灵芝液体深层发酵培养条件初探

灵芝液体深层发酵培养条件初探（精选10篇）

篇1：灵芝液体深层发酵培养条件初探

灵芝液体深层发酵培养条件初探

以菌丝体生物量为主要指标,研究了灵芝在液体深层发酵过程中培养基及培养条件对其菌丝体生长状况的影响.实验结果表明,适宜灵芝液体深层发酵的.培养基配方为:豆饼粉1.25%,蔗糖4%,KH_2PO_4 0.0107%,MgSO_4 0.0336%(C/N为:10/1);最佳发酵条件为:初始pH 4.0,接种量10%,在温度28℃,转速170 r/min的条件下,培养4 d,每100 mL培养液菌体收获量可达1.8370 g(湿重),含水率83%,折合干重0.3213 g.

作 者：万萍 汤凯惠 WAN Ping TANG Kaihui  作者单位：成都大学,生物产业学院,四川,成都,610106 刊 名：成都大学学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF CHENGDU UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)：2009 28(4) 分类号：Q939.9 关键词：灵芝   菌丝体   深层发酵   生物量  

篇2：灵芝液体深层发酵培养条件初探

采用正交试验及摇瓶培养法对黄伞菌丝深层液体发酵条件进行了优化研究.结果表明,适宜黄伞菌丝深层发酵的培养基组成为:葡萄糖2.0%,豆饼粉2.0%,K2HPO4 0.05%,MgSO4・7H2O0.1%,酵母膏0.2%;优化培养条件为:起始pH值6.0,培养温度25℃,摇瓶装量100ml,摇床转速150r/min,发酵周期6 d.

作 者：王谦 张俊刚 王士奎 刘会欣 刘玉霞 李志 卢婕 作者单位：王谦,刘会欣,刘玉霞,李志,卢婕(河北大学生命科学学院,河北,保定,071002)

张俊刚(河北大学生命科学学院,河北,保定,071002;河北省疾病预防控制中心,河北,保定,071000)

王士奎(农业部规划设计研究院,北京,100026)

篇3：灵芝液体深层发酵培养条件初探

关键词：猴头菌,深层发酵,摇瓶培养,优化

猴头菌 (Hericiumer erinaceus) 营养价值非常高, 味道鲜美, 被誉为“四大山珍”[1], 因其含有较多蛋白质和多种糖类, 对人体非常健康, 具有较好的抗癌和增强机体免疫功能作用[2,3,4]。通过深层发酵获得的菌丝体与人工栽培所获得的子实体在具体效用上相差很小, 通过这种方式, 可以缓解人们对该菌的需求, 但目前关于猴头菌深层发酵的相关研究开展较少, 有关的研究报道结论还不完全一致[5,6,7,8]。为了更好地开发利用猴头菌资源, 我们对猴头菌的菌丝培养开展了系统的研究, 希望能够对大规模制备其菌丝体及相关研究提供科学的、完整的依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1) 菌种:猴头菌 (Hericiumer erinaceus) 由辽宁省真菌研究所提供。

2) 培养基: (1) 马铃薯葡萄糖培养基:马铃薯200g、葡萄糖25g、琼脂20g、水1000m L (121℃灭菌20min) [9]。 (2) 液体种子培养基:酵母膏0.1%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、马铃薯20%、VB10.01%、p H6.5。 (3) 基础培养基:可溶性淀粉2.5%、酵母膏2.5%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、VB110mg/100m L、p H5.0[10]。

3) 主要仪器、设备:SHST-YM50Z型座式自动电热压力蒸汽灭菌器、HY-5型回旋振荡器、PYX-250S-A型生化培养箱、202-00A型电热恒温干燥箱、布氏漏斗和250m L三角瓶、电子天平、洁净工作台。

1.2 实验方法

1) 猴头菌的培养方法。 (1) 菌种活化:将事先购买的菌种无菌接种到斜面固体培养基上, 在25℃条件下, 培养至菌丝体覆盖斜面 (3d左右) 。 (2) 液体菌种培养:在无菌工作台内, 将斜面菌种接入到液体培养基, 放入25℃恒温摇床中, 摇床转速设定为180r/min, 培养24h待用。摇瓶的培养:按上述操作方法, 用250ml三角瓶进行摇瓶培养, 条件设定为培养基100ml, 接种量10%, 恒温摇床温度设定25℃, 转速180r/min, 摇床培养3d。

2) 猴头菌液体发酵条件的优化。采用单因素对照实验法, 分别确定好猴头菌液体发酵的最佳温度 (℃) 、p H、接种量 (ml) 、装液量 (ml) 、摇床转速 (r/min) 等参数[11], 具体实验设计 (如表1) 。

注:※表示该水平未设计实验 (使用lmol/L的HCl和lmol/L的Na OH对液体发酵培养基的p H进行调节) 。

2 结果与分析

确定发酵培养基后, 合适的培养环境能显著提高菌丝体产量, 研究发现, 猴头菌液体发酵的环境影响因子是多方面的, 本实验针对其中的几个主要影响因子温度、p H、装液量、接种量、摇床转速等开展了相关研究, 并在前期实验中总结前人相关研究基础, 对上述实验因子有关设计参数做了借鉴, 在此基础上确定猴头菌最适的液体深层发酵条件。

2.1 最佳培养温度的确定

由于微生物对温度敏感, 它直接影响微生物的生长和相关产物的形成, 是影响微生物生长速率的重要条件之一。适宜的发酵培养温度是保证本实验正常进行, 延续后续研究的基础, 本实验针对培养温度设定了21℃、23℃、25℃、27℃和29℃这5个梯度开展培养研究。

试验得出, 猴头菌在实验设定的温度范围内均能生长, 当温度设定较低时, 菌丝体生长速率慢, 产量较低, 随着温度的增加, 菌丝体产量呈依次上升趋势, 在25℃、27℃、29℃分别测得菌丝体产量为12.23 mg/m1、12.48mg/m1、12.57 mg/m1。胞外多糖产量在实验设定的温度条件下, 先升后降, 在25℃时得出率最高, 说明培养温度过低、过高会影响胞外多糖得率。通过综合考虑, 本实验认为猴头菌液体发酵的合适的培养温度为25℃。

2.2 起始最佳培养p H的确定

发酵液p H的高低直接影响菌丝体生长, 适宜的p H值有利于菌丝体快速生长繁殖, 获得高的产量。本实验针对发酵液起始p H设定了4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0这6个梯度开展培养研究。

试验得出, 发酵液起始p H=5.5时, 菌丝体的生长最快, 菌丝体产量为11.78mg/ml, 而发酵液起始p H=6.0时, 却更有利于胞外多糖的生成, 其得率为2.34mg/ml, 通过综合考虑, 本实验认为猴头菌液体发酵的起始p H为5.5。

2.3 最佳裝液量的确定

菌丝体在发酵生长繁殖过程中, 对氧气的需求比不可少, 装液量的多少直接影响氧的溶解, 装液量过大, 摇瓶中空气空间有限, 培养基中溶解的氧就少, 对菌丝的生长、增殖不利;而装液量过小, 在摇瓶培养中较难形成旋涡, 这对菌球的形成不利, 因此, 必须通过实验确定合适的装液量。本实验针对摇瓶装液量设定了60ml、80ml、100ml、120ml、140ml这5个梯度进行培养研究3。

