牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析（通用5篇）

篇1：牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

《中国科学院研究生院（海洋研究所）》 2008年

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牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

张玉青

【摘要】： 本文克隆了牙鲆的成肌因子MyoD和Myf5,以及牙鲆的Forkhead基因FoxD1、FoxD3和FoxD5,并对其在牙鲆肌肉发育中的功能进行了分析。牙鲆MyoD和Myf5基因都具有三个外显子,两个内含子。其编码的氨基酸序列都含有保守的bHLH;牙鲆FoxD1,FoxD3,FoxD5基因都只有一个外显子,编码的氨基酸序列都含有保守的翼状螺旋DNA结合结构域。在胚胎发育早期,Myf5在近轴中胚层中表达,体节发生过程中,Myf5在体节中表达,MyoD基因最早在分节板的体节前细胞中表达,随后在近轴细胞、体节中表达;随着胚胎的发育,Myf5在成熟体节中表达量降低,在新生体节中表达较强;MyoD自30个体节时期后只在新生的尾部体节中表达,在成熟的体节中表达量降低;在孵化期,MyoD和Myf5在头部及鳍的肌肉、尾部的体节中表达;生长期的牙鲆中,Myf5在骨骼肌和肠中表达,成体牙鲆中,Myf5只在肌肉中表达;生长期的牙鲆及成体牙鲆中,MyoD只在肌肉组织中表达。牙鲆MyoD和Myf5的启动子可以驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼肌肉纤维中表达,其包含了这两个基因正常表达所需的核心区域,并可以跨物种行使功能。在胚胎发育早期,FoxD3在未迁移神经嵴前体细胞、体节、耳后的基板、头部和躯干的神经嵴细胞、松果体中表达。牙鲆FoxD1主要在脑,体节,肾脏及肠中表达。牙鲆FoxD5主要在体节、尾芽、前脑、耳泡中表达。在斑马鱼中过量表达牙鲆FoxD3,并与斑马鱼的同源基因进行比较,结果表明注射牙鲆和斑马鱼FoxD3的斑马鱼胚胎表型一致,它们在中轴两侧的发育出现了不同步现象,MyoD和Myf5在近轴中胚层中的表达受到不同程度抑制。因此,FoxD3在不同物种之间保守,并且FoxD3在肌肉发育的调控通路中可能通过与MyoD和Myf5相互作用而行使功能。在斑马鱼中过量表达FoxD1后,MyoD在一侧体节中的表达受到了严重抑制,而在近轴细胞中的表达未受影响,Myf5在体节前中胚层,近轴细胞,及体节中的表达都受到了抑制。FoxD1在胚胎发育的早期可能通过调控MyoD和Myf5的表达而参与肌肉发育的调控。将牙鲆FoxD5在斑马鱼中过量表达,MyoD在一侧体节中的表达量有所升高,而在近轴细胞中的表达未受影响;Myf5在一侧体节和体节前中胚层中的表达也有所升高,表明牙鲆FoxD5可以调控肌肉调节因子MyoD和Myf5的表达而参与早期肌肉发育的调控。

【关键词】：牙鲆 Paralichthys olivaceus Myf5 MyoD FoxD1 FoxD3 FoxD5 RT-PCR 原位杂交 显微注射 过量表达

【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2008 【分类号】：Q78;S917.4 【目录】：

