抗氧化代谢

抗氧化代谢（精选五篇）

抗氧化代谢 篇1

1 材料与方法

1.1 试验动物

成年雌性Beagle犬15只 (由江苏省宠物繁育中心提供) , 年龄为3～5岁, 体重为9～15 kg, 都有繁育史, 喂饲宝路犬粮。动物实验室温度为 (22±5) ℃, 湿度为60%～80%。

1.2 分组与饲养

按体重将15只Beagle犬随机分成3组, 即对照组、绝育组及干预组。常规饲养1周后, 所有犬按体重0.05 mL/kg肌肉注射犬眠宝注射液, 对照组不做手术, 绝育组及干预组在无菌条件下切除双侧卵巢及子宫。对照组及绝育组饲喂宝路犬粮, 干预组饲喂宝路犬粮+5 mg/kg大豆异黄酮 (华北制药厂生产) , 每组5只犬, 分笼饲养60 d, 保证犬饮水充足。

1.3 测定项目

1.3.1 脂肪代谢指标的测定

分别于术前 (0天) 及术后60天采血, 分离血清, 测定相关数值。血清三酰甘油 (TG) 、总胆固醇 (CHOL) 、高密度脂蛋白 (HDL) 、低密度脂蛋白 (LDL) 含量的测定用全自动生化分析仪, 相应试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.2 抗氧化和脂质过氧化指标的测定

分别于术前 (0天) 、术后60天采血, 应用722光栅分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) 测定血清谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 和丙二醛 (MDA) 含量, 总抗氧化能力 (T-AOC) 的测定参照试剂盒说明书进行。试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 统计分析

应用SPSS17.0软件统计试验数据, 组间差异用单因素方差分析方法 (ANOVA) 进行分析, 各组数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 大豆异黄酮对绝育母犬血清脂肪代谢指标的影响 (结果见表1)

由表1可知:术后血清TG含量呈升高趋势, 干预组与绝育组相比差异显著 (P<0.05) , 与对照组相比差异不显著 (P>0.05) , 而绝育组与对照组相比差异显著 (P<0.05) ;干预组血清CHOL含量与对照组相比差异不显著 (P>0.05) , 但与绝育组相比差异显著 (P<0.05) ;干预组血清LDL含量与绝育组相比显著差异 (P<0.05) ;干预组血清HDL含量与绝育组相比显著差异 (P<0.05) , 而与对照组相比差异不显著 (P>0.05) 。说明大豆异黄酮可以促进去势后母犬的脂肪代谢。

注:同行数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。

2.2 大豆异黄酮对犬血清脂质过氧化指标的影响 (结果见表2)

注:同行数据肩标小写字母完全不同表示差异显著 (P<0.05) , 大写字母完全不同表示差异极显著 (P<0.01) , 含有相同字母表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表2可知:绝育组血清GSH-Px活性有降低趋势, 与对照组比较显著差异 (P<0.05) , 干预组的GSH-Px活性虽然有所提高, 但与绝育组及对照组相比差异不显著 (P>0.05) ;干预组SOD活性显著高于绝育组 (P<0.05) , 而与对照组比较差异不显著 (P>0.05) ;干预组MDA含量明显低于绝育组 (P<0.05) , 但高于对照组且差异不显著 (P>0.05) , 而绝育组MDA含量与对照组相比差异极显著 (P<0.01) ;干预组的T-AOC水平比绝育组高, 而低于对照组, 但差异不显著 (P>0.05) , 绝育组T-AOC水平明显低于对照组 (P<0.05) 。说明大豆异黄酮能提高去势母犬的抗氧化能力。

3 讨论

3.1 大豆异黄酮对绝育母犬血清脂肪代谢指标的影响

大豆异黄酮与雌激素结构相似, 具有调节血脂作用。崔洪斌等[4]研究发现, 大豆异黄酮可以升高去卵巢大鼠血清HDL含量并降低TG含量。张锋等[5]研究发现, 大豆异黄酮可颉颃高脂饲料对去卵巢大鼠造成的脂代谢紊乱, 并促进肝脏中LXRx基因的表达。此次试验结果表明:大豆异黄酮可提高绝育母犬血清中HDL含量, 同时降低TG、CHOL及LDL含量, 这与张锋等[5]的报道结果一致, 而与逄晓云等[6]的报道结果相反, 这可能是由大豆异黄酮用量不同造成的。

3.2 大豆异黄酮与机体抗氧化能力的关系

研究发现, 大豆异黄酮可抑制绝育母犬体内MDA的生成, 而MDA可造成细胞膜的脂质过氧化损伤。大豆异黄酮可直接捕捉和清除超氧阴离子自由基等自由基和过氧化氢, 通过对其起氢原子供体的作用而阻断和终止自由基连锁反应链, 阻止和抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应病理性加剧[6,7]。此外, 大豆异黄酮干预组的抗氧化指标均高于绝育组, 说明大豆异黄酮可增强绝育母犬的抗氧化能力。

4 结论

综上所述, 大豆异黄酮可改善去势雌性犬的脂肪代谢, 并能增强其抗氧化能力, 为去势后母犬肥胖症的治疗提供了新的线索。

参考文献

[1]吴大方, 周泉, 丁宝玲.绝经后妇女雌激素水平与血糖及血脂变化的关系[J].中国综合临床, 2005 (1) :31-32.

[2]宠物医生手册编写委员会.宠物医生手册[M].沈阳:辽宁科学技术出版社, 2009:528-529.