试验得出, 摇瓶装液量的多少对菌丝体产量和胞外多糖得率的影响不一, 无明显的变化规律。在250ml的三角瓶中, 装液量为120ml时, 菌丝体产量最高, 为12.1mg/ml;但装液量为100ml时, 胞外多糖得率最高, 为2.54 mg/ml, 通过综合考虑, 本实验认为合适的装液量为100ml。

2.4 最佳接种量的确定

接种量的多少直接影响目标产物的产量、培养周期, 接种量大可以加快菌丝体的生长, 从而缩短培养期, 但会导致菌丝体生长过旺、营养物质消耗过快, 后期发酵后劲不足, 最终影响产物的合成。本实验针对接种量设定了5ml、7.5ml、10ml、12.5ml、15ml这5个梯度进行培养研究。

试验得出, 在1O0ml培养基中, 接种量为7.5ml时对菌丝生长量和都比较高, 菌丝体生物量为12.42mg/m1, 胞外多糖为2.35mg/m1, 当接种量为10ml时, 由于前期菌丝生长过于旺盛, 培养基营养成分消耗迅速, 不利于代谢产物多糖的生成, 胞外多糖得率下降, 随着接种量的进一步增加, 菌丝体产量和胞外多糖都呈下降趋势, 通过综合考虑, 本实验认为最佳接种量为7.5ml。

2.5 最佳摇床转速的确定

摇床转速的大小决定了氧气在发酵液中的传递效果, 转速较大时, 通气量大, 溶解氧增多, 菌丝体生长量增多, 菌球直径变小, 胞外多糖产生量增加。但转速过快会导致菌丝缠绕过密, 形成球、块状, 反而不利于菌丝生长。本实验针对摇床转速设定了100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min这6个梯度进行培养研究。

试验得出, 当转速为140r/nin、160r/min、180 r/min时, 菌丝体生物量比较接近, 但在转速为160r/min时, 菌丝体生物量最大, 为12.47mg/ml, 胞外多糖得率在140r/min时达到最大, 为2.45mg/ml。通过综合考虑, 本实验认为最终转速选择为140r/min。

3 讨论

在确定最优发酵培养基的基础上, 进行不同温度、起始p H、装液量、接种量、摇床转速的单因素试验, 通过液体摇瓶培养, 研究了各因素对菌丝体生物量和胞外多糖的影响。确定了猴头菌摇瓶培养的最优条件为:25℃、起始p H值5.5、摇瓶装液量100ml/250ml、接种量7.5ml、摇床转速14Or/min。

参考文献

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篇4：灵芝液体深层发酵培养条件初探

关键词：响应面；滤纸酶；纤维素酶；发酵条件；菌株

中图分类号： TQ920.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0368-03

收稿日期：2015-02-16

基金项目：国家星火计划（编号：2010GA105010）；石家庄市科学技术研究与发展计划（编号：08150142A）。

作者简介：藏金萍（1981—），男，辽宁抚顺人，硕士，实验师，主要从事分子与微生物学研究。E-mail：jpzang@163.com。

通信作者：姜军坡，硕士，讲师，主要从事农业微生物方向研究。Tel：（0312）7528273；E-mail：jjp_poe@126.com。纤维素是丰富的可再生资源和碳水化合物，可转化为糖类，并进一步转化成乙醇、菌体蛋白或气体燃料。农作物秸秆的主要成份是纤维素，而我国目前农作物秸秆的年产量可达10 t，其中一半以上被焚烧或废弃[1]。人口增加和耕地面积锐减之间的矛盾，使人畜爭粮问题日益突显。通过纤维素酶降解、利用纤维素资源已成为目前非常规资源研究的热点[2]，提高纤维素的转化效率，对解决当今世界面临的环境污染、饲料资源紧张和能源危机等具有重大的现实意义[3]。

纤维素酶是微生物分解纤维素时合成的一种胞外酶，其产量直接影响纤维素的利用率。在发酵过程中，通过一定的外部条件优化，可以提高产酶活力[4]。纤维素酶发酵条件优化常采用单因素和正交试验设计相结合的方法，但这种方法不能考察各因素之间的交互作用，无法实现各因素达到最优[5]。响应面分析法通过合理的试验设计，可使用最少的试验次数尽可能精确地估计各因素，对各因素水平及其交互作用进行评价和优化，快速有效地确定多因子的最佳条件[6-8]，是一个十分有效的优化试验方法。

解淀粉芽孢杆菌Tu-115菌株是一株胞外产纤维素酶，能有效抑制大肠杆菌，本研究组对其产纤维素酶的发酵条件已进行一些研究[9-10]，但菌株固体发酵生产机械化程度较低，缺乏在线传感仪器，过程控制较为困难，不利于大规模生产。本试验在前期单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken组合设计，考察影响Tu-115菌株深层液体发酵产纤维素酶的关键因素如葡萄糖含量、豆饼粉含量、接种量、装瓶量，旨在利用响应面法确定该菌株液态发酵产纤维素酶的最佳工艺参数，为其大规模液态发酵和应用奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌株Tu-115菌株，由河北农业大学生命科学院制药工程系提供。

1.1.2培养基及试剂Mandels无机盐营养液、DNS试剂，配制方法参考文献[9]；芽孢杆菌种子培养基和基础发酵培养基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Mandel′s无机盐营养液100 mL，自然pH值。

1.2试验方法

1.2.1Tu-115菌株产纤维素酶活性的测定

1.2.1.1酶活力测定原理采用3，5-二硝基水杨酸比色法[11]（DNS法）测定纤维素酶的酶活力。

1.2.1.2标准曲线的绘制精确称取无水葡萄糖分析纯100 mg，溶于蒸馏水中，定容至100 mL，即得浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准母液；取11支试管，分别加入不同体积的葡萄糖标准母液，用蒸馏水定容至50 mL，将母液稀释成不同浓度；分别吸取1.0 mL，分别加入3 mL DNS，沸水浴10 min；用流水冷却至室温，加入6.0 mL蒸馏水，混匀，测定吸光度，以葡萄糖浓度为x轴，吸光度为y轴绘制标准曲线。

1.2.1.3Tu-115发酵液纤维素酶比活力测定取发酵液 1 mL 加入EP管中，12 000 r/min离心5 min；试管中加入 0.5 mL 上清液，加入1 mL浓度为1 mol/L NaOH溶液，摇匀以终止反应；加入75 mg滤纸和1.5 mL浓度为0.05 mol/L、pH值为4.5的乙酸钠溶液，50 ℃反应30 min；加入3 mL DNS试剂，沸水浴10 min，冷却，所得溶液作为空白调零。

在另1支试管中加入75 mg滤纸、1.5 mL浓度为 0.05 mol/L、pH值为4.5的乙酸钠溶液和0.5 mL粗酶液，50 ℃ 反应30 min，加入1 mL浓度为1 mol/L NaOH溶液，摇匀以终止反应；加入3 mL DNS试剂，沸水浴10 min，冷却，测定吸光度。每1 min催化纤维素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.2.2Tu-115菌株种子液培养将菌种用5 mL无菌蒸馏水从1支斜面培养基上冲洗下来，接种于装有种子培养基的250 mL三角瓶中，装瓶量为100 mL；37 ℃ 200 r/min，摇床培养12 h，待用。