 摘要6-8                                       Abstract8-10 第一章 引言10-36 1.胚胎肌肉发育10-14 1.1 动物的肌肉发育10-12 1.2 鱼类的肌肉发育12-14 2.骨骼肌发育的特化信号14-20 2.1 Hedgehog 信号系统14-16 2.2 Wnt 信号系统16-17 2.3 TGF-β 信号17-18 2.4 成纤维细胞生长因子18-19 2.5 Pax 基因家族19-20 3.肌肉调节因子(MRFs)20-26 3.1 肌肉调节因子的结构与功能20-24 3.2 肌肉调节因子的调控24-26 4.FoxD 家族基因及其在胚胎发育中的作用26-34 4.1 Forkhead 家族基因概述26-30 4.2 FoxD 家族基因30-34 5.用显微注射方法在斑马鱼中进行基因功能研究34-35 6.研究意义35-36 第二章 牙鲆 MyoD 和 Myf5 的克隆、表达及功能分析36-74 1.材料与方法36-44 1.1 牙鲆和斑马鱼的培育与实验材料的获得36-37 1.2 实验试剂37 1.3 质粒与菌株37 1.4 仪器37 1.5 计算机程序37 1.6 引物37-38 1.7 实验方法38-44 2.牙鲆肌肉调节因子 MyoD 的克隆与功能分析44-57 2.1 牙鲆 MyoD 基因组,cDNA 的克隆及序列分析44-51 2.2 牙鲆 MyoD 在胚胎中的时空表达51-53 2.3 牙鲆 MyoD 在生长的牙鲆中的时空表达53-54 2.4 牙鲆 MyoD 在胚胎发育早期及成体中表达的半定量分析54-56 2.5 小结56-57 3.牙鲆肌肉调节因子 Myf5 的克隆与功能分析57-70 3.1 牙鲆 Myf5 基因的克隆与序列分析57-62 3.2 牙鲆 Myf5 启动子和第一个内含子的保守序列分析62-65 3.3 牙鲆 Myf5 在胚胎中的时空表达65-68                                 3.4 牙鲆 Myf5 在生长的牙鲆不同组织中的表达68 3.5 牙鲆 Myf5 在胚胎发育早期及成体中表达的半定量分析68-70 3.6 小结70 4.牙鲆 MyoD 和 Myf5 启动子驱动的绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎中的表达70-74 4.1 重组质粒 MyoDP-GFP,Myf5P-GFP 的构建71 4.2 牙鲆 MyoD 和 Myf5 启动子驱动的绿色荧光蛋白在肌肉中特异的表达71-73 4.3 小结73-74 第三章 牙鲆 FoxD3 的克隆、表达及功能分析74-94 1.材料与方法75-77 2.牙鲆 FoxD3 基因的克隆与序列分析77-83 3.牙鲆 FoxD3 在胚胎发育早期的表达83-85 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD3 对早期胚胎发育的影响85-89 5.讨论89-92 6.小结92-94 第四章 牙鲆 FoxD1 的克隆、表达及功能分析94-108 1.材料与方法94 2.牙鲆 FoxD1 基因的克隆与序列分析94-99 3.牙鲆 FoxD1 在胚胎中的时空表达99-102 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD1 对早期胚胎发育的影响102-104 5.讨论104-106 6.小结106-108 第五章 牙鲆 FoxD5 的克隆、表达及功能分析108-121 1.材料与方法108 2.牙鲆 FoxD5 基因的克隆与序列分析108-111 3.牙鲆 FoxD5 在胚胎中的时空表达111-116 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD5 对早期胚胎发育的影响116-117 5.讨论117-120 6.小结120-121 结论121-124 参考文献124-145 发表文章145-146 致谢146

篇2：牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

1 材料

1.1 试验动物和样品

矮小蛋鸡和藏鸡分别饲养在中国农业大学动物科技学院家禽遗传育种实验基地,取同周龄母鸡生产的受精鸡蛋进行同期入孵。矮小蛋鸡和藏鸡每组分别取9日龄、13日龄、20日龄的鸡胚胎各6枚进行腿部肌肉组织采集,组织取出后立即放入液氮中冷冻保存。

1.2 肌肉总RNA的提取和c DNA的合成

将颗粒大小的组织在研钵中进行液氮研磨后将粉末状的组织放入1 m L的TRIzol(Invitrogen公司生产)中进行裂解,随后采用总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司生产]进行总RNA的提取。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度和完整性,采用Nano Drop2000(Thermo公司生产)检测RNA的浓度和纯度;然后采用快速反转录c DNA试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司生产]合成c D-NA,将合成后的c DNA置于-20℃保存。

1.3 荧光定量PCR

以上述合成的c DNA为定量PCR模板,采用荧光定量PCR引物对腿部肌肉c DNA中的IGF-Ⅱ、IGFBP5和持家基因HPRT进行扩增,PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,确定荧光定量引物的特异性和扩增效果,同时检测c DNA的质量是否完整。鸡腿部肌肉的c DNA样品进行定量PCR检测基因的表达模式,每个样品设3个重复。PCR反应完成后以相同的阈值读取所有样品的Ct值,利用2-△△Ct方法计算每个样品的表达量。IGF-Ⅱ基因表达量进行单因素方差分析,并进行t检验,数据均以“平均数±标准误”表示。