[3]陈玉胜, 张李阳.大豆异黄酮的药理功效研究进展[J].四川生理科学杂志, 2011, 33 (1) :26-27.

[4]崔洪斌, 那晓琳, 方庆伟.大豆异黄酮对去卵巢大鼠脂、骨代谢的影响[J].中国公共卫生, 2003, 19 (7) :836-837.

[5]张锋, 万忠晓, 张玉梅.大豆异黄酮对去卵巢大鼠LXRα表达影响[J].中国公共卫生, 2010, 26 (2) :224-225.

[6]逄晓云, 沈金芳, 贡沁燕.大豆异黄酮对大鼠血脂的影响及其体内外抗氧化作用研究[J].中国临床药理学与治疗学, 2008, 13 (1) :62-64.

抗氧化代谢 篇2

铜对金星蕨生理代谢及抗氧化酶活性的影响

摘要：通过盆栽实验研究了Cu处理对金星蕨的生理代谢及其抗氧化酶活性的影响.结果表明,在低浓度Cu(50～500 mg/kg)处理下,金星蕨叶绿素a、b和叶绿素(a + b) 的含量均出现不同程度的增加,而在高浓度Cu(1000～2000 mg/kg)处理下,上述色素含量均显著下降,细胞膜透性平均高出对照2.74倍,MDA 含量平均为对照的.1.16倍,表明高浓度Cu胁迫对金星蕨的生物膜及主要细胞器的结构与功能具有破坏作用.Cu胁迫对类胡萝卜素含量无显著影响.Cu 胁迫下金星蕨抗氧化酶活性随Cu 浓度增加而上升,且与Cu 浓度呈极显著正相关.POD的活性随Cu 浓度的增加而呈先升后降的趋势.作 者：CHU Lei 于小丽 LI Ying 刘登义 CHU Lei YU Xiao-li LI Ying LIU Deng-yi 作者单位：安徽师范大学生命科学学院,重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室,芜湖,241000期 刊：生物学杂志 ISTIC Journal：JOURNAL OF BIOLOGY年，卷(期)：2008,25(4)分类号：X173关键词：铜 金星蕨 生理代谢 抗氧化酶活性

抗氧化代谢 篇3

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

① 雄性罗斯肉鸡购于无锡马山祖代鸡场。

② DLM(纯度98%)、HMTBA(纯度88%),两种蛋氨酸源均由ADISEEO(安迪苏)上海公司提供;

③ Multiskan Mk3酶标仪(美国Thermo公司);MPI-B型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈分析仪器有限公司);

1.2 材料分组及预处理

选取160只鸡,随机分为5组(对照组和4个实验组),每组4个重复,每个重复8只鸡。对照组饲喂无添加蛋氨酸源的基础饲粮,实验组饲喂在基础饲粮中分别添加等摩尔DLM和HMTBA的实验饲粮,添加剂量为0.1%和0.3%(前期),0.08%和0.24%(后期)。根据肉鸡的营养需要,饲养分为前期和后期。常规三层笼养,24 h光照,自由采食,充足饮水,按正常免疫程序进行免疫接种。基础饲粮参照美国国家研究委员会(NRC)禽类营养需要量肉鸡饲养标准[7]配制,组成及营养水平分别见表1和表2。

1.3 样本采集及生产性能测定

在1、21和46日龄分别称重,计算体增重,并于每周结算饲料消耗,计算采食量以及料重比(采食量/体增重),在46日龄,从每个重复随机抽取2~3只,每组共8只鸡,颈脉放血,采集血液,测ROS后,离心取血浆,-20℃保存备测生化指标。

屠宰,取肝脏、腓肠肌组织按重量体积比1∶10

注:1每千克饲料中含:VA 1 500 IU,VD3 200 IU,VE 10 IU,VB23.5 mg,VB3 10 mg,烟酸30 mg,氯化胆碱1 000 mg,VH 0.15 mg,叶酸0.5 mg,VB1 1.5 mg,VB6 3.0 mg,Fe 80 mg,Zn 40 mg, Mn 60 mg,I 0.18 mg,Cu 8 mg,Se 0.15 mg

注:代谢能为计算值,其余为实测值

用预冷的生理盐水制成0.9%的组织匀浆待测氧化还原指标;取左侧胸肌、腿肌样品及腹脂称重;取右侧腓肠肌-80℃保存。

1.4 指标测定

1.4.1 胸肌率、腿肌率等指标的测定

胸肌率=(胸肌重/全净膛重)×100%;腿肌率=(腿肌重/全净膛重)×100%;腹脂率=(腹脂重/全净膛重)×100%。全净膛重是指鸡屠体去气管、食道嗉囊、肠道、脾脏、肝脏、胰脏、生殖器官、心、肝(去胆囊)、腺胃、肌胃、腹脂,保留肺和肾脏的重量。

1.4.2 代谢激素的测定

血清中生长激素(GH)、胰岛素(INS)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)采用放射免疫法于北京华英生物技术研究所测定。

1.4.3 氧化还原指标的测定

ROS采用Luminol化学发光法[8]测定,还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)采用荧光光度法测定,参考张迺哲[9]等的研究方法,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力采用DNTB比色法[10],总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)均采用试剂盒法测定,所用试剂盒购于南京建成生物工程研究所。组织匀浆液的蛋白含量采用G-250考马斯亮蓝法测定,以牛血清白蛋白为标准。