1.2.3响应面优化Tu-115菌株产纤维素酶条件采用Box-Benhnken组合设计，对影响菌株产纤维素酶的4个因素分别选取不同水平（表1），以进行响应面优化分析。

2结果与分析

2.1DNS法测定葡萄糖浓度的标准曲线

根据DNS法测定葡萄糖吸光度值，得回归方程为y=1.393 8 x（r2=0.996 6），其线性关系良好。绘制葡萄糖标准曲线见图1。

nlc202309030835

2.2响应面发酵试验与数据回归

采用Box-Benhnken组合设计，对影响菌株Tu-115产纤维素酶的4个关键因素进行29组试验，计算滤纸酶活力及其平均值（表2）。采用Design Expert 8.0.6软件，对响应面试验数据进行多元回归拟合，以滤纸酶活力为响应值（Y），葡萄糖含量、豆饼粉含量、接种量、装瓶量为自变量，建立回归方程为：Y=-47.096+15.537A+1.526B+1.529C+1.198D+0.258AB+0.297AC-5.208×10-3AD+0.364BC+1.347×10-2BD+0.0680CD-1.826A2-2.877B2-0.787C2-1.025×10-2D2（R2=0.740 2），方程拟合程度良好，试验误差较小。

2.3回归方程显著性检验

由表3可见，以滤纸酶为指标的产纤维素酶深层液体发表3以滤纸酶为指标的产纤维素酶深层液体发酵条件响应面模型和回归系数显著性检验

酵条件响应面模型P值为0.004 3，小于0.01，说明不同条件下差异具有极显著性，试验方法可行；失拟项不显著，这表明模型选择相对合适；A、B、A2、D2对滤纸酶活的影响显著，其他各因素交互作用均不显著，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系；由P值大小可知，各因素对结果的影响大小为：豆饼粉含量>葡萄糖含量>接种量>装瓶量。离散系数（CV）一般表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本试验CV值为0.004 3，在可接受范围内，所得二次回归方程可以很好地对响应值进行预测。

2.4响应面分析

利用Design Expert软件对数据进行二次多元回归，拟合得到二次回归方程的响应曲面及其等高线。由图2至图7可见，葡萄糖含量与豆饼粉含量相互作用較弱，沿豆饼粉含量方向的等高线密度大于沿葡萄糖含量方向的等高线密度，豆饼粉含量对酶活力的影响大于葡萄糖含量（图2）；葡萄糖的含量与接种量相互作用较强，沿葡萄糖含量方向的等高线密度大于沿接种量方向的等高线密度，葡萄糖含量对酶活力的影响大于接种量（图3）；葡萄糖的含量与装瓶量相互作用较强，沿葡萄糖含量方向的等高线密度大于沿装瓶量方向的等高线密度，葡萄糖含量对酶活力的影响大于装瓶量（图4）；接种量与豆饼粉的含量相互作用较强，沿豆饼粉含量方向的等高线密度大于沿接种量方向等高线的密度，豆饼粉含量对酶活力的影响大于接种量（图5）；豆饼粉含量与装瓶量相互作用较强，沿豆饼粉方向的等高线密度大于沿装瓶量方向的等高线密度，豆饼粉含量对酶活力的影响大于装瓶量（图6）；接种量与装瓶量的相互作用较强，沿装瓶量方向的等高线密度小于沿接种量方向的等高线密度，装瓶量对酶活力的影响小于接种量（图7）。

2.5Tu-115菌株产纤维素酶响应面结果的优化分析和条件验证

试验结果表明，回归方程对响应面法优化Tu-115菌株产纤维素酶深层液体发酵条件试验结果拟合良好，可用此回归方程对该菌株产纤维素酶深层液体发酵条件进行优化分析。采用Design Expert 8.0.6软件获取滤纸酶活力极大值，方法为：选取Optimization→Numerical→Criteria，选定指标“滤纸酶活力”；Goal设定为maximize→Solution，从Solution寻找最大响应值为12.23 U/mL，此时葡萄糖含量为4.44%、豆饼粉含量为0.67%、接种量为2.95%、装瓶量为67.61 mL。考虑试验的实际情况， 确定最优条件为葡萄糖含量为4.4%、豆饼粉含量为0.7%、接种量为3.0%、装瓶量为67.6 mL，此条件测定得该菌株相应的滤纸酶活力为（12.32±0.41）U/mL（n=6）。优化前采用基础发酵培养基培养该菌株对应的平均酶活力为（0.45±0.02）U/mL（n=6），优化后菌株产纤维素酶活力提高了27.4倍。

3结论

本试验采用DNS染色法，通过Box-Behnken试验设计及响应面分析，对以Tu-115菌株产纤维素酶的深层液体发酵条件进行优化，得到由影响产纤维素酶活力发酵的各因素变量构成的二次方程，该模型回归显著，对试验结果拟合良好。在此基础上，确定Tu-115菌株产纤维素酶的深层液体发酵最优工艺条件，为该菌株的大规模发酵和应用奠定了良好基础。采用响应面法能很好地预测产纤维素酶的深层液体发酵条件，方法简单易行，结果可靠，具有一定的实用和推广价值。

参考文献：

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篇5：纳豆激酶液体深层发酵技术的研究

本文研究了纳豆菌株ZN-4 (Bacillus natto)的液体深层发酵条件及其对纳豆激酶活力的影响,结果表明:纳豆菌株ZN-4液体深层发酵的最佳培养基配方为:葡萄糖2 %,大豆蛋白胨1 %,Na2HPO4 0.6 %,NaH2PO4 0.1 %,MgSO4 0.05 %,CaCl2 0.02 %;最佳培养基起始pH 7.0,接种量为3 %,最适发酵温度为35 ℃.在此条件下,摇瓶、50 L罐和500 L罐发酵酶活最高分别达到1903 U/mL、2210 U/mL和1934 U/mL.

作 者：梁淑娃 黄晓曼 夏枫耿 彭中健 谭颖嫦 LIANG Shu-wa HUANG Xiao-man XIA Feng-geng PENG Zhong-jian TAN Ying-chang 作者单位：梁淑娃,夏枫耿,彭中健,谭颖嫦,LIANG Shu-wa,XIA Feng-geng,PENG Zhong-jian,TAN Ying-chang(广州市微生物研究所,广东,广州,510250)

黄晓曼,HUANG Xiao-man(广州市医药工业研究所,广东,广州,510240)

篇6：灵芝液体深层发酵培养条件初探

1 仪器

瑞士梅特勒-托利多MS精密天平 (梅特勒-托利多中国公司) 、恒温培养箱 (金坛市高尔实验仪器厂) 、HY-4型调速多用振荡器 (苏州威尔实验用品有限公司) 、JULABOTW通用水浴槽 (优莱博技术 (北京) 有限公司) 、KQ2200E超声波清洗器 (上海昨非实验室设备有限公司) 、p H酸度计 (梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司) 、高压灭菌锅 (共创实业集团衡阳医疗器械有限公司) 、SHB- (III) 循环水式真空泵 (上海楚柏实验室设备有限公司) 、超净工作台 (苏州真田洁净设备有限公司) 、Kertone实验室超纯水机 (科尔顿 (中国) 有限公司) 等。