1.4 IGF-Ⅱ基因编码区多态性检测

首先每组以10个个体的c DNA为模板采用IGF-ⅡSNPs引物(见表1)扩增IGF-Ⅱ的编码区,将扩增后的产物采用琼脂糖凝胶电泳检测后进行混池测序,采用chromas Pro v1.41软件分析序列检测是否有SNPs位点。将检测到的SNPs位点利用创造性酶切位点设计网站d Caps Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html),利用限制性内切酶多态性原则对筛选出的SNPs位点进行群体水平检测,以30只矮小蛋鸡和30只藏鸡的DNA为模板,采用创造酶切位点引物SNP-genotype(见表1)进行扩增后基因分型。

2 结果与分析

对腿部肌肉总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测(见图1),28S和18S条带明显且5S条带基本不可见,说明总RNA质量较好,无明显降解和DNA污染。Nano Drop2000检测总RNA,OD260/OD280均为2.0左右,无明显蛋白等污染。将得到的c DNA经IGF-Ⅱ、IGFBP5和HPRT引物进行PCR扩增后可见明显的长度为116 bp、198 bp、98 bp的单一条带,可见荧光定量引物扩增效果良好,特异性佳。同时也可以看出,c DNA质量较好,可用于后续基因表达模式的分析。

藏鸡和矮小蛋鸡IGF-Ⅱ基因在胚胎发育第9天、第13天、第20天腿部肌肉的mRNA表达水平见图2。

注:图中小写字母相同表示差异不显著(P>0.05),小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

由图2可知:在藏鸡和矮小蛋鸡中,第9天和第13天IGF-ⅡmRNA的表达水平均显著高于第20天(P<0.05);而第9天和第13天IGF-ⅡmRNA的表达水平在藏鸡和矮小蛋鸡间差异不显著(P>0.05),第20天藏鸡IGF-ⅡmRNA的表达水平低于矮小蛋鸡,差异不显著(P>0.05)。

藏鸡和矮小蛋鸡IGFBP5基因在胚胎发育第9天、第13天、第20天腿部肌肉的mRNA表达水平见图3。

注:图中含相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),小写字母完全不同表示差异显著(P<0.05)。

由图3可知:在藏鸡和矮小蛋鸡中,第9天IG-FBP5 mRNA的表达水平均显著高于第13天和第20天(P<0.05),矮小蛋鸡在第13天IGFBP5 mRNA的表达水平也显著高于第20天(P<0.05),而在藏鸡中第13天IGFBP5 mRNA的表达水平高于第20天且差异不显著(P>0.05);第13天藏鸡IGFBP5 mRNA的表达水平显著低于矮小蛋鸡,在第9天和第20天2个品种间差异不显著(P>0.05)。

采用IGF-Ⅱ-SNP引物以肌肉c DNA为模板扩增IGF-Ⅱ编码区序列见291页彩图4。扩增片段长度为1 182 bp,条带大小正确且清晰。将获得的PCR产物进行混池测序后发现,在IGF-Ⅱ编码区第345 bp处发现T-C SNPs,因此命名为c.345T>C。c.345T>C SNPs并未引起氨基酸突变,突变前后均编码组氨酸。

为了采用RFLP方法检测c.345T>C在藏鸡和矮小蛋鸡群体分布情况,研究利用创造性酶切位点的原则设计引物SNP-genotype扩增藏鸡和矮小蛋鸡基因组DNA(见图5),扩增片段长度为265 bp,条带大小正确。经SphⅠ限制性内切酶进行酶切,如该处碱基为T时可以被切开片段大小为232 bp;当该处碱基为C时则切不开片段大小为265 bp;当该处碱基为T/C杂合时则切成2条片段大小分别为265 bp、232 bp。在藏鸡群体中CC基因型为优势基因型,基因型频率为0.63;而矮小蛋鸡群体中TC基因型为优势基因型,基因型频率为0.67,并未发现CC基因型。藏鸡群体中C等位基因频率为0.78,T等位基因频率为0.22;矮小蛋鸡群体中T等位基因频率为0.67,C等位基因频率为0.33(见表2)。

