重组大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)的制备及功能分析

硫氧还蛋白 (thioredoxin, Trx) 是普遍存在于原核和真核细胞中的低分子量蛋白质, 分子量约12 k Da, 其活性中心氨基酸序列 (-Cys-Gly-Pro-Cys-) 非常保守。凭借其活性中心的两个半胱氨酸 (Cys) 残基, 还原型Trx[Trx- (SH) 2]能还原靶蛋白质的二硫键 (protein-S2) 。广泛表达的硫氧还蛋白作为蛋白质二硫键的还原酶, 参与很多生理过程, 发挥重要生物学功能, 包括调节抗氧化作用、抗胁迫作用、细胞凋亡过程、调节转录因子DNA结合活性以及免疫应答等。Trx还和很多疾病相关, 如阿尔茨海默氏症、癌症等。

近年来由于食品过敏性疾病发病率迅速攀升, 许多过敏蛋白结构中都有大量的二硫键, 因此可以寻求一种安全有效的硫氧还原剂破坏蛋白质分子内部的二硫键, 降低食品过敏性已迫在眉睫。为此笔者通过制备大肠杆菌重组Trx, 对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析如下。

一、材料与方法

(一) 实验材料

1. 菌种与试剂

p MD19-T载体、p ET-28a (+) 载体、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、核酸内切酶Eco R I和Hind III、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、大肠杆菌菌株Top10、BL21宿主及载体、琼脂糖。

2. 引物设计

本实验采用的引物为:Trx。引物F:5’-CCGAAT-TCAGCGATAAAATTATTCACC-3’ (下划线为酶切位点Eco R I) 。

引物R:5’-CCAAGCTTTTACGCCAGGTTAGCG-3’ (下划线为酶切位点Hind III, 黑体为终止密码子) 。

(二) 实验方法

1. 大肠杆菌Trx基因的扩增

大肠杆菌基因组进行PCR, 反应条件为:94℃预变性5min, 94℃60s, 55℃60s, 72℃90s, 扩增30个循环, 72℃延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测、DNA凝胶回收试剂盒回收。

2. 重组质粒p MD19-T-Trx的构建

DNA连接反应:PCR产物经纯化后与p MD19-T载体连接。

转化:感受态细胞为E.coli Top10, 感受态细胞的制备。将10μl T克隆连接产物加入到200μl的感受态细胞中, 混匀, 冰浴30min;将离心管置于42℃热激90s;然后迅速取出, 冰浴2min;加入含800μl LB培养基的试管中混匀;37℃振荡培养1h, 转速190rpm/min。取菌液200μl涂布含氨苄青霉素 (终浓度为0.1mg/ml) 的LB固体平板, 于37℃倒置培养约12h。

3. 重组表达载体的构建、筛选及鉴定

采用TIANGEN公司的质粒提取试剂盒提取p MD19-Trx克隆质粒和表达载体p ET-28a (+) , 用Eco RI及Hind III分别对两种载体进行双酶切, 回收试剂盒回收酶切产物, 并用T4 DNAligest solution I对回收产物进行连接, 转化感受态细胞大肠杆菌TOP10, 提取质粒, 进行PCR和酶切鉴定;筛选阳性重组表达质粒Trx-p ET-28a (+) , 转化大肠杆菌BL21表达宿主。

4. 硫氧还蛋白二硫键还原酶活性检测

DTT是Trx的还原剂, 在DTT存在时Trx可以使胰岛素A, B链间的二硫键还原成游离的A, B两条链, 而B链的溶解度差, 可以使透明的反应液变混浊, 并在690nm处有强烈的光吸收。实验在100μl 30mmol/L磷酸钾缓冲液中进行。反应体系中含有:8μl 0.3mg/ml Trx, 7μl0.3 mg/ml NADP-硫氧还蛋白还原酶, 5μl 25mmol/l NA-DPH, 50μg牛奶。凝胶在12%三氯乙酸 (TCA) 溶液中固定4-6h, 之后在40%甲醇、10%醋酸漂洗8-10h, 荧光检测。

二、结果与分析

(一) 目的基因的获取及T克隆的构建

本实验扩增获得330bp的大肠杆菌Trx基因片段, 此片段经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后与p MD19-T载体连接, 构建重组克隆T克隆载体。

(二) 重组表达质粒Trx-p ET-28a (+) 的构建及转化

将构建成功的T克隆载体与表达载体p ET-28a (+) 经双酶切, 回收目的基因片段, 通过DNA连接酶连接构建重组表达质粒。重组表达质粒进行PCR和双酶切验证, PCR验证能够扩增出特异的目的条带, 双酶切也能切下目的条带, 确定重组表达质粒构建成功。

