牙胚细胞条件培养液

牙胚细胞条件培养液（精选四篇）

牙胚细胞条件培养液 篇1

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人脐静脉内皮细胞株ECV304和人血管平滑肌细胞株T/G(中科院细胞库)、rh-TNF-α(上海浩然生物技术有限公司)、MTT试剂盒(汉恒生物科技有限公司)、抗IL-6单抗:MQ2-6A3(BD Bioscience)I-CAM-1 ELISA试剂盒(上海沪尚生物科技有限公司)、IL-8、IL-6 ELISA试剂盒(上海华壹生物科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 脐静脉内皮细胞株的培养、分组

人脐静脉内皮细胞株ECV304以2.0×105个/m L的细胞密度接种于A、B两个培养瓶中,以含10%胎牛血清DMEM培养液培养,待细胞贴壁后,分别加入10ng/m L TNF-α(A瓶)或不加TNF-α(B瓶)。24 h后收集细胞培养液,离心并吸取上清液,取0.01 m L以ELISA法检测IL-6水平。剩余上清液以0.22 um的微孔滤膜过滤后4℃保存。A瓶收集液为A液,B瓶收集液为B液,含10%胎牛血清DMEM培养液为C液。

1.2.2 血管平滑肌细胞的培养、分组

人血管平滑肌细胞株以105个/m L的细胞密度接种于96孔板,待细胞贴壁后以无血清的DMEM高糖培养液静息过夜,如下各组:(1)刺激组:按1∶1比例加入A液和C液;(2)无刺激组:按1∶1比例加入B液和C液;(3)对照组:只加C液。每组做5个重复。

1.2.3 上清液IL-6、ICAM-1和IL-8水平测定

分组后立即采集细胞上清液以ELISA法测定IL-6、ICAM-1和IL-8水平,作为基线值。继续培养24 h后,再次采集上清液分别测定ICAM-1和IL-8水平,作为结束值。计算ICAM-1和IL-8基线值与结束值的差异。

1.2.4 MMT法测定细胞增殖水平

每孔加入10μL 5 g/L的MTT溶液,继续培养4 h,吸取上清液,加入DMSO 100μL/孔,待有色物质充分溶解后置入酶标仪,选择490 nm波长处进行比色,记录每孔吸光度。

1.3 统计学分析

所有数据用均数±标准差表示。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理,单因素方差分析做组间差异性比较。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 内皮细胞培养液中IL-6水平

TNF-α刺激血管内皮细胞培养液中IL-6含量为(122.70±6.30)pg/m L,而无TNF-α刺激的血管内皮细胞培养液中IL-6水平为(31.16±2.94)pg/m L,二者有显著性差异(t=22.807,P<0.05),提示TNF-α可以促进内皮细胞IL-6的分泌。

2.2 各组VSMC增殖情况

不同处理组初始IL-6水平和反映细胞增殖能力的MTT值见表1。与对照组相比,刺激组、无刺激组细胞增殖能力均明显升高,且刺激组高于无刺激组(P<0.05),提示内皮细胞,尤其是活化的内皮细胞能够释放活性物质促进血管平滑肌细胞的增殖。统计分析发现,细胞MTT值与细胞上清液中IL-6水平呈正相关(r=0.825,P<0.05)。

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与无刺激组比较,P<0.05

2.3 各组细胞上清液中细胞因子水平

0 h和24 h各组细胞上清液中ICAM-1和IL-8的含量及其变化见表2。培养前后同份细胞上清液中ICAM-1和IL-8含量的差值为增长值。刺激组细胞上清液中ICAM-1和IL-8含量增长值明显高于非刺激组和对照组(P<0.05)