3 讨论

IGF-Ⅱ是胰岛素生长因子家族之一,是一种蛋白质激素通过结合胰岛素生长因子受体发挥生物学作用。在IGF-Ⅱ结合胰岛素生长因子受体过程中,有一类蛋白IGFBPs(包括IGFBP5)调节IGF-Ⅱ与其受体的结合能力[4]。IGF-Ⅱ通过IGFBPs调节与胰岛素生长因子受体结合后发挥一系列的生物学过程包括细胞生长、分化、凋亡和迁移[10,11]。在哺乳动物中,IGF-Ⅱ基因可以上调肌肉细胞的生长和分化,且启动子区单核苷酸突变可以引起IGF-Ⅱ基因的表达水平显著下调[12]。研究中,在第9天和第13天IGF-Ⅱ基因mRNA的表达水平均显著高于第20天,说明腿部肌肉组织IGF-Ⅱ基因在胚胎孵化前期高表达。Gabriel等人研究表明,在胚胎发育过程中整个胚胎所有组织IGF-Ⅱ基因平均表达水平的第1个高峰是在孵化第2天和第5天,第2个表达高峰是在孵化第18天和第20天,同时认为IGF-Ⅱ基因在早期主要用于细胞有丝分裂调节细胞增殖重要通路[13]。有研究表明,第8天和第13天IGF-Ⅱ基因在胸部肌肉组织中的表达水平高于第18天[14]。而本研究的表达水平在9~13 d时间段高表达,同时第9天和第13天是腿部肌肉快速生长的阶段,而在后期腿部肌肉生长缓慢,与前面提到IGF-Ⅱ基因参与细胞增殖、分化、凋亡和迁移作用相吻合。

注:括号中的数据为具体数。

有研究表明,IGFBP5是IGFBPs家族中最保守的成员之一,已经被认为是肌肉细胞发育重要的调节因子[15]。IGFBP5可以高度结合IGF-Ⅱ且抑制IGF-Ⅱ结合胰岛素生长因子受体。在过表达IGFBP5基因的小鼠中可以抑制肌肉组织的生长和抑制体重增加。研究中,第9天IGFBP5基因在腿部肌肉组织的表达水平较高,然后随着发育时间逐渐降低。总体趋势与IGF-Ⅱ表达水平相对一致均在第20天表达量较低,说明IGFBP5可能参与IGF-Ⅱ基因功能。

在鸡IGF-Ⅱ基因第2外显子中的单核苷酸突变与生长和屠体性状显著相关[16]。李志辉等[17]研究表明,北京油鸡等5个鸡品种中第2外显子的单核苷酸突变基因型分布差异极显著,且与腹脂重和腹脂率性状显著相关。研究中,检测到在编码区第345位碱基处检测到T-C单核苷酸突变c.345T>C SNPs。c.345T>C SNPs在藏鸡群体中以CC基因型为优势基因型,在矮小蛋鸡中以TC基因型为优势基因型且未检测到CC基因型,说明c.345T>C SNPs可能与肌肉生长或腹脂性状相关。

篇3：牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

关键词：九龙牦牛；葡萄糖转运蛋白；单羧酸转运蛋白；肌肉；低氧适应；基因表达

中图分类号：S823.8+52 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0029-03

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有的牛种，对高寒、低氧等恶劣生态环境有良好的适应性。低氧环境能导致细胞多种能量代谢通路的适应性变化，例如无氧酵解增加，单位葡萄糖产生的能量减少，进而导致细胞膜葡萄糖转运蛋白（GLUT）适应性增加。肌肉组织中最重要的GLUT家族成员包括GLUT1和GLUT4，其中GLUT4是肌肉和脂肪细胞中的主要葡萄糖转运蛋白^[1]，存在于细胞内，受胰岛素、运动和缺氧等因素影响^[2-3]。肌肉是产生乳酸的主要组织，氧化型肌纤维（红肌）和心肌能以乳酸为燃料分子为机体提供能量^[4]。在乳酸转运进入细胞的过程中，单羧酸转运蛋白（MCT）发挥重要作用。MCT有多个家族成员，其中，在肌肉中表达的主要有MCT1、MCT2和MCT4，在乳酸转运中发挥功能^[5-6]。MCT1在氧化型纤维中表达水平高，被认为在乳酸向细胞内转运中发挥重要的作用^[5]。Jurie等研究表明，低氧适应能使肌肉组织在能量代谢方面更依赖于葡萄糖^[7]。因此，分析GLUT、MCT基因序列及其组织表达规律，对认识动物低氧适应的分子机制是重要的切入点。目前，关于暂时性缺氧对GLUT、MCT基因表达影响的研究已有不少，但对于低氧驯化的牦牛组织中GLUT、MCT还未见报道。因此，试验假设长期的低氧适应可能导致牦牛GLUT、MCT基因序列或组织表达水平发生改变，重点分析九龙牦牛GLUT4、MCT1和MCT4的基因序列及其在肌肉中的表达特点，并与普通牛比较，以探索牦牛适应低氧环境的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