2 实验

2.1 碳源对菌丝体收率的影响

以KH2PO4、NH4Cl、牛肉膏、蛋白胨、Mg SO4·7H2O为基础培养基, 分别选用食用糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等5种为碳源, 接种后摇床培养, 摇瓶菌龄4天, 罐温为24~28℃, 风量为1:0.38~0.40, 接种量为8~12%, 搅拌速度:160~220rpm, 罐压0.06MPa, 发酵周期为80小时, 收集菌丝体, 烘干称重。

2.2 氮源对菌丝体收率的影响

基础培养基:KH2PO40.1%、NH4C10.2%、白糖1.5%、葡萄糖1.5%、Mg SO4·7H2O0.05%, 选用牛肉膏、花生粉、酵母膏、蛋白胨、黄豆粉、玉米蛋白、尿素8种为氮源, 花生粉、黄豆粉、玉米蛋白等经水解后, 取上清液, 接种后摇床培养, 摇瓶菌龄4天, 罐温为24~28℃, 风量为1:0.38~0.40, 接种量为8~12%, 搅拌速度:160~220rpm, 罐压0.06MPa, 发酵周期为80小时, 收集菌丝体, 烘干称重。

2.3 发酵培养基碳氮比试验

将酵母膏、蛋白胨、白糖、葡萄糖作为A、B、C、D四因素配制培养基, 接种后摇床培养, 摇瓶菌龄4天, 罐温为24~28℃, 风量为1:0.38~0.40, 接种量为8~12%, 搅拌速度:160~220rpm, 罐压0.06MPa, 发酵周期为80小时, 按四因素三水平正交试验, 收集菌丝体, 烘干称重。

2.4 无机盐对菌丝体收率的影响

以蛋白胨1%、白糖1%、酵母膏1%、葡萄糖2%为基础培养基, 将NH4Cl、Mg SO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4、KCl、VB1, 为A、B、C、D、E、F六因素, 接种后摇床培养, 摇瓶菌龄4天, 罐温为24~28℃, 风量为1:0.38~0.40, 接种量为8~12%, 搅拌速度:160~220rpm, 罐压0.06MPa, 发酵周期为80小时, 按六因素二水平正交试验, 收集菌丝体, 烘干称重。

2.5 发酵罐试验

基础培养基成分为:Mg SO4·7H2O0.06%、NH4Cl0.2%、VB110mg/100m L.摇瓶菌龄4天, 罐温为24~28℃, 风量为1:0.38~0.40, 接种量为8~12%, 搅拌速度:160~220rpm, 罐压0.06MPa, 发酵周期为80小时。

3 结果

3.1 碳源试验

结果表明, 采用食用糖干菌体收率为1.06 (g/100m L) , 葡萄糖干菌体收率为0.95 (g/100m L) , 蔗糖干菌体收率为0.75 (g/100m L) , 麦芽糖干菌体收率为0.52 (g/100m L) , 乳糖干菌体收率为0.26 (g/100m L) 。实验结果表明碳源利用能力依次为食用糖>葡萄糖>蔗糖>麦芽糖>乳糖, 所以采用白糖、葡萄糖作碳源, 干菌体收率最高。

3.2 氮源试验

结果表明, 蛋白胨干菌体收率为1.42 (g/100m L) , 酵母膏干菌体收率为1.31 (g/100m L) , 牛肉膏干菌体收率为1.12 (g/100m L) , 黄豆粉干菌体收率为1.08 (g/100m L) , 花生粉干菌体收率为0.83 (g/100m L) , 玉米蛋白干菌体收率为0.72 (g/100m L) , 尿素干菌体收率为0.12 (g/100m L) 。实验结果表明氮源能力依次为蛋白胨>酵母膏>牛肉膏>黄豆粉>花生粉>玉米蛋白>尿素。

3.3 发酵培养基C/N比结果

试验结果从极差分析看出, A因素 (酵母膏) 以三水平, B因素 (蛋白胨) 以三水平, C因素 (白糖) 以二水平, D因素 (葡萄糖) 以三水平组合为好。

3.4 无机盐试验

试验结果以极差分析可以看出, 以葡萄糖2%, 食用糖1%, 酵母膏1%, 蛋白胨1%, NH4Cl0.2%, Mg SO4·7H2O0.05%, KCl0.1%为最好。

3.5 100L罐发酵条件

试验结果表明, 发酵罐的碳源, 氮源以白糖, 蛋白胨的组合为最适宜, 干菌粉收率最高。

4 讨论

近年通过大量药理试验证明, 具有降压降脂作用, 临床用于心律失常, 尤其北冬虫夏草含有核苷酸类抗菌素 (3'-脱氧腺苷) , 能抗癌、抑菌, 增强免疫功能[1,2,3]北虫草可利用的主要碳源物质是葡萄糖、蔗糖、果胶等, 但以单糖利用效果为佳。氮元素是北虫草合成蛋白质和核酸物质的必要元素, 如蛋白胨、豆饼粉、酵母膏等均可, 以有机态氮的利用效果为好。北虫草菌丝生长最适温度为18~22°C;原基分化温度在10~25°C之间;子座生长温度为10~25°C, 最适20~23°C;孢子弹射温度为28~32°C;若非育种或分离以及特殊需要, 单纯栽培、以获得子实体为目的时, 不要超过28°C。北虫草适酸性环境, 菌丝生长阶段适应5~7的基质, 最适5.2~6.8之间, 人工栽培生产时, 基质p H可调到7~7.5, 经高压灭菌后, p H值自然下降, 加之后期菌丝的自然 (产生有机酸) 调节, 即可使基质p H降至6左右。人工栽培北冬虫夏草所用培养基一般以大米为碳源, 以蛋清为氮源, 液体深层发酵菌丝体试验结果表明, 以食用白糖为碳源, 以蛋白胨为氮源组合的培养基配方为最佳组合.培养基的C/N比值, 酵母膏、蛋白胨以三水平, 白糖以二水平, 葡萄糖以三水平组合为最佳。深层发酵周期一般以60~70小时为宜, 而固体栽培北冬虫夏草周期长, 一般从接种到采收需30~45天, 而, 时间过长易出现菌丝体自溶现象, 增加发酵液粘稠度, 增加采收菌丝体的难度, 影响收率。

参考文献

[2]Jagger, D.V., Kxedich, N.M., Guarina, A.J., Inhibition ofehrlich museaeascites tumor growth by cordycepin, Cancer Re-search, 1961, 21 (2) :216.[2]Jagger, D.V., Kxedich, N.M., Guarina, A.J., Inhibition ofehrlich museaeascites tumor growth by cordycepin, Cancer Re-search, 1961, 21 (2) :216.

