译大量的45000kD的p XBP1 (S) (spliced form) 。p XBP1 (S) 具有b ZIP结构域, 作为转录因子在NF-Y存在的情况下与ER应激反应元件 (ERSE) 和未折叠蛋白反应元件 (UPRE) 结合, 从而诱导分子伴侣和折叠酶的表达, 辅助和监控聚集蛋白质折叠并装配成天然构象[8]。p XBP1 (S) 还可以诱导脂类合成所需的酶类、参与ER相关蛋白降解 (ERAD) 途径的蛋白分子, 从而降解那些无法正确折叠的蛋白质[8]。激活的IRE-1, 其胞浆的酶结构域招募接头分子TRAF2并与ASK1共同形成IRE-1-TRAF2-ASK1复合物, 既而激活JNK。过表达ASK1会诱导细胞的凋亡[9]。

1.2.1.2 ATF-6通路

ATF-6是位于ER的Ⅱ型跨膜蛋白, 是未折叠蛋白的感受器。ER腔内的C端有多个BIP结合位点和两个高尔基体定位信号 (Golgilocalization signal, GLS) 。与Ire1P相同, 未发生ERS时, ATF-6与BIP形成稳定的复合物, BIP通过阻止GLS而停留在ER上。应激时, BIP和ATF-6解离, BIP对GLS的抑制作用解除使ATF-6转移到高尔基体, 在高尔基体内被位点-1蛋白酶 (S1P) 和位点-2蛋白酶 (S2P) 水解, 产生游离的50kDN端片段, 并转移到核内作为转录因子与ERSE结合, 促进含ERSE的转录因子 (如XBP1) 及UPR靶分子 (如BIP) 等基因转录[10]。

1.2.1.3 PERK (PKR-like ER kinase) -el F2α磷酸化-ATF4通路

PERK为ER的Ⅰ型跨膜蛋白, 应激时, BIP与PERK解离, PERK形成寡聚体并发生自身磷酸化而被激活, 活化的PERK使底物e IF2α特异性磷酸化而失去启动蛋白质翻译的能力。这种保护性机制快速阻止了新生蛋白向ER腔的转运, 减轻了ER的蛋白折叠压力。

1.2.2固醇调节级联反应

ER膜含有固醇调节元件结合蛋白 (sterol regulatory element binding protein, SREBP) 和SREBP裂解激活蛋白 (SREBP cleavage-activating protein, SCAP) 。在ERS时, ER表面合成的胆固醇的耗竭激活SREBP, 使其与SCAP形成复合物并由ER转移至高尔基体, 在高尔基体中SREBP被S1P和S2P酶解成为转录因子进入胞核, 与靶基因的固醇调节元件结合, 增强靶基因转录[11]。

2 ERS与I/R损伤

2.1 I/R诱导ERS反应

I/R早期引起GRP78的表达上调, 晚期引起蛋白合成抑制。el F2磷酸化是蛋白合成抑制的主要原因。Kumar等[12]利用小鼠脑I/R模型证实PERK是引起el F2磷酸化的主要激酶, 提示I/R所致广泛蛋白合成抑制由ERS诱导。

2.2过度ERS与I/R损伤

2.2.1氧化应激

I/R时产生大量氧自由基, ER对氧化应激非常敏感, Cu-Zn SOD过表达[13]及自由基清除剂[14]可保护缺血诱导的鼠神经细胞凋亡, 从e IF2a, PERK的磷酸化水平及CHOP, caspase-12等表达活化情况来看, 这一保护作用与减轻ERS有关, 提示氧化应激触发的ERS与I/R损伤密切相关。

2.3细胞凋亡

I/R引起过度ERS通过多条信号转导通路触发ERAD, 与线粒体凋亡途径共存并相互促进, 导致不可逆损伤。研究发现, 大鼠脑I/R后CHOP于24 h达高峰[15], 小鼠大脑I/R后24 h内即有caspase-12基因水平[16]、活化水平的明显升高, 而且这些改变与细胞凋亡情况一致, 提示I/R激发了过度的ERS, 是细胞凋亡组织损伤的原因之一。