试验所用九龙牦牛（Bos grunniens）样品采自四川省甘孜州九龙县，其中，0.5岁犊牛6头，3.5～5.5岁牦牛10头，7～10岁牦牛8头。屠宰时，迅速采集背最长肌和股四头肌，用锡箔纸包好，置于液氮内带回实验室，-80 ℃保存备用。另外，从四川省青白江市某屠宰场采集6头成年黄牛背最长肌和股四头肌样本作为对照。

1.2 试剂及器材

主要仪器包括高速冷冻离心机（日立）、超声波破碎仪（Sonics）、分光光度计（Cary 50，Varian）、电动匀浆器（PT-1200E，Kinematica）、凝胶成像系统（Gel Doc 2000，Bio-Rad）。荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex TaqTM（2×）购自TaKaRa公司；反转录试剂盒购自MBI公司；2×LongTaq Mix、Trizol试剂均购自天根公司。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆测序

取RNA 8 μL，用Random hexamer引物按Fermentas反转录试剂盒说明书进行反转录。根据GenBank中普通牛GLUT4、MCT1和MCT4基因mRNA序列（序列号依次为AY458600、BC104598和NM_001109980），用Primer premier 5.0软件设计引物。GLUT4-F：5′-CTAAGACAAGATGCCGTCG-3′，GLUT4-R：5′-TCAGTCATGCTCATCTGG C-3′；MCT1-F：5′-CGAGCCGCGTATAACGAT-3′；MCT1-R：5′-CCACAGGTTCAAACTGGACTCT-3′，MCT4-F：5′-CTTGGAACAGCCTCTGTCA-3′，MCT4-R：5′-GAGCGTTGACGGTCTCTG-3′。预期片段长度：GLUT4为1 540 bp，MCT1为 1 574 bp，MCT4为1 483 bp。PCR反应体系：2×Long Taq Mix 12.5 μL，灭菌水 8.5 μL，正、反引物各1 μL，cDNA 2 μL。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃（GLUT4）/55 ℃（MCT1）/56 ℃（MCT4）1 min，72 ℃ 2 min，共40個循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经胶回收试剂盒纯化，按常规基因克隆技术进行克隆，每个基因的阳性克隆取3～5个菌液送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序。

1.4 定量PCR分析牦牛肌肉中GLUT4、MCT1和MCT4 mRNA 水平

根据获得的九龙牦牛3个基因的cDNA序列，用Primer Premier 5.0软件跨内含子设计引物。GLUT4-F1：5′-TGGGGACACTCAATCAACT-3′；GLUT4-R1：5′-TCAGCCAACACCTCAGACA-3′，MCT1-F1：5′-AAACGCTGATGGACCTTG-3′；MCT1-R2：5′-TATGCCACATGCCCAGTA-3′；MCT4-F1：5′-GTCCACTGCCAGCAACTAC-3′，MCT4-R1：5′-AGCACCAGCACAAGGGA-3′。内参基因的引物根据GenBank中普通牛GAPDH序列（NM_001034034）设计，GAPDH-F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，GAPDH-R：5′-TCATAAGTCCCTCCACGAT-3′。根据荧光定量PCR试剂盒说明配制20 μL的反应体系，其中，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃（GLUT4、GAPDH）/62 ℃（MCT1、MCT4）10 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。采用目的基因、内参基因的质粒作为标准品，制作标准曲线，目的基因的表达水平用内参基因校正。