1.5 数据统计与分析

实验数据采用Excel 2007和SPSS 14.0软件进行统计分析。实验数据用平均值±标准差表示,ANOVA过程进行单因素方差分析(one-way ANOVA),p<0.05为差异显著,Duncan氏多重比较检验。

2 结果与分析

2.1 不同蛋氨酸源对肉鸡生产性能指标的影响

与对照组相比,基础饲粮中添加0.3%DLM、HMTBA均显著提高21日龄肉鸡的体重及采食量(p<0.05),而添加0.3%HMTBA组体重及采食量增加显著(p<0.05)高于0.3%DLM组,而饲料转化率各组均无显著差异(p>0.05)(见表3)。

注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

从表4中可以看出,21~46 d,添加0.24%HMTBA组显著增加了肉鸡体重(p<0.05),与前期结果一致,但对饲料转化率及采食量影响差异不

注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

显著(p>0.05)。

2.2 不同蛋氨酸源对46日龄肉鸡胸肌率和腿肌率指标的影响

不同蛋氨酸源对46日龄肉鸡屠宰性能的影响如表5所示。与对照组相比,饲粮中添加0.08%、0.24%HMTBA 显著提高了肉鸡腿肌重、腿肌率以及胸肌重(p<0.05),而0.08%、0.24%DLM与对照组无显著差异(p>0.05);对于胸肌率以及腹脂率,各组间无显著差异(p>0.05)。

2.3 不同蛋氨酸源对46日龄肉鸡血浆氧化还原状态的影响

血液ROS含量反映机体组织自由基水平。机体抗氧化系统包括酶促体系和非酶促体系。GSH-Px、CAT属于机体抗氧化防御机制的酶促体系,可清除体内过量的自由基,非酶促体系如GSH/GSSG,反应了细胞的硫醇氧化还原状态[11]。而T-AOC是全面衡量机体组织整体抗氧化系统功能状况的指标,MDA是脂质过氧化的产物,其含量反映了机体脂质过氧化程度。

表6描述了不同蛋氨酸源对46日龄肉鸡血浆氧化还原状态的影响。与对照组及DLM组相比,

注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

饲粮添加HMTBA显著提高了肉鸡血浆GSH/GSSG的比率以及T-AOC能力(p<0.05),并且添加0.24%HMTBA显著升高了血浆CAT活性(p<0.05)。对于血液ROS水平,与对照组相比,饲料中补充蛋氨酸源后ROS水平呈下降趋势,其中添加0.08%HMTBA显著降低了血液ROS水平(p<0.05)。

2.4 不同蛋氨酸源对46日龄肉鸡肝脏氧化还原状态的影响

如表7所示,饲粮添加0.08%DLM和0.08%HMTBA均显著提高了GSH/GSSG值(p<0.05),除0.08%DLM组外,其余各组与对照组相比肝脏CAT活性均显著提高(p<0.05),尤其0.24%HMTBA组CAT活性最高并且肝脏T-AOC水平显著提高(p<0.05);饲粮补充蛋氨酸源,肝脏GSH-Px活性显著升高(p<0.05),而MDA含量均显著下降(p<0.05),尤其0.08%HMTBA组MDA含量最低。

2.5 不同蛋氨酸源对46日龄肉鸡肌肉氧化还原状态的影响

由表8可知,饲粮补充蛋氨酸源后,GSH/GSSG、CAT活性以及T-AOC水平均升高。与对照组相比,饲粮添加DLM与HMTBA均显著升高GSH/GSSG(p<0.05)并且添加HMTBA显著升高了肌肉T-AOC水平及CAT活性(p<0.05),而0.24%DLM仅显著提高了肌肉组织CAT活性(p<0.05),且DLM对于T-AOC水平差异不显著(p>0.05);与对照组及DLM组相比,添加HMTBA显著降低了MDA含量(p<0.05)。

注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

2.6 不同蛋氨酸源对46日龄肉鸡代谢激素水平的影响

表9所示的是46日龄肉鸡各组代谢激素水平的情况。与对照组相比,饲粮中添加蛋氨酸源可使血浆中T4水平上升,尤其添加HMTBA显著提高了T4水平(p<0.05);添加0.24%DLM、0.24%HMTBA显著提高了T3水平(p<0.05);并且与DLM相比,0.08%HMTBA显著提高了FT4水平(p<0.05),0.24%HMTBA显著提高了FT3水平(p<0.05),但是对于INS水平,各实验组与对照之间无显著差异(p>0.05),对于血浆生长激素GH水平,除了添加0.24%DLM和0.08%HMTBA能使其显著升高(p<0.05),其余各组之间无显著差异(p>0.05)。

注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著(p>0.05),不同小写字母表示差异显著(p<0.05)

3 讨 论

3.1 HMTBA对肉鸡生长性能的影响

本研究结果显示,在基础饲料中补充蛋氨酸源均可提高肉鸡的体增重及采食量,而饲粮添加高剂量(前期0.3%,后期0.24%)的HMTBA,肉鸡体重及采食量增加显著,此外在基础饲粮中添加0.08%、0.24%的HMTBA均可显著提高肉鸡胸肌重、腿肌重以及腿肌率。本实验所得结果与其他研究结果一致[2,12]。腿肌、胸肌是肌肉沉积的重要部分,表明HMTBA对于肉鸡的生长及肌肉沉积具有良好的促进作用。