2.3 ERS与I/R后神经细胞凋亡

早期的ERS对细胞具有保护作用, 后期过度的ERS会促进神经细胞凋亡从而加重I/R损伤。

Caspase-12是ERS导致凋亡的特异性介质, 其表达上调也在脑I/R动物模型中发现。大脑中动脉栓塞1 h, 免疫组化发现再灌注5～23h后Caspase-12的合成活化, 且其定位与神经细胞凋亡一致[17], 而且随着I/R时间的延长, 保护性因子GRF78的活性被Caspase-12抑制[18], 以上研究均提示ERS机制参与脑I/R后的神经细胞凋亡, 但其中的具体反应机制尚待进一步研究。

3 问题与展望

I/R启动ERS, 前期以GRP78表达上调为主, 细胞进行自我保护, 后期以Caspase-9, -12表达上调为主, 启动细胞凋亡途径, 具体机制尚待进一步研究, 对其进行适当的干预可能成为I/R损伤的潜在治疗靶点。

脊髓缺血再灌注损伤 篇10

【关键词】益气化瘀方；心肌缺血再灌注损伤；超氧化物歧化酶；肿瘤坏死因子-α；基质金属蛋白酶- 9

本文旨在探讨益气化瘀方对大鼠缺血再灌注模型中的超氧化物歧化酶（SOD），基质金属蛋白酶（MMP9），肿瘤坏死因子（TNF-α）以及该方对缺血再灌注所致心肌梗塞程度等指标的影响，初步观察了益气化瘀方对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用并对其作用机制进行了初探，为该方在保护急性心肌缺血再灌注损伤的临床应用提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物SD大鼠40只，雄性，180～220 g，购自南方医院动物中心，合格证号：SCXK(粤) 2004-2005。

1.1.2药物益气化瘀方由田七10g，丹参20g，土鳖虫10g，仙鹤草15g，五爪龙15g组成；上方煎煮两次，药液浓缩成每毫升相当于0.6g生药的浓度，供灌胃用。

1.1.3材料SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所，MMP9试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，TNF-α试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。动物呼吸机( ALC-V8，上海奥尔科特生物科技有限公司)；单导心电图机（ECG-6511型，上海汇丰医疗器械有限公司）。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理40只SD大鼠随机分为5组，每组8只：假手术组，缺血再灌注模型组（用等同容积生理盐水灌胃），实验组（益气化瘀方高、中、低剂量组），根据人鼠临床用药换算公式，换算成鼠的用量，分别给予益气化瘀方高、中、低剂量（高剂量、中剂量、低剂量15.9、7.94、3.97g／kg·d)药物灌胃，每日一次，共10d，末次灌胃后12h，造模并检测相关指标。

1.2.2心肌缺血再灌注模型的制备实验动物用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，仰位固定，常规记录肢体Ⅱ导联。沿胸骨左缘心脏搏动处纵向剪开皮肤约2cm，暴露左第2-4肋，开胸打开心包膜，充分暴露心脏及其表面的血管，用4/0医用缝合线在冠状动脉前降支挂线，结扎40min后，观察心电图变化。假手术组只穿线不结扎。剪断结扎线，开始心肌再灌注，观察60min[1]。

1.2.3取材及测定再灌注结束时于右心房取血3ml，分离血清，放射免疫法测定TNF-α；再灌注结束时于腹主动脉令取血2ml，酶联免疫法测定MMP-9；再灌注结束时，在结扎线下约3cm处取0. 2g左右心肌组织，按比例(10%)加入冰盐水，在冰水混合浴中进行组织匀浆，低温离心2500r/min，15min，取上按试剂盒说明检测SOD。心脏结扎线以下横切5片，N-BT染色,采用多媒体彩色病理图文分析系统(MPIAS-500)测量正常心肌及梗塞心肌面积，观察心肌梗塞程度。

1.2.4统计学方法计量资料数据用均数±标准差（±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件对各组数据进行单因素方差分析，组间比较用t检验，P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1对心肌梗塞程度的影响：结果见表1。益气化瘀方高、中剂量组梗塞区心肌面积及重量均显著降低，与缺血再灌注模型组比较均有显著性差异(P<0.01)。益气化瘀方低剂量组梗塞区心肌面积及重量均降低，与缺血再灌注模型组比较有统计学意义(P<0.05)。