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与无刺激组比较,P<0.05

3 讨论

肺血管重构是COPD相关性肺动脉高压的病理生理基础。在这一过程中,肺血管的多种组成细胞会发生一系列结构与功能变化,包括:内皮细胞凋亡、平滑肌细胞增殖和外膜成纤维细胞增生等[1]。以往认为缺氧作用于内皮细胞,引起其功能失调,ET-1增加,一氧化氮形成减少,继而促使平滑肌细胞增殖、外膜成纤维细胞增生,最终导致管腔狭窄,肺动脉压力升高[3]。但近年来研究发现在COPD早期,尚未发生缺氧时即存在血管的重构,因此进一步阐明COPD肺血管重构的机制,并早期干预对于改善COPD患者预后具有重要的意义[4]。

COPD是一种慢性气道炎症性疾病,炎症在肺气道重构中发挥重要作用,也可能影响血管重构的各个阶段。研究表明TNF-α受体缺陷小鼠无法形成肺动脉高压,因此TNF-α可以作用气道炎症与血管重构之间的重要桥梁[5]。作为COPD发病过程中最重要的细胞因子之一,TNF-α在COPD的形成中发挥重要作用[6]。本研究以TNF-α刺激体外培养的内皮细胞模拟COPD炎症反应对内皮细胞的影响,与HUANG等[7]研究一致,TNF-α处理后的内皮细胞组IL-6的水平明显高于未加TNF-α处理的内皮细胞组IL-6的水平。这一结果符合COPD患者体内改变,为之后试验奠定基础[8]。

近年来有关血管内皮细胞与血管平滑肌细胞的相互作用及其方式探讨较多,作为血管祖细胞二者在COPD的病理生理过程中发挥重要作用[9]。IL-6是具有广泛生物活性的细胞因子,在炎性反应和抗感染及损伤等过程中发挥多种生物学作用。近年来研究发现,在IPAH患者的血清中存在IL-6水平升高,且与IL-1、ICAM-l和VCAM-1等多种炎性标志物水平存在相关性[10]。而动物研究中,注射IL-6可导致大鼠出现肺动脉高压,应用地塞米松降低IL-6水平则能够预防野百合碱诱导的肺动脉高压形成,可见IL-6在肺动脉高压的形成中发挥重要作用[11]。但有关IL-6在COPD肺高压形成中作用的研究较少。CHAOUAT[12]等研究发现在存在肺高压的COPD患者血浆IL-6水平明显高于非肺高压的COPD患者,患者血浆IL-6水平与平均PAP水平呈正相关(r=0.39,P<0.001),4 h缺氧环境将导致肺动脉平滑肌细胞的IL-6 m RNA转录增加两倍。本研究发现平滑肌细胞增殖程度与培养液中的IL-6水平有关(r=0.825,P<0.05),而IL-6水平与TNF-α对内皮细胞的活化有关。因此,IL-6升高是炎症条件下,内皮细胞与平滑肌细胞相互作用的使者。

随着平滑肌细胞由静止状态的收缩表型向增殖状态的合成表型转化,其合成分泌的细胞外基质(胶原蛋白和弹力蛋白)增多,并可释放多种细胞因子和炎性因子发挥促炎作用。因此在COPD肺高压的形成过程中,血管平滑肌细胞也不单纯是一种结构细胞,并且具有多重活性,其异常分化、增殖和或凋亡、迁移在肺血管重建中发挥重要作用[13]。本研究发现内皮细胞培养液能够引起血管平滑肌细胞的增殖增加和ICAM-1、IL-8的分泌增多。ICAM-1和IL-8是平滑肌细胞分泌的两种细胞因子。ICAM-1作为细胞黏附分子,在组织结构维持、细胞运动游走、免疫调节、炎症反应、损伤修复等过程中发挥重要作用。在COPD中,ICAM-I表达上调,激活多条细胞内信号转导途径,促进单核细胞、淋巴细胞向内皮细胞的黏附和迁移,而IL-8可影响中性粒细胞的趋化性,促进中性粒细胞脱颗粒,二者共同加重炎症反应,并加速COPD肺血管重塑的进程[14,15]。