3.2 HMTBA对肉鸡氧化还原状态的影响

肉鸡生长快速,上市体重不断增加,同时伴随高能日粮养殖,极易引起氧化应激,氧化应激不仅使肉鸡食欲减退,精神萎靡,而且减慢生长速度,降低免疫抵抗力[13]。刘作华等[14]用高能日粮(14.39 kJ·kg-1)饲喂长荣猪,导致机体脂肪沉积增加,瘦肉率降低,猪的生产效率降低。杨永兰等[15]用高脂日粮饲喂小鼠4周可显著降低其腿肌率, 而饲喂一定剂量HMTBA可显著提高肥胖组小鼠腿肌率。范石军等[16]和林海等[17]研究表明,肉鸡热应激状态下自由基产量增加,机体内SOD和GSH-Px活力降低,而MDA含量增加。这些研究结果表明,在动物生产中,动物生产效率,肌肉的生长及品质与机体的氧化还原状态密切相关。

本实验研究结果表明,添加HMTBA显著升高了肉鸡血浆、肝脏以及肌肉组织中T-AOC、GSH/GSSG、CAT活性,而全血ROS含量、肝脏以及肌肉组织中MDA含量显著降低;添加DLM除显著增加了肝脏GSH-Px以及肌肉GSH/GSSG,显著降低了MDA含量外,对其他氧化还原指标无显著影响。结果表明,与DLM相比,HMTBA能更好的降低血液自由基水平,增强血液,肝脏、肌肉组织中抗氧化酶的活性,降低脂质过氧化程度,改善机体氧化还原状态。

3.3 HMTBA对肉仔鸡代谢激素的影响

在动物生长发育和机体代谢中,生长激素、甲状腺素和胰岛素发挥着重要的调控作用。生长激素(GH)可直接作用于肌肉组织生长激素受体(GHR),促进组织对糖、氨基酸的吸收利用。甲状腺激素可以刺激机体蛋白质、脂肪、糖和盐的代谢,增加胰岛素RNA含量及胰岛素水平,增加肌肉对葡萄糖的摄取和利用,提高RNA聚合酶活性,促进肌肉蛋白的合成,维护正氮平衡,促进机体生长、组织发育[5]。补充甲状腺激素能减少高脂饲料动物体重、脂肪积累和氧化应激[18]。氧化应激也能通过T3的生成,来发挥抗氧化作用[19]。Decuypere等[20]指出,T3水平与禽类的生长呈正相关,当甲状腺功能低下时,生长明显减缓。T3、T4不能进入外周组织细胞,只有转化为FT3、FT4后才可进入细胞发挥其生理功能。本实验研究结果表明,添加0.24%DLM、0.24%HMTBA组T3水平均显著升高,并且0.24%HMTBA显著提高了FT3水平,但0.24%DLM并未显著提高FT3水平,表明高剂量的DLM、HTMBA均能提高机体T3水平,但高剂量的HMTBA能更有效地将T3转变为FT3发挥生理功效,从而促进生长,这与HMTBA增强机体抗氧化能力的结果一致。甲亢的唐氏综合症血中较低的FT4,可能是由氧化应激阻碍甲状腺素合成引起的[21]。肉鸡补充蛋氨酸源可以提高血浆中T4水平,尤其添加了0.08%HMTBA和0.24%HMTBA组显著升高了T4水平,并且0.08%HMTBA显著升高了FT4水平,这说明低剂量的HMTBA对于FT4的分泌有更好的促进作用。此外,添加0.24%DLM以及0.08%HMTBA组显著升高血浆中生长激素水平,这表明低剂量下,HMTBA能更好的促进生长激素水平的升高,从而对机体的生长发育发挥重要作用。总体而言,与DLM相比,HMTBA对机体代谢激素发挥更好的调控作用,增加肌肉沉积,促进机体生长发育,这种调控作用可能与HMTBA改善机体的氧化还原状态密切相关,且存在一定的剂量差异。

4 结 论

综上所述,与DLM相比,HMTBA可更好地降低全血ROS水平,有效改善机体氧化还原状态,增加抗应激能力,增强抗氧化能力,HMTBA可能通过改善机体的氧化还原状态,调控机体的代谢激素水平,提高机体游离甲状腺激素的水平促进生长发育,从而提高肉鸡生长性能,其具体的作用机制有待于进一步研究。

摘要：以雄性罗斯肉鸡为动物模型,探讨蛋氨酸(DLM)及其液体羟基类似物(HMTBA)对机体抗氧化能力及代谢激素水平的影响差异。结果显示,与对照以及DLM相比,饲粮添加HMTBA显著提高了肉鸡体增重、腿肌重、腿肌率、胸肌重(p<0.05);饲粮添加HMTBA能显著升高肉鸡血浆、肝脏以及肌肉组织的总抗氧化能力(T-AOC),提高还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的比率(GSH/GSSG)及增强抗氧化氢酶(CAT)活性(p<0.05);可显著降低全血自由基(ROS)含量和肝脏、肌肉组织中丙二醛(MDA)含量(p<0.05);饲粮添加0.24%的HMTBA显著增加了血浆T3、T4、FT3含量(p<0.05)。结果表明,HTMBA较DLM更能有效地改善机体氧化还原状态,增强抗氧化能力,进而调控代谢激素,提高机体游离甲状腺激素的水平,促进肉鸡生长和肌肉沉积。