与假手术组比较，**P＜0.01，与缺血再灌注模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

2.2对血清SOD、MMP9及TNF-α含量的影响结果见表2。缺血再灌注模型组SOD含量明显减少、MMP9及TNF-α含量明顯增加，与假手术组比较有显著性差异(P<0.01)。益气化瘀方高剂量组MMP9及TNF-α含量明显降低，SOD活性明显增加，与缺血再灌注模型组比较均有显著性差异(P<0.01)。益气化瘀方中剂量组MMP9及TNF-α含量降低，与缺血再灌注模型组比较均有统计学意义(P<0.05)；SOD活性明显增加，与缺血再灌注模型组比较有显著性差异(P<0.01)。益气化瘀方低剂量组SOD活性增加，与缺血再灌注模型组比较有统计学意义(P<0.05)。

与假手术组比较，**P＜0.01，与缺血再灌注模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

3讨论

急性心肌梗死是严重危害人类身体健康的一类疾病。随着溶栓治疗，经皮冠状动脉介入治疗的推广和应用，使大部分急性心肌梗死时缺血的心肌将重新得到血液灌注，但在实验和临床中发现在一定的条件下再灌注的心肌损伤反而加重，因此缺血再灌注引起的心肌损伤也成为了众多学者研究的热点和难点。缺血再灌注损伤的机制极为复杂，涉及自由基损伤，再灌注心肌的炎症反应，细胞内钙超载等[2]。氧自由基损伤是心肌缺血再灌注损伤其发生的主要机制和直接原因[3]。而SOD作为自由基清除剂，广泛地存在于生物体组织内，能催化超氧阴离子等自由基，发生歧化反应，阻止自由基的连锁反应，从而保护机体。因此，血液中SOD的活性可以反映机体抗氧化活性。我们研究发现益气化瘀方可以能提高血清SOD的活性，增强SOD清除氧自由基的能力，从而达到抗氧化损伤，达到稳定细胞膜及细胞器的作用。

TNF-α在正常的心肌组织中含量很低，但是在缺血再灌注心肌中肥大细胞及中性粒细胞大量释放该炎症因子，过量的TNF-α可介导白细胞在缺血心肌的聚集，造成内皮损伤及血栓形成，从而加重缺血再灌注的心肌损伤[4]。大量研究也表明，采取任何治疗方法抑制细胞因子TNF-α可达到减少白细胞在缺血心肌的黏附聚集从而对缺血再灌注心肌起到保护作用[5]。而MMP-9存在于心肌内膜，内膜下层和心肌细胞内，其作用底物为多种胶原蛋白。有研究表明，MMP-9在急性心肌缺血再灌注损伤模型中均有高表达，而其缺失可减轻持续性冠状动脉结扎诱导左室扩张和胶原聚集，表明MMP-9在心肌梗死后基质重塑中有着极为重要的作用[6]。MMP-9参与了冠心病发生，发展的整个过程[7]。抑制MMP-9的产生和表达，进而可以降低心脏胶原的的降解，可以减轻心肌细胞的损伤。我们研究发现益气化瘀方可以能降低缺血再灌注模型中TNF-α和MMP-9的含量，从而抑制心肌缺血再灌注时炎性递质激活，达到减轻心肌缺血再灌注损伤和保护受损心肌的作用。

中医药对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究是近年来中西医结合研究的热点之一。国内众多学者采取不同方法，从不同侧面和层次对中药复方防治心肌缺血再灌注损伤进行了大量基础研究，揭示了中医药保护心肌缺血再灌注损伤的部分作用机制，取得了一定的研究成果。其中，中药复方虽然能对心肌缺血再灌注损伤保护起到多方面协同作用，具有多环节、多靶点干预的优势，但各类药物的相互作用机制尚未阐明，所采取的研究方法有待规范化和制定统一的评价标准。我们的研究表明，益气化瘀方能减轻实验大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的程度，这与临床观察结果相符，其作用机制与提高SOD活性、降低TNF-α和MMP-9含量有关。提示益气化瘀方能明显减轻氧自由基所致的细胞损伤和抑制炎症损伤，保护缺血再灌注心肌组织，可有效防治心肌缺血再灌注损伤。在今后研究中，我们将着重以该方对自由基损伤和炎症损伤的信号传导通路的影响作為研究的切入点，以期能深入探讨该方防治缺血再灌注损伤的作用机制。

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