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1.5 肌肉组织LDH总活力及其同工酶谱分析

准确称取0.2 g肌肉组织，加匀浆液（含10 mmol/L Tris、pH值为8.0，0.25 mol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA）2.8 mL，用电动匀浆器在冰上匀浆30 s，取1 mL以转速10 000 g于4 ℃离心10 min，参照Marchat等方法^[8]测定上清液LDH活力。酶活力的定义为：在25 ℃条件下，1 g新鲜组织1 min催化 1 μmol 底物转化为1个单位。LDH同工酶采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，酶活性染色^[9]。

2 结果与分析

2.1 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆测序

采用RT-PCR方法扩增九龙牦牛背最长肌的GLUT4、MCT1和MCT4基因，均得到1条特异的扩增条带，并分别均与预期分子量大小相符（图略）。测序结果证实得到了GLUT4、MCT1和MCT4等3个基因的编码序列（CDS序列），并提交GenBank。

由表1可见，牦牛GLUT4基因（HM055486）CDS全长 1 530 bp，编码509个氨基酸，与普通牛相比有5个碱基差异和1个氨基酸差异，牦牛第293位为Val（缬氨酸），而普通牛为Met（甲硫氨酸），核苷酸和氨基酸相似性分别为99.67%和99.8%；牦牛MCT1基因（HM061149）CDS全长1 506 bp，编码501个氨基酸，与普通牛相比有6个碱基差异和2个氨基酸差异，牦牛第325位、354位分别为Iso（异亮氨酸）、Val（缬氨酸），而普通牛分别为Val、Iso，核苷酸和氨基酸相似性均为99.6%；牦牛MCT4基因（HM583655）CDS全长 1 386 bp，编码460个氨基酸，与普通牛相比有6个碱基差异，核苷酸相似性为99.56%，但氨基酸序列完全相同。牦牛3个基因与普通牛的碱基差异类型主要是转换。

2.2 牦牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因的发育谱

3个目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR标准曲线扩增效率为94.5%～102.9%，符合分析要求。在牦牛背最长肌和股四头肌中，GLUT4、MCT1、MCT4 mRNA水平在各年龄段（0.5、3.5～5.5、7～10岁）均无显著差异。

2.3 牦牛与黄牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因表达比较

实时荧光定量PCR分析显示，成年九龙牦牛（n=10）与黄牛（n=8）背最长肌中，GLUT4、MCT4 mRNA水平无差别，MCT1 mRNA水平黄牛显著高于牦牛（P<0.05，图1）；而在股四头肌中，GLUT4、MCT1、MCT4的mRNA水平均未见显著差异。

2.4 肌肉組织LDH活力和酶谱

试验结果表明，牦牛背最长肌中LDH总活力显著高于黄牛[牦牛（510±30） U/mg，黄牛（407±35） U/mg]，而腿肌中LDH总活力接近[牦牛（305±31） U/mg，黄牛（282±47） U/mg]。由图2可见，牦牛背最长肌中LDH5的比例显著高于黄牛，而LDH2比例极显著低于黄牛。股四头肌中LDH同工酶比例无显著差异。

3 结论与讨论

酸序列及推导的氨基酸序列与普通牛相似性很高，均在99.5%以上，与其他很多功能基因研究结果^[10-11]一致，这也说明牦牛与普通牛的亲缘关系很近。牦牛和普通牛存在氨基酸差异的有2个基因GlUT4和MCT1，存在差异的氨基酸性质相似（Val、Iso、Met），推测这些氨基酸的变化对相应载体蛋白功能影响很小，GlUT4、MCT1和MCT4基因序列具有保守性。

年龄增长的变化趋势，发现在骨骼肌中MCT1和MCT4 mRNA水平随年龄增加而发生不同程度的改变^[12]；Kirat等研究发现MCT1在成年牛肝脏的表达量极显著高于犊牛^[13]。本试验结果与Hatta等研究结论存在差异，原因尚不清楚。

有关低氧刺激对GLUT、MCT基因表达影响的研究已有很多报道。Wood等研究发现，低氧能提高人的脂肪细胞GLUT1水平，但不会改变GLUT4水平^[14]。Ullah等研究了体外培养的细胞（HeLa、COS、HL-1）中MCT1、 MCT2、MCT4对缺氧刺激的反应，结果表明，MCT4 mRNA和蛋白质表达水平均增加，MCT1和MCT2水平未见变化^[15]。本研究中由于牦牛对低氧的长期驯化，相关能量代谢机制可能与暂时性缺氧有所不同。