篇7：蟹味菇液体发酵条件初探

关键词：蟹味菇；发酵条件；培养基

中图分类号：TQ920.6文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0206-02

收稿日期：2013-05-19

基金项目：2010年山东省农业良种化重点项目。

作者简介：王洪波（1977—），男，山东淄博人，硕士，副教授，研究方向为微生物发酵与调控。E-mail：gongzuoxuexi@126.com。蟹味菇（Hypsizygus marmoreus）属担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）玉蕈属（Hypsizygus），是一种大型木质腐生真菌，主要分布于日本、欧洲、北美和西伯利亚地区。蟹味菇为中低温和变温结实型菌类，营养丰富，包括8 种人体必需氨基酸，其中赖氨酸、精氨酸含量高于一般菇类，对于增智、增高起着重要作用，同时蟹味菇有防止便秘、抗癌、防癌，提高免疫力的独特功效。因此，蟹味菇作为一种低热量、低脂肪的食品，受到人们的青睐，在国内外市场上供不应求。

1材料和方法

1.1供试菌株

蟹味菇菌种由潍坊职业学院发酵实验室提供。

1.2培养基

（1）平板培养基：马铃薯20%，葡萄糖1%，红糖1%，酵母浸膏0.25%，牛肉膏3%，MgSO4 0.1%，KH2PO4 02%，维生素B1 10 mg/L，水 1 000 mL，pH值自然。（2）母种活化培养基（改良PDA培养基）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，MgSO4 0.5 g，KH2PO4 1.0 g，维生素母液2 mL，水 1 000 mL，pH自然。其中维生素母液配方为：盐酸硫胺素（维生素B1）0.05%，烟酸（维生素PP）0.25%，盐酸吡哆醇（维生素B6）005%，甘氨酸1%。 （3）碳源试验基础培养基为蛋白胨 20%，KH2PO4 01%，MgSO4 0.5%，維生素母液 2 mL/L，pH自然。（4）氮源试验基础培养基为葡萄糖2.0%，KH2PO4 01%，MgSO4 0.5%，维生素母液 2 mL/L，pH自然。

1.3方法

1.3.1母种活化将蟹味菇母种接入母种活化培养基斜面，25 ℃，培养8～10 d，每隔1 d观察菌丝生长状况，待菌丝长满斜面，选择菌丝生长健壮的斜面备用。

1.3.2最佳碳氮源筛选

1.3.2.1最佳碳源筛选[1]以碳源试验基础培养基为基础，分别将2%葡萄糖、绵白糖、玉米粉、淀粉、红糖、蔗糖加入到培养基，共设6个处理，每处理3次重复。培养瓶装料系数为40%（250 mL培养瓶装培养液100 mL），于25 ℃，140 r/min培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

1.3.2.2最佳氮源筛选以氮源试验基础培养基为基础，分别将2%牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、尿素、麸皮水、酵母膏加入到培养基，共设6个处理，每处理3次重复。培养瓶装料系数为40%（250 mL培养瓶装培养液100 mL），于25 ℃，140 r/min 培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

1.3.3培养基最佳配方筛选[2]对最佳碳氮源浓度及维生素母液浓度进行3因素3水平正交试验（表1）。培养瓶装料系数为40%，于25 ℃，140 r/min培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。共计9个处理，每个处理3次重复。

表1蟹味菇液体发酵条件L9（33）正交试验因素和水平

A：碳源浓度（%）1B：氮源浓度（%）1C：维生素母液（%）111.010.3211.510.4312.010.5

1.3.4培养温度筛选试验以最佳培养基配方为基础，培养瓶装料系数为40%（250 mL培养瓶装培养液100 mL），pH值自然。设20、25、30 ℃3个处理，每处理3次重复。 140 r/min 培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

1.3.5培养基初始pH值筛选试验[3]以最佳培养基配方为基础，培养瓶装料系数为40%，设pH值为4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5，7个处理，每处理3次重复。于25 ℃下，140 r/min 培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

1.3.6摇床转速筛选试验以最佳培养基配方为基础，培养瓶装料系数为40%，自然pH。设120 、140 、160 、180 r/min 4个处理，每处理3次重复。于25 ℃培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

1.3.7培养时间筛选试验以最佳培养基配方为基础，培养瓶装料系数为40%，自然pH值。设培养3、5、7 d，3个处理，每处理设3次重复。于25 ℃，140 r/min培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

1.3.8装料系数筛选试验以最佳培养基为基础，分别设培养瓶装料系数为20% 、40%、60% 3个处理，每处理3次重复。于25 ℃，140 r/min培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

nlc202309041843

1.3.9接种量筛选试验以最佳培养基为基础，分别设接种量0.5管、1管、1.5管、2管、2.5管、3管6個处理，每处理3次重复。培养瓶装料系数为40%，于25 ℃，140 r/min培养。每隔1 d镜检，振荡培养5 d，取整瓶发酵液并测菌丝干质量（105 ℃，烘干至恒质量）。

2结果与分析

2.1碳源对蟹味菇液体培养的影响

由表2可知，蟹味菇菌丝在添加2%玉米粉的碳源试验基础培养基中生长相对较好，菌丝量最大。其余碳源对蟹味菇菌丝生长影响大小依次为绵白糖>淀粉>红糖>葡萄糖>蔗糖。

表2碳源对蟹味菇液体培养的影响

碳源1菌丝干质量（mg/mL）葡萄糖13.4eE绵白糖15.5bB淀粉14.2cC玉米粉19.0aA红糖13.8dD蔗糖13.2fE

2.2氮源对蟹味菇液体培养的影响

蟹味菇菌丝在添加2%麸皮水的氮源试验基础培养基中生长相对较好，菌丝量最大，其次为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏。而尿素、硝酸铵作为氮源的效果较差（表3）。

表3氮源对蟹味菇液体培养的影响

氮源1菌丝干质量（mg/mL）牛肉膏14.0bB蛋白胨14.0bB尿素10.8dD硝酸铵10.7dD麸皮水15.3aA酵母膏13.3cC

2.3培养基配方优化

由表4可知，对蟹味菇菌丝生长影响大小的因素为玉米粉>麸皮水>维生素母液，即碳源浓度对蟹味菇菌丝生长的影响最大，其次为氮源浓度，维生素母液对蟹味菇菌丝生长的影响效果最小。根据正交试验结果，蟹味菇液体培养的最佳配方为3%玉米粉，1.5%麸皮水，0.3%维生素母液。

2.4培养温度对蟹味菇液体培养的影响

在25 ℃下，蟹味菇菌丝生长相对较好，其次分别为30 ℃，20 ℃（表5）。

2.5培养基初始pH值对蟹味菇液体培养的影响

由表6可知，蟹味菇菌丝在培养基初始pH值为5.5的酸性环境条件下生长最好，菌丝生长量最大，其次为培养基初

参考文献：

[1]杨荣玲，陈卫东，赵祥杰，等. 巴西虫草液体培养条件的优化[J]. 中国食用菌，2007，26（1）：50-54.

[2]张文隽，吴亚召，雷萍，等. 桦树桑黄液体发酵培养基优化研究[J]. 中国食用菌，2010，29（6）：24-25.

[3]江艳华，江晓路，王鹏，等. 白灵菇液体培养条件的研究及栽培试验[J]. 食用菌学报，2005，12（1）：37-41.孙勇，蒋继宏. 红缘拟层孔菌的培养条件[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：208-210.