抗氧化代谢 篇4

线粒体是细胞的能量工厂,是参与多个细胞生命过程包括代谢和凋亡的重要细胞器[1,2]。线粒体功能和基因异常可导致不同的生理状态和疾病,包括癌症、心血管疾病、糖尿病和神经退行性病变等[3,4,5,6,7,8,9,10]。因此,了解线粒体内代谢状态的信息对很多疾病病理研究、临床诊断和治疗有重大的意义。

从二十世纪五十年代起,强斯等开发了以荧光为基础、利用内源荧光信号NADH和Fp(或FAD)来探测细胞内氧化还原状态的方法[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]。研究表明,这些荧光信号主要来源于线粒体,NADH、Fp和氧化还原比即Fp/(Fp+NADH)、NADH/(Fp+NADH)或Fp/NADH提供了有关线粒体代谢状态的指标[23,24]。线粒体的五种代谢状态与相应的荧光信号、氧化还原态的关系见表1。

自二十世纪七十年代中期到八十年代中期,强斯实验室研发了组织内线粒体氧化还原态的三维低温荧光成像方法,利用NADH和Fp的自发荧光和它们的比值来反映组织内氧化还原状态[24,25]。三维氧化还原扫描仪已被应用于脑、心脏、肝脏、肌肉和肿瘤等组织的成像研究。迄今,强斯氧化还原扫描仪仍是以亚毫米级的空间分辨率探测组织中线粒体氧化还原状态的唯一方法。

强斯氧化还原扫描法在组织样品制备过程中施行骤冻法处理,使生物活体组织的温度在短时间内降低到液氮温度(-196℃)致使活体内代谢状态冻结,以便于利用强斯氧化还原扫描仪获得冻结前活体组织中的氧化还原状态。此外处于液氮温度时组织的NADH荧光强度比室温下强约10倍,Fp信号可能增强得更高[19]。强斯氧化还原扫描仪可进行三维扫描,具有约50μm的平面分辨率和20μm的纵向(深度)分辨率,能够为了解疾病的发生发展过程以及疾病诊断、治疗提供组织异质性方面重要的详细资料。强斯氧化还原扫描的另一个特点是采用了比率成像法。为获取组织的代谢状态或活动信息,许多研究工作分别测量了NADH或Fp(如FAD)的荧光信号[26,27,28,29,30]。比率成像法则是通过计算NADH和Fp二者的比值,即Fp/NADH,NADH/Fp,Fp/(Fp+NADH)或NADH/(Fp+NADH)等来成像。氧化还原比成像法不依赖或较少依赖于线粒体密度,能够有效地避免或减少血流动力学造成的假象和来自其它荧光源的干扰,并对检测仪器的要求较低。近年来,我们开发了采用NADH和FAD标准溶液定标的方法[31],定量测量组织中NADH和Fp的标定浓度,并基于这些标定浓度获得氧化还原比。采用标定浓度有利于将不同时间和/或不同实验条件下获得的氧化还原成像结果进行比较。

在此次研究中,我们对肿瘤和正常组织进行氧化还原扫描,通过图像观察比较这些组织的氧化还原状态空间分布和它们之间的差异,并讨论其生物学和医学意义。

2 材料和方法

2.1 肿瘤动物模型

癌细胞培养:用RPMI1640培养液培养乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌DU145细胞和黑色素瘤细胞A375P[32,33]。培养液中添加10%胎牛血清和1%青链霉素。将装有癌细胞的培养瓶放置在CO2浓度为5%的孵箱中,温度维持在37℃。

小鼠肿瘤移植:将6至8周龄的无胸腺裸鼠(NCR-nu/nu,美国国家癌症研究院)麻醉,在单侧或双侧大腿外侧皮下注射肿瘤培养细胞,每侧注入培养细胞数目约为一百万至一千万个,依细胞系不同。每周观察肿瘤生长情况并测量肿瘤大小。

2.2 扫描样品制备

样品切除和速冻:将裸鼠深度麻醉,打开胸腹腔,切除心脏、肝脏、肾脏或脾脏,迅速将取下的样本放入液氮中。采取肿瘤或肌肉样本时,将裸鼠深度麻醉后浸入液氮中快速冷冻,在干冰冷冻的金属板上用手锯将肿瘤或腿部肌肉从速冻的鼠体切离。

FAD和NADH参照标准管:用注射器将配制好的FAD或NADH标准溶液注入预先封住一端的塑料管(长度约14 mm,内径约1 mm)内,保存在液氮里备用。标准溶液浓度可依需要而定,NADH溶液浓度一般在100到200μM,FAD浓度一般为100-800μM。

包埋扫描样品:在塑料瓶盖中滴入包埋剂(酒精+甘油+水,比例10%:30%:60%),浸入液氮使包埋剂成凝胶状或雪花膏状,然后将组织标本嵌入包埋剂中,在标本附近插入冷冻的FAD和NADH标准溶液管,再添加包埋剂封装顶部并浸入液氮中完全冻结。

2.3 强斯氧化还原扫描仪的基本构造和原理

强斯氧化还原扫描仪结构和工作原理如图1所示。图中液氮样品池可以进行垂直和水平移动,四周和底部的双层池壁间填充泡沫塑料板保温,池中有螺丝可将装有样品的带螺孔的样品底座固定,并在池内放置液面感应器以便调节液氮容量,保证样品表面被液氮覆盖。

强斯氧化还原扫描仪设有电机带动高速旋转的研磨头,可以对组织进行不同深度的磨削,每次磨削深度可设定为20至400μm。磨削样品时,事先将液氮样品池按设定的磨削深度垂直升降到位,然后水平移动液氮样品池使样品通过旋转研磨头,反复磨削样品直至达到想要的扫描深度。