将构建功的重组质粒转化入大肠杆菌表达宿主BL21, 筛选阳性转化子。阳性转化子的菌落PCR、质粒PCR及双酶切验证结果。

(三) 重组蛋白的诱导表达及纯化

将重组质粒的表达产物进行SDS-PAGE分析结果。Trx蛋白主要以可溶的形式表达的。由于p ET28a表达载体N端和C端都带有His标签, 22个组氨酸分子量为3.4KDa, 所以表达的重组蛋白分子量为15.4KDa, 与图中蛋白带位置相符, 经过镍离柱亲和层析法纯化获得较纯的目的蛋白。

(四) 重组Eh V-99B1 Trx二硫键还原酶活性测定

存在DTT条件下Trx对胰岛素A, B链之间的二硫键有还原作用。检测硫氧还蛋白的二硫键还原酶活性:室温下在波长690nm处每隔1min测定1次反应混合液的OD值, 并绘制成如下图。结果表明重组Eh V-99B1 Trx具有二硫键还原酶活性。

(五) 重组Eh V-99B1 Trx对牛奶中二硫键蛋白过敏源的脱敏作用

m BBr可以与还原后的二硫键结合并发出荧光, 纯牛奶经过Trx体系处理后, 利用巯基特异荧光分子探针 (m BBr) 与巯基结合后在荧光下显色的原理, 鉴定二硫键被还原的程度。与阳性、阴性对照相比, 可以明显的观察到牛奶中β-乳球蛋白的二硫键被Trx系统还原而发出更强的荧光 (图6) , 证明该重组Trx具有还原二硫键的能力。

β-乳球蛋白占牛奶总蛋白的10%, 乳清蛋白的50%, Ig E介导的牛奶过敏中60%的病毒是对β-乳球蛋白过敏。β-乳球蛋白耐酸和蛋白酶水解, 消化后人体内还存在着完整的β-乳球蛋白及肽段, 引起人体过敏。特别是婴儿肠胃的通透性强, 可直接吸收β-乳球蛋白引起过敏反应。目前对降低β-乳球蛋白过敏性的研究中, 多采用高温、高压、水解酶处理等方法, 不仅影响牛奶的风味、外观, 同时对仪器设备的要求较高。Gregorio等就大肠杆菌Trx系统对牛奶中β-乳球蛋白的脱敏研究发现大肠杆菌Trx系统可以还原β-乳球蛋白中的二硫键, 经大肠杆菌Trx处理过的牛奶 (即还原β-乳球蛋白分子中的二硫键) 喂养实验动物, 皮肤测试和过敏反应实验显示实验动物的过敏反应明显减轻。Trx做为一种新型的硫氧还原剂, 反应条件温和, 适合于改善包括食品在内的生物材料, 特别是婴儿食品。Trx对食品的处理过程中不含有酸、碱、蛋白酶, 不经过高温、高压处理, 不改变食品的风味及营养成分。最近, 日本学者已成果研制出一种Trx转基因脱敏生菜并投放市场。Trx做为一种新型的硫氧还原剂, 反应条件温和, 适合于改善包括食品在内的生物材料, 特别是婴儿食品。

Trx对食品的处理过程中不含有酸、碱、蛋白酶, 不经过高温、高压处理, 不改变食品的风味及营养成分。

本论文成功在大肠杆菌中制备了重组的Trx且发现其具有二硫键还原酶活性, 为今后进一步深入研究Eh V99B1-Trx对二硫键蛋白过敏原的脱敏功能及应用提供科学依据。

摘要：Trx是一类广泛存在于各类生物中的小分子酸性蛋白质, 含有二硫化物活性中心Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC) , 可降低食物中由二硫键引起的变应原反应, 因而Trx在食品工程和抗过敏药物中具有应用前景。本论文从大肠杆菌Escherichi coli基因组中扩增Trx基因, 构建大肠杆菌重组表达载体Trx-p ET-28a (+) , 转化入大肠杆菌BL21表达宿主进行IPTG诱导表达并对牛奶中β-乳球蛋白和酪蛋白的二硫键还原活性进行分析。结果表明, 重组Trx具有二硫键还原酶的活性, 能有效打开牛奶中β-乳球蛋白和酪蛋白的二硫键, 有望开发成一种硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。

关键词：硫氧还蛋白 (Trx) ,基因克隆表达与纯化,二硫键还原功能分析

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