篇8：黑芝菌丝体液体发酵条件研究

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:黑芝由黔南民族师范学院微生物实验室提供。供试培养基: (1) 改进PDA培养基。马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂18 g/L、酵母膏0.2%/L。 (2) 液体种子培养基。改进PDA培养基 (不加琼脂) 。 (3) 完全培养基。葡萄糖20 g/L、蛋白胨2 g/L、磷酸二氢钾0.46 g/L、磷酸氢二钾0.1 g/L、硫酸镁0.05 g/L、维生素B 10.003 mg/100 m L。

1.2 试验方法

1.2.1 液体种子的制备。

用250 m L三角瓶作培养容器, 装培养基100 m L, 将斜面种子在无菌条件挑取0.5 cm2大小于瓶中, 置25℃、150 r/min条件培养5 d左右则为液体种子。

1.2.2 生长曲线的测定 (培养时间的筛选) 。

用250 m L三角瓶作培养容器, 每瓶装入完全培养基100 m L, 共装30瓶, 常规高压灭菌后 (121℃、0.1 MPa, 20 min) , 冷却后无菌条件下接入5 m L黑芝液体种子, 置于恒温振荡培养器 (25℃, 150r/min条件) 发酵。接种当天测出5 m L液体种子所含的菌丝量, 以后每24 h取出3瓶测定p H值和菌丝干重, 并根据测定结果以培养时间为横坐标, 菌丝干重为纵坐标, 绘制生长曲线[4,5,6]。

1.2.3 黑芝菌丝体最适碳源筛选。

试验按完全培养基中的碳源量设计, 将葡萄糖分别换为甘露醇、D-山梨醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、面粉、马铃薯粉、马铃薯汁, 以无碳源为空白对照 (CK1) , 10个处理, 每个处理重复3次, 共计30个处理。用250 m L三角瓶作发酵容器, 每瓶分别装不同碳源培养基100 m L, 常规高温灭菌 (121℃、0.1 MPa) 冷却后, 无菌条件下接入5 m L液体种子, 置于恒温震荡培养器 (25℃温度, 150 r/min条件) 发酵144 h。

1.2.4 黑芝菌丝体最适氮源筛选。

试验按完全培养基中的氮源量设计, 将蛋白胨分别换为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾、尿素、油菜饼粉、酵母浸膏、甘氨酸, 以无氮源为空白对照 (CK2) , 10个处理, 每处理重复3次, 共计30个处理。用250 m L三角瓶作发酵容器, 每瓶分别装不同的氮源培养基100 m L, 常规高温灭菌冷却后, 无菌条件下接入5 m L液体种子, 置于恒温震荡培养器25℃温度, 150 r/min条件发酵144 h后, 取出分别测定p H值后过滤, 将菌丝置于60℃恒温箱烘至菌丝恒重, 用电子天平称干重。

1.2.5 黑芝菌丝体最适p H值筛选。

按完全培养基中的p H值设计, 用适量的1 mol/L Na OH和1 mol/L HCl将起始p H值分别配制为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的10个梯度值, 共10个处理, 每个处理重复3次, 共计30个处理。用250 m L三角瓶作发酵容器, 每瓶分别装不同起始p H值的培养基100 m L, 常规高温灭菌 (121℃、0.1 MPa) 冷却后, 无菌条件接入5 m L液体种子, 置于恒温震荡培养器25℃温度, 150 r/min条件发酵144 h后, 取出分别测定p H值后过滤, 将菌丝置于60℃恒温箱烘至菌丝恒重, 用电子天平称其干重。

1.2.6 菌丝体测量方法。

菌丝干重:将培养的菌液用的确良布过滤后, 并用无菌水冲洗菌丝无培养基, 将菌丝置60℃干燥箱干燥至恒重。

2 结果与分析

2.1 黑芝菌丝体生长曲线

黑芝菌丝体培养时间与菌丝干重的关系试验结果表明, 菌丝在前4 d的增长比较慢, 在第5天开始较快增长, 在第7天达到最大。接种后, 随着培养时间的增加菌丝干重增加, 当培养时间在第7天时, 菌丝干重达到最高为4.63 g/L。第7天后, 菌丝干重下降。统计分析结果表明, 差异不显著。因第7天菌丝干重最高, 第7天是适宜的培养时间 (图1) 。

2.2 黑芝菌丝体最适碳源筛选

试验结果表明, 供试的9种碳源黑芝都能利用, 菌丝干重都高于对照, 说明黑芝有较宽的碳源谱。能利用单糖、双糖和多糖, 但利用效果有所差异, 这也说明黑芝对糖的利用有选择性。

但是, 不同的碳源对黑芝菌丝体的生长影响不同。在供试的单糖中, 对甘露醇的利用最好, 菌丝干重达2.13 g/L, 对供试的其他2种单糖 (葡萄糖、D-山梨醇) 利用较差。在供试的双糖中, 对麦芽糖的利用最好, 菌丝干重达3.30 g/L, 供试的其他2种双糖 (蔗糖、乳糖) 利用较差。在供试的多糖中, 对面粉利用效果最好, 菌丝干重达5.97 g/L, 但对其他2种多糖 (马铃薯和马铃薯粉) 相对较差 (图2) 。统计分析结果表明, 面粉与其他供试碳源对黑芝发酵的菌丝干重差异极显著, 这可能是供试菌株对蛋白胨中的氮素对菌丝生长有促进作用。因此, 在工业化生产上, 可以选择面粉作为黑芝液体发酵的碳营养。

注:1为甘露醇, 2为葡萄糖, 3为D-山梨醇, 4为蔗糖, 5为麦芽糖, 6为乳糖, 7为面粉, 8为马铃薯粉, 9为马铃薯汁, CK1为空白对照。

2.3 黑芝菌丝体最适氮源筛选

试验结果表明, 供试的9种氮源黑芝都能利用, 除尿素外, 其他氮源的菌丝干重都高于对照, 说明黑芝有较宽的氮源谱, 能利用无机氮与有机氮, 但利用效果有所差异, 这也说明黑芝对氮源的利用有选择性。

但是, 不同的氮源对黑芝菌丝体的生长影响不同。在供试的无机氮中, 对硝酸铵的利用最好, 菌丝干重达3.03 g/L, 对供试的其他3种无机氮 (硫酸铵、氯化铵、硝酸钾) 利用较差。其供试的有机氮中, 对蛋白胨的利用最好, 菌丝干重达5.23 g/L, 但对供试的其他4种有机氮 (尿素、油菜饼粉、酵母浸膏、甘氨酸) 利用较差 (图3) 。统计分析结果表明, 蛋白胨与其他供试氮源对黑芝发酵的菌丝干重差异极显著, 这可能是供试菌株对多糖分解产生的中间代谢产物对菌丝生长有促进作用。因此, 在工业化生产上, 可以选择蛋白胨作为黑芝液体发酵的氮营养[7]。

注:1为硫酸铵, 2为氯化铵, 3为硝酸铵, 4为硝酸钾, 5为尿素, 6为油菜饼粉, 7为酵母浸膏, 8为甘氨酸, 9为蛋白胨, CK2为空白对照。

2.4 黑芝菌丝体最适p H值筛选

试验结果表明, 供试的10种p H值黑芝都能利用, 但这10种p H值的菌丝干重都低于对照, 说明黑芝有较窄的p H值谱, 能适应不同的p H值, 但利用效果有所差异, 这也说明黑芝对p H值的适应有选择性 (图4) 。

但是, 统计分析结果表明, 不同p H值测得的菌丝干重差异不显著, 即10种p H值对黑芝菌丝生长量差异不显著。故选择真菌一般生长的p H值5.5作为黑芝菌丝体的生长最适p H值。因此, 在工业化生产上, 可以选择p H值5.5作为黑芝液体发酵的最适起始p H值。

3结论

利用单因素试验的方法, 通过试验得出黑芝菌丝体液体培养最佳时期是第7天, 其菌丝体生物量平均产率为4.63 g/L;最适碳源是面粉, 其菌丝体生物量平均产率为5.97 g/L;最适氮源是蛋白胨, 其菌丝体生物量平均产率为5.23 g/L;最适p H值是5.5, 这为有效地开发利用黑芝提供了理论依据。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部, 2010版) [S].北京:中国医药科技出版社, 2010.