强斯氧化还原扫描仪的光源为汞灯,汞灯发出的光经过透镜汇聚后经过激发滤光片耦合进光纤探头。探头内有七根光学纤维,其中呈环形分布的六根光纤为照射光纤(直径为100μm),中间一根为接收光纤(直径为50-100μm)。激发光通过照射光纤入射到扫描样品上,样品发出的荧光信号被探头内接收光纤传输,通过发射滤光片,再导入光电倍增管转换为电信号进行后续处理。激发和发射滤光片分别固定在两个同步旋转的飞轮上,可实现四个光通道分时测量。其中Fp通道激发滤光片波长为430±25 nm,发射滤光片波长为525±32 nm,NADH通道激发滤光片波长为360±13 nm,发射滤光片波长为430±35 nm。另外两个通道可用不同波长的滤光片来观测其他荧光源或者采用相同波长的滤光片以观察样品表面Fp和NADH的反射信号。

2.4 氧化还原扫描

将样品固定在样品池中,磨削样品去除表面的包埋剂,形成一个暴露出标本和Fp、NADH参照标准管的平面。若扫描样品包埋的是带皮肤的组织标本,要将皮肤层磨掉,通常磨至皮下400μm左右。

将光纤探头固定在样品上方,根据样品信号强弱调整光电倍增管电压。由主机板控制在样品表面自动做二维光栅扫描,扫描矩阵范围一般为64~128步,步长100~200μm。扫描组织样本之前或之后对Fp和NADH参照标准管扫描。若Fp或NADH的信号过强,可以用中性密度滤光片调整发射光的强度。扫描数据被存储在计算机中做进一步处理。

2.5 结果分析

用Matlab软件分析氧化还原扫描得到的Fp和NADH光强信号,跟相应的标准荧光光强进行比较,获得组织中的Fp标定浓度、NADH标定浓度、Fp氧化还原比(Fp/(Fp+NADH))、NADH氧化还原比(NADH/(Fp+NADH))、Fp和NADH相互的比值即Fp/NADH和NADH/Fp的图像和相应的直方统计图。组织标定浓度按下面公式计算:组织标定浓度=组织信号强度/标准管信号强度×标准管浓度。

3 结果

3.1 肿瘤氧化还原扫描

图2所示的人类黑色素瘤的Fp图像和Fp比值(氧化还原比)图像均显示肿瘤中心部位更加氧化,Fp和NADH的直方统计图呈现双峰现象(氧化峰和还原峰),即Fp的浓度主要集中在350μM和900μM附近,NADH的浓度主要集中在50μM到120μM附近。图3所示的人类前列腺癌的NADH信号在核心部位明显减弱,Fp比值图像的核心区更加氧化。图2和图3显示肿瘤氧化还原状态在中心和边缘部位的空间分布有显著的差异,肿瘤中心部位更加氧化,反映了肿瘤组织特有的异质性。

3.2 同一肿瘤样品不同深度的扫描

肿瘤样品随扫描深度的增加其氧化还原状态分布也呈现变化。图4是同一乳腺癌肿瘤样品在不同深度的氧化还原扫描图像。随着深度加深及肿瘤核心部位切面加大,高Fp、低NADH和高Fp比值氧化区的范围也增大,说明氧化区域集中在肿瘤核心部位,也再次显示了肿瘤组织氧化还原态在空间分布的异质性。

3.3 肌肉及其他脏器氧化还原扫描

正常组织的氧化还原态分布与肿瘤组织有很大的差异。典型的正常组织的氧化还原图像参见图5,图5 a)中肌肉组织的氧化还原信号分布得较均匀,是比较典型的正常组织氧化还原状态的图像。图5 b)肝脏组织扫描图像可以看到Fp和NADH都有不均匀的现象,但Fp的氧化还原比仍然是均匀的,说明氧化还原状态分布是均匀的。图5 c)胰脏的Fp比值显示氧化还原空间分布不是很均匀,一半较氧化一半较还原,但与肿瘤组织图像(图3、图4)中的氧化还原态的空间分布仍然不同。虽然图5中三种正常组织的氧化还原信号的分布不是完全一致,但与肿瘤组织的氧化还原图像相比较,仍然显示出正常组织相对的均质性。

肿瘤组织与正常组织除了氧化还原态分布的异质性差异较大外,氧化还原比值也不同。肿瘤组织存在相对氧化和相对还原的区域,正常组织整体区域平均来看基本处于更还原的状态。

通过以上氧化还原扫描图像,可以观察到肿瘤组织和正常组织的氧化还原态空间分布具有明显的差异。虽然肿瘤组织和正常组织都可以看到信号分布不均匀,但是肿瘤组织扫描信号的空间分布趋于更加集中于某些特定区域例如中心或边缘部位(图2、图3)。正常组织的信号分布则相对分散,即使分布不均匀也无或较少特定集中分布区域(图5)。对于肿瘤组织氧化还原态空间分布的异质性,乳腺肿瘤不同深度氧化还原扫描的图像(图4)也能加以说明。