牙胚细胞条件培养液 篇2

目的:建立和优化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的.分离培养条件,以获得群体均一、未分化状态保持良好的MSCs.方法:收集不同周龄大鼠骨髓细胞;以不同浓度Percoll密度梯度离心分离骨髓单个核细胞;以60%低糖DMEM40%MCDB201为基础培养基,培养24h去悬浮细胞;以不同接种密度传代培养;碱性磷酸酶染色和油红O染色考察MSCs向骨和脂肪组织分化的潜能.结果:采用57%Percoll液的分离效果优于70%Percoll液.6周龄(体重约180g)大鼠能在细胞分离的质和量上达到最佳效果.24h进行悬浮细胞去除、5×103/cm2接种密度传代培养,光镜和电镜显示MSCs增殖能力强,功能状态活跃,成脂成骨实验显示多向分化潜能保持良好.结论:优化大鼠周龄、分离液的密度、细胞培养条件及改进培养方法有助于获得多向分化潜能保持良好的均一的MSCs.

作 者：晏丹 舒赛男 YAN Dan SHU Sai-nan 作者单位：晏丹,YAN Dan(武汉科技大学医学院病理教研室,湖北,武汉,430065)

舒赛男,SHU Sai-nan(华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,湖北,武汉,430030)

牙胚细胞条件培养液 篇3

该课题通过探讨淫羊藿苷在高糖培养环境下, 于2015年6月—2016年4月在黑龙江省医院实验室8只大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响, 为淫羊藿苷治疗糖尿病引起的骨病提供理论基础并开辟新的思路。

1 实验材料与方法

1.1 材料及设备

1.1.1 材料

取100 g左右3个月健康雄性SD大鼠 (黑龙江省医院动物饲养室提供) 8只, 颈椎脱臼处死。传三代培养, 获得颌骨骨髓基质细胞[4]。

1.1.2 试剂

Super M-MLV反转录酶 (20151221, 0.5mmol/L, 武汉) , 高纯总RNA快速提取试剂盒 (20151221, 0.5 mmol/L, 武汉) , RNase固相清除剂 (20152123, 0.01 mmol/L, 武汉) Powder琼脂糖 (20154211, 0.6 mmol/L, 武汉) 50×TAE2×Power Taq PCR Master Mix (201519876, 0.5 mmol/L, 武汉) 。

1.1.3 仪器

超速冷冻离心机 (湖南湘仪, K1000) , 微量移液器 (BIOHIT, s120) , 真空干燥箱 (SYSBERY, 100) , 紫外分光光度计 (Thermo, p900) , 荧光定量PCR仪 (BIONEER, TR232)

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

正常组 (2%胎牛血清+DMEM培养的细胞) , 高糖组 (2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞) , 淫羊藿苷组1 (2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) , 淫羊藿苷组2 (2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) 每组进行5个复孔平行实验。

1.2.2 总RNA提取

反转录得到c DNA。

1.2.3 实时荧光定量分析

反应体系如下。

用dd H2O补足至20μL

反应条件如下。

该实验利用韩国BIONEER公司生产的Exicycler TM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。

1.2.4 分析方法

RNA提取:按照实验方法中的步骤进行RNA提取, 并利用紫外分光光度计对提取的RNA浓度进行测定。RNA浓度见样本信息表。实时荧光定量分析如下。

(1) 分析方法:本实验分析方法利用2-△△CT方法。

(2) 结果:荧光定量分析仪得到的数据见附表 (本实验每种样本每个基因进行5个复孔平行实验, 实验数据的选取, 是舍去误差较大的数值, 取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据) 。利用2-△△CT方法分析数据见附表。

(3) 统计分析方法:选用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。采取的数值格式为 (Mean±SD) , 以正常组为参照组数值为1, 以上数据统计均经SPSS 13.0软件统计完成, 采取3次独立实验的单因素方差分析 (*表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001) 。