MCT1在氧化型纤维中表达水平高，帮助乳酸向细胞内转运，参与乳酸的氧化利用^[5]。McCullagh等研究了MCT1的表达，证实MCT1在红肌的表达与肌肉中乳酸吸收相关，与柠檬酸合成酶活性呈相关（肌肉氧化能力的标志），这说明MCT1能促进肌纤维细胞对乳酸的吸收，与LDH（心型）及氧化代谢相关酶协同表达^[16]。由于LDH参与无氧酵解，而且LDH5倾向于将丙酮酸还原成乳酸^[17]。九龙牦牛背最长肌中MCT1 mRNA表达量显著低于黄牛，背最长肌中LDH总活力、LDH5比例显著高于黄牛，这说明牦牛背最长肌糖代谢中乳酸的氧化低于黄牛，更倾向于无氧酵解，与牦牛生活环境中的氧含量是相适应的。然而，由于肌肉组织中可表达多种MCT^[18]，因此，牦牛和黄牛对乳酸的利用及其转运的分子基础比较，需要更加精细和全面的分析。

本试验结果初步表明，牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因序列与普通牛相似性高；与普通牛比较，牦牛背最长肌中较低的MCT1 mRNA水平与其较强的无氧代谢能力相吻合，可能是牦牛从分子水平上适应低氧环境的表现之一。

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篇4：牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1-葡萄糖苷键连接而成的非还原性二糖,广泛存在于细菌、酵母菌、霉菌、昆虫、藻类以及某些高等植物中[1,2]。它对生物大分子和生物膜能起非特异性的保护作用,在食品、化妆品、医药、农业、精细化工等行业中被广泛应用[3,4,5,6]。海藻糖制备方法有多种,由于成本高、分离纯化困难、得率低等缺点,除酶法外的其他方法很难实现大规模生产[7]。已经发现5种海藻糖生物合成途径,海藻糖合成酶因一步催化麦芽糖生成海藻糖,原料成本低,工艺简单,使其更适合用于工业生产[8,9,10,11]。

在GeneBank数据库中对玫瑰链霉菌(Streptosporangium roseum)基因组序列进行同源检索分析,发现一段DNA序列在Genbank中被注释为假定海藻糖合成酶基因,未见报道其相关的酶学特性研究。将该片段克隆,异源表达,研究酶学性质,确定该基因能够表达海藻糖合成酶,为深入研究海藻糖合成酶(TreS),下一步应用研究奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

Streptosporangium roseum CGMCC 4.1208菌株购自中国微生物普通菌种保藏管理中心;表达宿主E.coli XL10-Gold及表达载体pSE380由作者实验室保存。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶和T4 DNA 连接酶为宝生物工程有限公司产品;镍离子金属螯合亲和层析介质购自Phamacia公司;海藻糖标准样品为色谱分析纯,其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

玫瑰链霉菌生长培养基:燕麦粉2%,FeSO4·7H2O 0.0001%,MnCl2·4H2O 0.0001%,ZnSO4·7H2O 0.0001%,琼脂1.5%,pH 7.2;LB培养基:胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,氯化钠 1%,pH 7.0,均为121℃高压蒸汽灭菌20min。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰链霉菌的培养及总DNA的提取,质粒DNA的制备、酶切、连接、转化均按文献[12]进行。

1.2.2 PCR扩增Streptosporangium roseum 海藻糖合成酶基因及表达载体的构建

根据Genbank中公布的Streptosporangium roseum基因序列中注释为假定海藻糖合成酶基因的序列,设计一对引物扩增Srt海藻糖合成酶基因,上游引物含EcoRⅠ酶切位点(下划线部分),并在其起始密码子后添加6个组氨酸(斜体部分)以便于一步纯化重组蛋白:

5’- CTGAATTCGTGCACCATCATCATCATCATAGTCAGCTACCTGAG -3’;

下游引物含Hind Ⅲ 酶切位点(下划线部分):

5’-CGCAAGCTTTTACGCCTCCTGGGTTACG -3’。

以Streptosporangium roseum总DNA为模板,PCR扩增Srt基因。反应条件为:98 ℃ 3 min ;98 ℃ 10 s,63 ℃ 10 s,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃再延伸10 min。PCR产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳分析后,纯化PCR产物。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切表达载体pSE380和纯化产物,回收表达载体pSE380和目的基因,将目的基因连接到表达载体pSE380上,转化大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞,筛选得到重组质粒,命名为pSE380-Srt-treS。委托北京华大基因公司进行测序。