4 讨论

大量研究表明,氧化还原态是多种生理或病理过程(如与能量相关的生物过程、信号传导活动、基因表达等)中的关键因素之一[23];但是,对组织内氧化还原态的三维空间分布的研究尚处于一个起步的阶段。在结果部分我们只是展示了一些典型的肿瘤组织和正常组织样品的单层或少数几层不同深度的氧化还原扫描图像,来进行初步的定性比较和说明。这些定性的观察结果是基于自2005年以来我们采用强斯氧化还原扫描仪对多个关于癌症扩散潜力的小鼠模型研究结果。人类黑色素瘤和乳腺癌小鼠移植瘤的研究观察到了显著的肿瘤异质性,特别是在侵袭性高的肿瘤中,肿瘤核心区域和周边区域之间有明显差异[32,33,34]。在前列腺癌和结肠癌的小鼠移植瘤的初步研究中,我们也都观察到了氧化还原态的异质性分布和局部区域更氧化的状态。相比之下,正常组织显得更加均匀,处于相对还原的状态。这些研究还发现,利用氧化还原状态在肿瘤氧化区域(通常是在核心)的表达状态有可能鉴别肿瘤的转移潜能的高低。转移潜能较高的肿瘤如乳腺癌、黑色素瘤等通常具有更氧化的氧化还原态[32,33,34]。在胰腺癌癌前病变的转基因小鼠模型的研究中,我们发现癌前病变的胰腺组织比对照组的胰腺具有更强异质性、更加氧化的氧化还原态[35,36]。

在肿瘤研究中,肿瘤异质性[37,38,39]已被证明是一个肿瘤发展过程中的重要因素。因此,为了鉴别人类肿瘤的转移潜能,研究肿瘤的氧化还原态的空间分布状态和异质性是十分有意义的。其他疾病中组织异质性也是普遍存在的现象,其中蕴藏的生物医学信息有待进一步探索。为了展现组织异质性的特征,高分辨率的图像是必不可少的。我们的研究结果表明肿瘤异质性的尺度可小于毫米量级,因此需要具有亚毫米分辨率的成像工具。在临床研究中,正电子发射断层成像(PET)是对肿瘤进行分期/分级的有效手段,但其空间分辨率在临床应用中只能达到4~5 mm,对动物扫描也只能达到1~2 mm。结构磁共振成像(MRI)可以达到几百μm的高空间分辨率,但是,与功能有关的磁共振成像的空间分辨率也仍然处于几个毫米的量级。在小鼠模型中,深部组织的可见光的荧光成像的最佳分辨率也在2 mm以上。因此,虽然这些成像方法具有各自的优点、能够被应用到生物医学不同的方面,但是都受限于其空间分辨率,无法有效地探测组织异质性。近红外荧光断层扫描方法最近已可以达到亚毫米的分辨率(见http://www.visenmedical.com),然而,这种方法目前无法提供线粒体代谢方面的信息,这方面的信息与不少疾病病理有关。强斯氧化还原扫描仪可以50μm的高空间分辨率对组织内线粒体的氧化还原状态成像,使之成为能够探测组织代谢状态异质性的有效工具。只需一毫米宽窄的活检组织就可以得出结果,剩余组织还可以做常规的病理切片,与氧化还原图像进行比较。

目前,我们对肿瘤组织氧化还原扫描结果的生物学机理还不是很清楚[23]。病理组织内源性荧光信号可能有线粒体NADH和氧化黄素蛋白之外的来源[40]。虽然早期在正常细胞组织中的研究表明荧光信号主要来自线粒体,反映了线粒体的氧化还原状态,但是否对于癌细胞也是这样,还需要进一步研究。尽管如此,我们的前述结果显示强斯氧化还原扫描仪在临床医学应用方面有很大的潜力。如果高空间分辨率的强斯氧化还原扫描仪能够鉴别出体积很小的肿瘤组织及其恶性程度,则有利于临床癌症的早期发现和治疗。我们已经对乳腺癌患者肿瘤组织的针芯活检样品进行了氧化还原扫描,结果显示癌组织的氧化型黄素蛋白的标定浓度明显高于正常组织[41]。

强斯氧化还原扫描仪的不足之处包括目前只能应用离体冷冻的扫描样品,不能像X光、超声或者CT扫描一样直接对患者进行检验。实验样品随扫描被一层层磨掉,虽然有数据保留下来,但是要想在同一样品同一深度重复进行扫描就不可能了。毕竟这台机器是在30多年前设计制造的;完全有可能采用最新的工程技术,制作出更适宜于现在研究和临床应用的氧化还原成像仪器。另外,我们还在发展使用核磁共振技术进行无损伤性的氧化还原态的测量方法[42]。

我们相信随着仪器和实验方法的不断改进,氧化还原成像技术在临床上将获得广泛的应用。例如,将来有可能在对疑似肿瘤患者进行手术探查时,将切除的组织立即进行氧化还原扫描成像检验,区分正常和肿瘤组织并判断其恶性程度,在手术过程中就可得知检验结果,帮助医生判断肿瘤性质,决定手术切除范围。肿瘤如果是良性的,可以考虑局部切除;若是恶性的就可能需要大面积切除肿瘤及邻近组织并彻底扫除淋巴结。虽然病理检验在癌症诊断上仍然是必要的,可是将组织做病理切片需要固定、染色、干燥等步骤,时间较长。比较而言,氧化还原成像扫描法可以更快速地得到初步诊断结果。

5 结论

抗氧化代谢 篇5

1材料与方法

1.1 材料

雄性昆明小鼠20只, 由吉林大学实验动物中心提供, 体重18±2 g, 合格证号:SCXK (吉) 2007-0003。Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒、超氧化物歧化酶 (SOD) 、丙二醛 (MDA) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。氧化乐果, 生产批号0710112, 购自上海化工有限公司, 纯度为95% 。

