高效液相色谱法测定霉酚酸含量及有关物质

2022-09-10

高效液相色谱法 (High performance liquid chromatography, HPLC) 又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”等, 是一种高压、高效、高灵敏度、应用范围广、分析速度快的分离分析技术。在中国药典中主要用于药物的含量测定、有关物质检查和鉴别等。天然药物的来源有动物、植物和矿物之分。由于化学成分复杂, 有效成分可能有一个, 也可以有多个, 因此精确测定各有效成分的含量对药品质量控制, 建立质量标准具有重要的意义。高效液相色谱法可对天然药物的成分进行分离鉴定, 并测定有效成分的含量。

霉酚酸 (mycophenolic acid, MPA) 是一种高效、选择性、非竞争性、可逆性的次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶抑制剂, 可抑制鸟嘌呤核苷酸的合成途径。MPA有关物质的检测方法作者未见国内报道。本文采用高效液相色谱法对MPA的含量及有关物质进行研究试验, 建立了霉酚酸的HPLC测定方法, 可同时测定含量、分离有关物质, 为原料质量控制建立标准。

1 仪器与实验药品

Waters600-717-2487型高效液相色谱仪。霉酚酸标准品 (纯度98%, Sigma公司) , 霉酚酸原料由本厂提供;乙腈, 甲醇为色谱纯;三乙胺, 磷酸为分析纯。

2 色谱条件

采用phenomenexC8色谱柱 (250mm×4.6μm×5μm) , 流动相:三乙胺磷酸缓冲液 (取超纯水980m L, 加入三乙胺20m L, 用磷酸调节p H至5.6, 搅拌至完全溶解) 乙腈 (60∶40) , 检测波长250nm, 流速:1.0mL/min。

3 方法与结果

用本色谱系统检测霉酚酸有关物质, 色谱图如下, 各杂质峰均能与霉酚酸主峰的达到良好的分离。试验表明, 本品在酸、碱、氧化、高温及光破坏均不稳定, 降解后的杂质峰也均能与霉酚酸主峰达到良好的分离。

(1) 精密度。选取适量的霉酚酸标准品进行精密测量, 用甲醇制成的供试液0.4mg/mL进行摇匀, 之后按照上述色谱条件连续进样6次, 计算霉酚酸峰面积值, RSD为0.2%。结果:精密度良好。

(2) 重复性实验。选择适量相同批号的霉酚酸样品并且称取相同的6份, 用甲醇制成的供试液0.4mg/mL进行摇匀, 按之前的步骤进行测定, 6份溶液及标准溶液分别进样10uL, 结果得到含量的RSD值为0.52%。

(3) 溶液稳定性实验。选取相同的霉酚酸供试液1份, 在0, 4, 8, 12h分别测定霉酚酸的峰面积值以考察试品的溶液稳定性, 其中RSD为0.96%。结果说明样品供试液在12min内基本稳定。

(4) 线性实验。称取霉酚酸适量, 用甲醇制成供试液8 0 0.48ug/mL, 分别取溶液6.0、5.5、5.0、4.5、3.5、2.5mL置于15mL的容器中, 并用甲醇溶液定容至刻度, 得到不同浓度的溶液分别为479.32、445.56、397.56、358.24、279.54、201.45μg/m L, 然后分别进样1 5 u L, 并记录下色谱图, 结果显示霉酚酸浓度在2 0 1.4 5~4 7 9.3 2μg/m L范围内呈现良好的线性关系。

(5) 回收率实验。称取霉酚酸适量并且以对照品溶液进样, 按峰面积计算样品回收率, 测得回收率平均值为98.69%。在统一的色谱条件下, 测得最低检测限为0.1ng (S/N≥3) 。通过上述方法检测不同批原料结果为02001含量为98.2%, 杂质为0.41%;02001含量为98.9%, 杂质为0.65%;02003含量为97.9%, 杂质为0.54%。

4 讨论

霉酚酸在C8柱上易产生前沿峰。不同品牌C8柱, 保留时间、峰形有较大的差异。考察各种配比的流动相, 25cm的长柱有利于达到较好的分离效果, 分离度>1.5, 分离效果好。本方法, 霉酚酸的出峰时间快, 峰形较好, 同时此方法灵敏, 准确, 重现性好, 适用于霉酚酸原料含量及有关物质的测定。

高效液相色谱法是现代药物分析中最高效、快捷的方法之一, 具有专属性强、灵敏度高等特点, 既可用于药物分离, 也可用于定性定量分型, 适用范围广因此在药物成分的分离与测定方面能够充分发挥其它分析方法无与伦比的优势。而且随着计算机软件的开发、专家系统的应用、检测手段的进步、各种联用技术的出现以及其他一些相关问题的解决, HPLC将称为今后质量规范化, 国际化的重要途径之一。

摘要：目的建立霉酚酸的HPLC法测定霉酚酸含量及有关物质检测方法。方法采用phenomenexC8色谱柱 (250mm×4.6μm×5μm) , 流动相:三乙胺磷酸缓冲液 (取纯水990mL, 加入三乙胺10mL, 用磷酸调节PH至5.4) 乙腈 (60∶40) , 检测波长250nm, 流速:1.0mL/min。结果霉酚酸浓度在200.17～480.41μg/mL范围内, 与峰面积呈良好的的线性关系 (r=0.9998) , 最低检测限为0.1ng。结论本法简便, 专属, 重现性好, 可用于测定霉酚酸含量及相关物质。

关键词：高效液相色谱法,霉酚酸,有关物质测定