2 结果

2.1 荧光定量检测实验测定结果

BMP2荧光定量结果见图1, OPN荧光宣结果见图2, BSP荧光宣结果见图3。

荧光定量结果显示, 淫羊藿苷组1BMP2、OPN和BSP基因表达明显高于其它组, 淫羊藿苷组2基因表达高于高糖组和正常组, 说明, 淫羊藿苷增强高糖环境下颌骨BMCs的成骨能力。

3 讨论

糖尿病可引发骨代谢异常, 进而导致多种糖尿病骨病 (比如, 骨量下降、骨折率上升等) 。如上文所述, 口腔骨丢失会对患者产生两种重要影响, 其一为牙齿存留, 其二为义齿修复。此外, 糖尿病可引发牙槽骨丧失, 还会导致粘膜损伤, 所以患者往往都对修复治疗无法忍受[5]。当糖尿病患者人数逐渐上升, 而相关医疗水平也日益提升时, 糖尿病治疗亦日趋复杂化。近年来的相关研究表明, 糖尿病与牙周病二者之间存在一种双向调节关系。根据大量科学数据可知, 当人发生急性感染后, 其内分泌状态以及其代谢状态都会发生变化, 因此血糖控制很差, 所以牙周感染会对糖尿病患者造成影响, 使其无法很好地控制血糖[6]。有鉴于此, 糖尿病治疗应注重牙周病的防治, 否则可增加治疗难度。但在现实生活中, 口腔医生对于糖尿病所引发的口腔并发症往往是较为忽视的。此外, 对于糖尿病患者而言, 维护口腔健康是一件十分重要的事情, 假如牙科医生不能充分重视这一点, 那么口腔健康也无法得到保障[7]。不过, 对糖尿病患者口腔疾病的诊疗维护需要有足够的糖尿病知识作后盾, 而口腔科医生在这方面最为欠缺, 这些都是亟待解决的。

淫羊藿苷是中医治疗骨质疏松症最常用的药物之一, 大量临床治疗证明了该药物的效果。作为淫羊藿的精华部分, 淫羊藿苷在近年来被广泛的应用于成骨、破骨细胞的干预研究中[8]。现有的研究成果显示, 淫羊藿苷在临床应用过程中能够有效的促进成骨细胞的发育和增殖。淫羊藿是一种药用植物, 可归入小檗科淫羊藿属的范畴, 是我国医学常用的传统补益中药[9]。根据《本草纲目》可知, 这一味中药有多种功效, 比如祛湿补肾、强心益精、强筋健骨, 等等。在临床上, 这味中药常用于骨折治疗, 以及多种骨代谢相关疾病的治疗, 且具有很不错的疗效。通过相关研究结果可知, 这味中药具有诸多药理活性, 包括提高免疫力、抑制癌症细胞、调节内分泌、提高性腺功能、延缓机体衰老进程、以及对心血管系统产生有益影响等等。这味中药之所以具有如此重要的药用价值, 都归功于其有效活性成分, 也就是一种黄酮类化合物———淫羊藿苷。这种物质是一种结晶粉末, 外观呈淡黄色针状, 很难在水中溶解, 但却能在乙醇中溶解, 也能在乙酸乙酯中溶解[10]。

该实验研究表明, 高糖可以导致大鼠BMCs成骨相关基因表达下降 (包括BMP2, BSP, OPN) 由于成骨相关基因表达和ALP活性是成骨细胞早期分化标记, 细胞钙结节形成是成骨细胞晚期分化标记, 所有实验结果说明高糖抑制了BMCs向成骨细胞的早期和晚期分化, 当在高糖环境下加入淫羊藿苷后, 相关基因表达增强 (包括BMP2, BSP, OPN) , 与马晓妮等人对成骨细胞的分化研究结果一致[11]。