1.2 方法

将20只雄性小鼠随机分成2组, 每组10只。实验前禁食8 h。氧化乐果用生理盐水配成溶液, 按25 mg/kg体重腹腔注射染毒组小鼠;对照组给予等量生理盐水注射。染毒组均出现中毒症状:肢体震颤, 流涎, 竖毛, 呼吸急促等。30 min后断髓处死, 迅速取出心脏放入冰冷的生理盐水中漂洗, 除去血液, 用滤纸拭干, 称重。加生理盐水适量, 在冰水浴中制成10%匀浆。1 000 r/min低温离心5 min, 取上清液, 稀释至2%匀浆, 备用。所测各项指标按照试剂盒说明操作。用考马斯亮蓝比色法测定组织蛋白含量。

1.3 统计学分析

结果数据以undefined表示, 用SPSS11.0软件进行t检验。

2结果

小鼠在氧化乐果中毒30 min 后, 心肌组织中的Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均明显降低 (P<0.05) , 如表1 所示。

染毒组小鼠心肌组织SOD、GSH-Px含量明显低于对照组 (P<0.05) , 而MDA含量高于对照组 (P<0.05) , 如表2所示。

3讨论

近来, 细胞能量代谢障碍和内环境紊乱被认为是有机磷中毒非胆碱效应机制之一, 逐渐引起了人们的关注。国内曾晓苹[1]研究后认为, 对能量转换的抑制可能是有机磷杀虫剂作用机制的一个关键组分, 其在有机磷中毒的许多合并症, 如心肌损害、中间综合征和中枢神经系统抑制等的发生发展中起重要作用。有文献报道, 氟磷酸二异丙醋、对氧磷和对硫磷能引起心肌纤维和线粒体ATP酶活性抑制;敌敌畏能引起脑组织ATP酶活性降低;氧化乐果可降低骨骼肌组织的ATP酶活性[2,3]。本实验亦得出类似结论:氧化乐果中毒30 min后, 小鼠心肌组织Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均明显降低 (P<0.05) 。

心肌细胞ATP酶活性受抑制, 将引起严重后果。Na+-K+-ATP酶抑制后, 细胞外钠内流增加, 心肌细胞肿胀、钠水储留, 使线粒体功能受损, 高能磷酸化合物生成减少, 能量代谢障碍, 最终将影响心肌细胞收缩功能。细胞内钾外流增加, 造成细胞内缺钾, 细胞外高钾, 使心肌生物电不稳定, 容易诱发心律失常, 特别是尖端扭转性室速。另外, Mg2+-ATP 酶抑制后, 细胞内镁外流增加, 使细胞内缺镁, 细胞内外镁分布紊乱, 容易诱发室性心律失常, 特别是尖端扭转性室速。临床上己有有机磷中毒致尖端扭转性室速的报道[4]。

Na+-K+-ATP 酶是另一个调节细胞钙水平的ATP 酶, 其作用除了维持钾稳态水平、产生和维持动作电位、调节细胞容积外, 还可通过Na+-Ca2+交换调节细胞内的钙浓度。细胞内缺镁还能促进钙内流, 并加重细胞内钙超载所致损伤[5]。乙酰胆碱在突触前膜的释放也是通过Ca2+的浓度变化进行控制的, 由于组织ATP 酶的活性水平降低, 细胞内Ca2+的浓度增加, 可以导致乙酰胆碱释放增加。

ATP酶之间的生物活性是互相影响的, 而且对农药的胆碱效应和其他效应有一定影响。Ca2+-ATP酶抑制后, 细胞外钙内流增加, 引起细胞内钙超载, 自由基产生增多, 并进一步损害线粒体膜的功能, 也将影响细胞能量代谢。Mg2+是体内许多酶的激活剂, Mg2+-ATP 酶抑制后, 细胞内镁外流增加, 使细胞内缺镁, 进而造成细胞内多种酶抑制, 并引起自由基产生增多, 引发生物膜过氧化损伤[6]。SOD广泛存在于需氧代谢细胞中, 能够清除氧自由基, 保护细胞免受损害, 其活性变化与机体氧化损伤程度密切相关[7]。MDA是其代谢终产物之一, 其含量的变化可以反映组织中氧自由基含量及机体内环境的氧化应激程度[8]。本研究实验结果显示, 急性有机磷中毒可致小鼠SOD和GSH-Px降低, MDA升高, 表明急性有机磷中毒可引起心肌损害, 其机制可能与自由基引起心肌细胞脂质过氧化有关。

参考文献

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[2]宁宗, 邝晓聪, 李其斌, 等.敌敌畏急性中毒小鼠脑ATP酶的活性检测〔J〕.苏州大学学报 (医学版) , 2006, 26 (3) :604-607.

[3]李长喻, 赵敏, 杨柳, 等.急性有机磷农药中毒大鼠骨骼肌组织ATP酶活性的变化及硫酸镁对其影响〔J〕.中华急诊医学杂志, 2005, 14 (4) :672-675.

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[5]Astier C, Rock E, Gueux E, et al.Functional alterations in sarco-plas-micreticulummembranes of magnesium-deficient rat skel-etalas consequences of free radical mediated process〔J〕.FreeRadic Biol Med, 1996, 20 (5) :667-674.

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