[2]佚名.神农本草经[M].哈尔滨:哈尔滨出版社, 1999.

[3]吴兴亮, 戴玉成.中国灵芝图鉴[M].北京:科学出版社, 2005.

[4]黄小琴.灵芝优良菌株筛选及多糖免疫活性与血芝液体发酵条件研究[D].雅安:四川农业大学, 2006.

[5]凌庆枝, 刘国庆, 袁怀波, 等.p H和无机盐对樟芝液体发酵的影响[J].食品科学, 2007 (11) :365-369.

[6]唐兴国, 周全, 赵丹, 等.不同碳源对黑芝菌丝体液体发酵的影响[J].食品与生物技术学报, 2012 (12) :1331-1337.

篇9：灵芝液体深层发酵培养条件初探

关键词：液体发酵；发酵条件；正交优化；蛋白酶活力

中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一种比大豆蛋白质更为优质、新型的大豆蛋白酶改性产品，广泛应用于发酵、制药、食品、化妆品、饲料及植物营养剂等行业^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供给机体能量，无蛋白变性，无豆腥味，液体黏性小和受热不凝固等，并具有降低血清胆固醇^[4]、降低血压、抗疲劳^[5]、抗氧化^[6]等许多生物功能，因此大豆肽成为研究热点。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物发酵法生产^[7]，微生物发酵法把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产有机结合在一起，降低了大豆肽功能的生产成本，克服了酶水解法制备大豆肽产品的苦味大和口感差等缺点^[8]。目前，利用微生物发酵法生产大豆肽被认为是较先进有效方法，应用前景较好。本试验以蛋白酶活力为指标，通过单因素和正交试验对产蛋白酶芽孢杆菌 B-15 发酵处理豆粕的产酶培养基组成、发酵工艺条件进行了优化，以确定最佳的豆粕发酵产酶工艺，为大豆肽的大规模液态发酵生产奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 细菌菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北农业大学生命科学学院制药工程实验室分离并保存。

1.1.2 培养基 NA培养基、NB培养基的配制详见文献[9]。种子培养基即NB培养基；基础发酵培养基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混匀后调pH值6.0～6.5。

1.1.3 试剂

福林-酚试剂；0.55 mol/L 碳酸钠溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸缓冲液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL标准酪氨酸溶液，所用试剂皆为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的培养与发酵

1.2.1.1 摇瓶种子曲线（生长曲线）及种子培养

将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，250 mL三角瓶中的装瓶量为75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振荡培养，在零时开始取样，以后每隔1 h或2 h取样1次，直至培养24 h为止，以未接菌的培养基作空白调零，用分光光度计在600 nm下测D，以发酵时间为x轴、以D为y轴作曲线，绘制生长曲线。将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，装瓶量为 75 mL，180 r/min摇床培养，培养时间由生长曲线确定，得到种子液。

1.2.1.2 发酵培养

对培养基成分采用以下的培养条件进行优化：将种子液以2%的接种量接入75 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中，于37 ℃、180 r/min下振荡培养48 h，将发酵液在5 000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，收集上清液，进行蛋白酶活力测定。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 不同碳源

分别以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7种碳源进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种碳源不同的发酵培养基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适碳源。

1.2.2.2 不同氮源浓度

配制豆粕浓度分别为2%、5%、8%、11%、14%的培养基发酵培养，进行B-15菌株产酶活力比较试验，均加入2%最适碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适氮源浓度。

1.2.2.3 不同无机盐

以浓度为0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7种供试无机盐进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种无机盐不同的发酵培养基，均加入2%最适碳源，最适氮源浓度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适2种无机盐。

1.2.3 正交试验

1.2.3.1 培养基组分

在培养基各组分初步筛选的基础上，研究培养基成分的不同配比对酶活力的影响。选用L16（44）设计方案设计4因素4水平正交试验（表1），根据上述试验确定的最适碳源、氮源、无机盐配制不同组成的培养基，测定发酵菌株产酶活力。综合正交試验结果，初步确定最佳组合，得出B-15菌株产酶的最佳培养基组成。

肽发酵培养基最佳组成，即葡萄糖为2%，豆粕浓度为12%，KCl为0.01%，MgSO4为0.05%。通过对其进行发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数，即发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下，B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比提高了11.9%，研究结果为进一步利用豆粕提供了理论依据。

参考文献：

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篇10：云芝菌丝体液体发酵条件优化研究

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。

供试菌株为云芝，由黔南民族师范学院微生物实验室提供。

1.1.2 培养基。

(1)改进PDA培养基。配方：马铃薯200 g/L葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、酵母膏2 g/L、p H自然。(2)液体种子培养基。改进PDA培养基（不加琼脂）。(3)完全培养基。配方：葡萄糖20 g/L、蛋白胨2 g/L、磷酸二氢钾0.46 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0.5/L、VB10.03 mg/L、p H自然。

1.1.3 器具。

高压灭菌锅、超净工作台、恒温箱、干燥箱、恒温振荡培养器、电子天平、p H计等。

1.2 试验方法

1.2.1 液体种子的制备。

用250 mL三角瓶作培养容器，装培养基100 mL，将斜面种子在无菌条件挑取0.5 cm2于瓶中，在25℃、150 r/min条件下培养5 d，作为液体种子。

1.2.2 云芝菌丝体生长曲线测定。

用250 mL三角瓶作发酵容器，每瓶装入完全培养基100 mL，常规灭菌（121℃、0.MPa）冷却后，无菌条件下接入云芝液体种子5 mL，置于恒温振荡培养器在温度25℃、150 r/min条件下发酵，接种当天测出5 mL液体种子所含的菌丝量，以后每24 h取出3瓶测定p H值和菌丝干重。

1.2.3 云芝菌丝体碳源筛选。

试验采用完全培养基，并将配方中的葡萄糖分别换为D果糖、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、乳糖、玉米粉、马铃薯粉、面粉，以无碳源为空白对照，10个处理，3次重复，共30个处理。用250 mL三角瓶作发酵容器每瓶分别装不同碳源培养基100 mL，常规高温灭菌（121℃、0.1 MPa）冷却后，无菌条件下接入液体种子5 mL，置于恒温振荡培养器，在温度25℃，150 r/min条件下发酵6 d后，取出分别测定p H值后过滤，将菌丝置60℃恒温箱烘至菌丝恒重，用电子天平称干重（在接种当天测出5 mL液体种子所含的菌丝量及p H值，以下试验同样操作）。