BMP2, OPN, BSP和Runx2作为成骨能力评定指标, 一般在BMCs向成骨细胞分化的过程中, 伴随着全部或者部分的表达升高[12]。通常的研究会选取以上的几个指标作为判定细胞成骨能力及是否向BMC分化的指标。该实验选取了以上这些成骨相关基因, 通过荧光定量的方法检测, 淫羊藿苷组1的BMP2, OPN, BSP和Runx2的表达均明显高于其它组, 淫羊藿苷组2基因表达高于高糖组和正常组, 说明, 淫羊藿苷能增强高糖环境下BMCs的成骨能力, 这与谢晓伟等人研究的干细胞的成骨分化结果一致[13]。

由以上可知, 淫羊藿苷增强高糖环境下颌骨BM Cs的成骨能力。但其具体通路机制还有待于进一步研究。

摘要：目的 探讨淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响。方法 选取2015年6月—2016年4月黑龙江省医院实验室的8只大鼠, 实验分组 (每个基因进行5个复孔平行实验) :正常组 (2%胎牛血清+DMEM培养的细胞) , 高糖组 (2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞) , 淫羊藿苷组1 (2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) , 淫羊藿苷组2 (2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) , 每组进行5个复孔平行实验。荧光定量测定成骨相关基因BMP2、OPN、BSP基因的表达。结果 淫羊藿苷组1 (1.78±0.10) 与其它组比较:BMP2 (1.37±0.04) 、OPN (1.38±0.09) 、BSP (1.50±0.05) 基因的表达均高于其相应的对照组 (P<0.05) 。结论淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力有加强作用。

牙胚细胞条件培养液 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

(1) 标本来源:实验经我院医学伦理委员会批准, 脐血由徐州医学院附属医院妇产科提供, 取自足月健康顺产新生儿, 已排除传染性疾病及其他肿瘤相关性疾病, 产妇和家属均同意。 (2) 试剂和器材:DMEM/F12培养基购自GIBCO公司;酶标仪购自Throma公司;胰酶购自Sigma公司;倒置显微镜购自Motic公司;PBS液购自北京中山金桥生物技术有限公司;CCK-8试剂盒购自上海前尘生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 h UCB-MSCs条件培养基的制备

在无菌条件下取人脐血20mL (肝素抗凝) , 小心转入15mL离心管中, 3500r/min离心20min, 取出上层血浆, 收集界面层白细胞, 用DMEM/F12培养基+10%脐血浆5mL, 以1×106/cm2的密度接种于5cm×5cm的培养瓶, 置于37℃、含体积分数为5%CO2的恒温培养箱中培养, 72h后换液, 弃去上清更换新鲜培养基。当发现有细胞集落生长、贴壁细胞融合80%后, 用0.25%胰酶消化传代, 根据细胞数情况确定传代瓶数, 为P1代细胞。贴壁细胞融合80%以后, 用0.25%胰酶消化传代, 扩增传代一次, 为P2代。以此类推。在P3代细胞融合80%时候, 吸去培养上清, 用PBS液洗2次, 放入37℃、CO2培养箱中, 24h后收集培养上清。

1.2.2 hUCB-MSCs生长曲线的测定

将P2代细胞用0.25%胰酶消化传代后接种到96孔板中的35个孔, 分为7组, 每孔细胞大约2000个, 置于37℃、含体积分数为5%CO2的恒温培养箱中, 24h后在第1组的5个孔中加入10μL CCK-8溶液, 4h后用酶标仪在492nm的波长下测定吸光度 (OD) 值, 并记录下, 取其平均值。以此类推, 连续测7d的OD值。以P3代细胞的培养时间为横坐标, 吸光度 (OD492) 值为纵坐标, 描绘细胞的生长曲线。

2 结果

2.1 原代培养和传代MSCs的形态学观察

人脐血间充质干细胞分离接种72h后观察细胞已经开始贴壁, 形态呈梭形、纺锤状, 有小集落生长, 1周后梭形细胞逐渐增多, 形成大的集落, 细胞排列有一定的方向性, 形态较为均一的成纤维样, 呈漩涡状排列 (图1) , 融合80%传代扩增, 1瓶扩3瓶, 4h细胞完全贴壁, 此时细胞生长较快。P1代可见细胞大多呈纤维样生长, 放射状, 不呈螺旋状, 纵横不一, 边缘不齐 (图2) 。P3代可见大量成纤维样细胞堆集, 生长旺盛, 细胞呈梭形、透明, 细胞成纤维样向外延伸, 伪足呈纤维束或螺旋状, 方向一致, 细胞边缘不整齐, 细胞增殖能力极强 (图3～4) 。

2.2 P3代细胞生长曲线的绘制

本实验中发现, 接种后的第1～2天细胞增殖不明显, 到第4天以后, 细胞呈对数增长期, 开始大量增殖, 5d达到高峰。细胞生长曲线见图5。

3 讨论

近年来, 随着干细胞的广泛应用, 人脐带血干细胞作为一种易获得的细胞逐渐受到各国研究者的重视, 同时他们进行了大量基础性研究发现, 脐带血不仅含有相当数量的造血干细胞, 而且还含有丰富的间充质干细胞, 人脐带血间充质干细胞作为一种中胚层发育的早期细胞, 具有自我复制和多向分化潜能, 在体外特定的诱导条件下, 可分化为多种组织细胞, 既往认为, MSCs主要作为种子细胞通过移植后分化成靶组织细胞或与靶细胞融合发挥治疗作用, 多家实验室研究证实干细胞植入缺血组织后并未分化为相应的靶组织细胞, 但却通过抗凋亡、抗炎、促进增殖和存活等效应明显改善缺血后心脏、肾脏、肝脏等器官功能, 从而提出一个问题:干细胞作为广泛存在于机体各种组织中具有分化潜能, 并产生多种生物活性因子的细胞体系, 是否通过其旁分泌功能发挥治疗作用?

随着研究的深入, MSCs的旁分泌作用逐渐引起研究者的注意。研究证实[3], MSCs能分泌包括血管内皮生长因子 (VEGF) 、胎盘生长因子 (PGF) 、成纤维细胞生长因子 (FGFs) 、血小板源生长因子 (PDGF) 、转化生长因子 (TGF-β) 、肝细胞生长因子 (HGF) 等在内的各种生长因子, 这些生长因子可参与多种细胞反应, 如VEGF、PGF、FGFs、TGF-β等参与血管生成与重塑调节。VEGF、HGF等具有抗血管内皮、心肌、肾小管和肝细胞凋亡的作用, VEGF还可以促进血管生成、神经元存活、神经发生, 对损伤脑组织有保护作用, 而HGF除抗凋亡外, 还能促有丝分裂并通过抑制TGF-β表达抗纤维化。

Sze等[4]采用多维蛋白质鉴定技术和细胞因子芯片检测了HuEE9.E1人ESCs分泌到培养液中的细胞因子, 其中包括白介素、肿瘤坏死因子、趋化因子等多种细胞因子, 参与血管生成、免疫调节、细胞凋亡等过程。Cabrera C等[5]研究表明, MSCs还能合成和分泌包括钠尿肽、降钙素基因相关肽、内皮素等在内的多种调节肽, 参与细胞存活与保护、心血管调节和组织修复。