1.2.4 云芝菌丝体氮源筛选。

试验采用完全培养基，并将配方中的蛋白胨分别换为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素、油菜饼粉、酵母浸膏、甘氨酸，以无氮源为空白对照，9个处理，次重复，共27个处理。用250 m L三角瓶作发酵容器，每瓶分别装不同的氮源培养基100 mL，常规高温灭菌，冷却后，无菌条件下接入液体种子5 mL，置于恒温振荡培养器25℃150 r/min条件下发酵6 d后，取出分别测定p H值后过滤将菌丝置60℃恒温箱烘至菌丝恒重，用电子天平称干重。

1.2.5云芝菌丝体生长因子筛选。

试验采用完全培养基，将配方中的VB1分别换为VB12、VB2、VC、甘氨酸，以无生长因子为空白对照，6个处理，3次重复，共18个处理。用250 mL三角瓶作发酵容器，每瓶分别装不同生长因子的培养基100 mL常规高温灭菌，冷却后，无菌条件下接入5 mL液体种子，置于恒温振荡培养器，温度25℃、150 r/min条件下发酵6后，取出分别测定p H值后过滤，将菌丝置60℃恒温箱烘至菌丝恒重，用电子天平称干重。

1.2.6 云芝菌丝体pH值筛选。

试验按完全培养基中的pH值设计，用适量的1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将起始p H值分别配制成p H值3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的10个梯度，以p H自然为空白对照，11个处理，3次重复，共计33个处理。用250 mL三角瓶作发酵容器，每瓶分别装不同的起始p H值的培养基100 m L，常规高温灭菌，冷却后，无菌条件下接入液体种子5 mL，置于恒温振荡培养器，在温度25℃、15r/min条件下发酵6 d后，取出分别测定pH值，过滤，将菌丝置于60℃恒温箱烘至菌丝恒重，用电子天平称干重。

1.2.7 云芝菌丝体发酵条件优化试验。

采用L9(34）试验设计，具体处理见表2。根据单因子试验结果，确定因素及水平（表1）。用250 m L三角瓶作发酵容器，按正交设计的处理，分别装不同处理的培养基100 mL,4次重复。常规高温灭菌冷却后，无菌条件下接入液体种子5 mL，置于恒温振荡培养器，在温度25℃、150 r/min条件下分别发酵5、6、7 d，取出测定p H值后过滤，将菌丝置60℃恒温箱烘至菌丝恒重用电子天平称干重。

2 结果与分析

2.1 云芝菌丝体液体发酵时间确定

云芝菌丝体接种后，随着培养时间的增加菌丝干重增加，第6天时菌丝干重达到最高，为5.20 g/L。第6天后，菌丝干重下降（图1）。统计分析结果表明，第6天1～5 d菌丝干重差异极显著，与7～9 d培养时间下菌丝干重差异显著。因此，第6天是收获菌丝最适宜的培养时间。

2.2 不同碳源对云芝菌丝体干重的影响

试验结果表明（图2），供试的单糖、双糖和多糖等9种碳源云芝都能利用，所有供试碳源的菌丝干重都高于对照，说明云芝有较宽的碳源谱。但利用效果有差异，方差分析结果表明，各供试碳源对云芝菌丝体干重的影响较大，说明云芝菌丝对糖的利用有选择性。在供试的单糖中，对山梨醇的利用最好，菌丝干重达7.00 g/L，对供试的其他2种单糖（葡萄糖、D果糖）利用较差。供试的双糖中，对乳糖的利用最好，菌丝干重达7.03 g/L，供试的其他2种双糖（蔗糖、麦芽糖）利用较差。在供试的多糖中，对面粉利用效果最好，菌丝干重达6.83 g/L，但对其他2种多糖（玉米粉和马铃薯粉）相对较差。统计分析结果表明，虽然山梨醇、乳糖、面粉3种碳源对云芝菌丝体生长影响显著性相似，但因乳糖与蔗糖、土豆汁、空白的平均数的差均大于甘露醇、面粉与其三者的差，乳糖的影响显著性高于甘露醇和面粉。因此，在工业化生产上，可以选择乳糖作为云芝液体发酵的碳营养。

2.3 不同氮源对云芝菌丝体干重的影响

试验结果表明（图3），供试的有机氮和无机氮等9种氮源云芝都能利用，除油菜饼粉外，其他氮源的菌丝干重都高于对照，说明云芝有较宽的氮源谱。但利用效果有差异，方差分析结果表明，各供试氮源对云芝菌丝体干重的影响差异极显著，说明云芝菌丝对氮源的利用有选择性。在供试的有机氮中，对酵母浸膏的利用最好，菌丝干重达4.60 g/L，对供试的其他4种有机氮（蛋白胨、甘氨酸、尿素、油菜饼粉利用较差。在供试的无机氮中，对尿素的利用最好，菌丝干重达2.63 g/L，供试的其他3种无机氮（氯化铵、硫酸铵、硝酸铵）利用较差。统计分析结果表明，酵母浸膏与其他供试氮源对云芝发酵的菌丝干重差异极显著，因此在工业化生产上，可以选择酵母浸膏作为云芝液体发酵的氮营养。

2.4 不同生长因子对云芝菌丝体干重的影响

云芝菌丝体生长需要一定的生长因子，但对B族维生素有偏爱，供试的几种生长因子中VB12的菌丝干重最高（图4），方差分析结果表明差异显著。因此，在工业化生产上，可以选择VB12作为云芝液体发酵的生长因子。

2.5 不同p H值对云芝菌丝体干重的影响

云芝菌丝生长适应的p H值范围较广，在p H值3～12都能生长（图5），统计分析结果表明，不同p H值处理间差异不显著。在生产中给予弱酸条件，能满足其生长，符合大型真菌对p H值的要求规律。

2.6 云芝菌丝体液体发酵条件优化试验结果

从表2可以看出，处理5（培养6 d、2%乳糖、0.3%酵母浸膏、p H值4.5）的云芝菌丝干重最高，达3.950 g/L，是云芝菌丝体液体发酵的较优条件。

通过对R值的分析，酵母浸膏R值最大（1.608 g），说明影响云芝菌丝体生长的因素中，酵母浸膏这个因素比其他几个因素要重要。各因素对云芝菌丝体生长量的影响主次为酵母浸膏>乳糖>培养时间>pH值。

统计分析结果表明，各发酵条件对云芝菌丝体干重的影响差异极显著，处理5的供试发酵条件与其他供试的发酵条件对云芝菌丝干重差异极显著。因此，在工业化生产上，选择培养6 d、2%乳糖、0.3%酵母浸膏、p H值为4.5对云芝液体发酵条件进一步中试。

3 结论与讨论

江南大学的李渊等[2]在2013年对云芝菌丝体液体发酵的较优条件进行研究，得出葡萄糖、马铃薯粉为适宜碳源，蛋白胨、花生粉、黄豆粉为适宜氮源，该试验得出云芝菌丝体生长的最适碳源和最适氮源，分别为乳糖和酵母浸膏；该试验还对影响云芝菌丝体生长的生长因子进行了筛选，得出最适生长因子为VB12，云芝菌丝体液体发酵的较优条件为2%乳糖、0.3%酵母浸膏、p H值为4.5、培养天数为6 d[3,4,5,6]。

参考文献

[1]黄年来.中国大型真菌原色图鉴[M].北京:中国农业出版社,1998:60.

[2]李渊.云芝胞内糖肽液体发酵及提取工艺的优化[D].无锡:江南大学,2013.

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