研究表明, MSCs还可以分泌许多神经营养因子, 如脑源性神经营养因子、胶质源性神经营养因子、神经生长因子、表皮生长因子等, 这些因子可以参与中枢神经系统的神经再生, 促进损伤脑组织的生存与重塑, 有助于神经功能的恢复。因此关于这些神经营养因子的作用成为了目前研究的热点。胶质源性神经营养因子和脑源性神经营养因子是研究最多的两种神经营养因子, GoμLd等[6]研究表明, 胶质源性神经营养因子可以促进脊髓运动神经元存活及轴突生长。Grondin R等[7]研究发现, 胶质源性神经营养因子能够激活多巴胺能神经元, 改善运动迟缓、肌强直、姿势不稳等帕金森症状, 将来可很好的应用于帕金森病的治疗。脑源性神经营养因子可以在帕金森病、阿尔茨海默病、AIDS、痴呆等慢性神经变性疾病过程中起到保护神经元的作用[8]。Song[9]等研究显示在坐骨神经损伤时, 注射脑源性神经营养因子可以促进外周上行感觉神经元再生。

本实验通过建立一种人脐带血间充质干细胞条件培养基, 其中含有MSCs分泌的大量旁分泌物质, 并且可在体外大量制备, 无伦理及免疫排斥问题, 有可能替代细胞移植, 在心脏、肾脏和中枢神经系统疾病中发挥治疗作用, 但机制有待于进一步研究, 具有极大的临床应用前景。

摘要：目的 探讨人脐带血 (human umbilical cord blood, hUCB) 来源间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 条件培养基 (conditionedmedium, CM) 的制备方法, 并分析MSCs的旁分泌作用。方法 无菌条件下收集足月健康新生儿的脐带血, 经肝素抗凝, 离心后分离、培养、传代hUCB-MSCs, 用倒置显微镜观察不同时期细胞的生长情况和形态特征, 并用酶标仪检测细胞增殖情况, 待细胞融合达80%时更换培养基, 再继续培养24h后收集培养上清液即为人脐带血间充质干细胞条件培养基 (hUCB-MSCs-CM) 。结果 经过传代后, 人脐带血间充质干细胞形态趋于均一, 为梭形或成纤维样、体积较大、单个核, 呈漩涡样生长, 且增殖能力较强, 能较好的制备出其条件培养基。结论 能通过此方法成功制备人脐带血间充质干细胞条件培养基, 其中含有MSCs旁分泌的各种生物活性因子, 可以作为一种新的治疗来源应用于临床。

关键词：脐带血间充质干细胞,条件培养基,旁分泌,生物学特性

参考文献

[1]Zhou H, Chang S, Rao M, et al.Human cord blood applications incell therapy:looking back and look ahead[J].Expert Opin BiolTher, 2012, 12 (8) :1059-1066.

[2]Bruno S, Collino F, Tetta C, et al.Dissecting Paracrine Effectors forMesenchymal Stem Cells[J].Adv Biochem Eng Biotechnol, 2013, 129:137-152.

[3]Qiu P, Song W, Niu Z, et al.Platelet-derived growth factor promotesthe proliferation of human umbilical cord-derived mesenchymalstem cells[J].Cell Biochem Funct, 2013, 31 (2) :159-165..

[4]Sze SK, de Kleijn DP, Lai RC, et al.Elucidating the secretion prote-ome of human embryonic stem cell-derived mesenchymal stemcells[J].Mol Cell Proteomics, 2007, 6 (10) :1680-1689.

[5]Cabrera C, Carriquiry G, Pierinelli C, et al.The role of biologicallyactive peptides in tissue repair using umbilical cord mesenchymalstem cells[J].Ann N Y Acad Sci, 2012, 1270:93-97.

[6]GoμLd TW, Yonemura S, Oppenheim RW, et al.The neurotrophiceffects of glial cell line-derived neurotrophic factor on spinalmotoneurons are restricted to fusimotor subtypes[J].J Neurosci, 2008, 28 (9) :2134-2146.

[7]Grondin R, Gash DM.Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) :a drug candidate for the treatment of Parkinson's disease[J].J Neurol, 1998, 245 (11) :35-42.

[8]Mocchetti I, Brown M.Targeting neurotrophin receptors in thecentral nervous system[J].CNS Neurol Disord Drug Targets, 2008, 7 (1) :71-82.