1.2.3 蛋白质的表达和纯化

接重组菌于5 mL LB培养基中(含终浓度100 μg/mL Amp),37 ℃培养过夜。再以1 %的接种量接种至含100 mL LB液体培养基(含终浓度100 μg/mL Amp)的三角瓶中,37 ℃、220 r/min摇床振荡培养至OD600为0.6时加入IPTG(终浓度 0.8 mmol/L)37 ℃诱导表达,继续培养10 h,菌液经8 000 r/min离心10min后收集菌体,用0.1 mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.0)重悬,经超声波破胞(破胞功率200W,工作时间7s,间歇时间10s,总工作时间30min)后离心收集上清液即为粗酶液。

由于表达的TreS在N-末端加入了6个组氨酸标签,用镍亲和层析法一步纯化。利用SDS-PAGE检测纯化效果,蛋白含量的测定采用Bradford法[13]。

1.2.4 酶活力测定

取稀释纯酶10 μL加入90 μL用0.1 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.5)配制的1%麦芽糖中,30 ℃反应60 min后,沸水浴10min 终止反应,采用高效液相色谱法(HPLC)检测体系中海藻糖的含量。(实验数据测定过程中均为3次平行实验,下同。)分析条件:色谱柱:Alltech Alltima Amino 100A 5u 柱 (250 ×4.6mm);检测器:Alltech 2000ES ELSD;柱温度28 ℃,压力70×105 Pa;流动相为乙腈∶水=75∶25;流速:1 mL/min。

酶活力单位定义:在最适条件下,1 min反应生成1 μmol 海藻糖所需的酶量为一个活力单位(1 U)。

1.2.5 pH对酶活力的影响

在37 ℃条件下,用pH 5.5～9.5(pH差0.5一个梯度)缓冲液配制的麦芽糖底物与酶反应60 min,测定酶活力。

1.2.6 温度对酶活力的影响

在反应最适pH条件下,反应样分别在15 ℃～55 ℃下(差5℃一个梯度)反应60 min,测定酶活力。

1.2.7 pH和温度对TreS稳定性的影响

热稳定性:将纯酶于20～70 ℃保温1h后,立即冰浴,在最适反应条件下反应后测定残留酶活力;pH稳定性:将纯酶于不同pH(4.0～9.5)的缓冲液中4 ℃放置过夜(12h)后立即在最适反应条件下反应测定残留酶活力。

1.2.8 化学试剂和金属离子对TreS酶活力的影响

在上述1.2.4标准体系中添加终浓度为5 mmol/L不同的金属离子以及10 mmol/L化学试剂,于最适反应条件下反应60 min测定酶活力,对照组不加化学试剂和金属离子。

1.2.9 同反应时间对产物中各糖含量变化的影响

在最适反应温度和pH条件下,酶与底物反应不同时间,HPLC检测产物中各糖含量。

1.2.10 重组酶转化麦芽糖产物的分析

将酶与麦芽糖底物在最适反应温度和pH条件下反应12 h后HPLC检测产物生成。

1.2.11 重组酶底物特异性研究

将酶与1%不同底物(麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖、淀粉)反应24 h,利用HPLC检测生成物。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增基因Srt及表达载体的构建

以玫瑰链霉菌总DNA为模板,用设计的引物扩增出约1.7 kb的DNA片段,目的基因连接表达载体pSE380,经EcoRⅠ和HindⅢ 双酶切验证,结果表明目的基因成功连接至pSE380,重组质粒命名为pSE380-Srt-treS(图1)。

M1: λDNA/Hind III DNA Marker; M2: W2003 DNA Marker; 1: pSE380-Srt-treS digested with EcoRⅠand Hind Ⅲ; 2: pSE380-Srt-treS recombinant plasmid.

2.2 重组蛋白Srt-TreS 纯化和SDS-PAGE分析

Srt-TreS在N-末端加入了6个组氨酸标签,用镍亲和层析法纯化重组蛋白,使用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化效果和蛋白质相对分子量(图2)。结果显示,在66 kDa下方得到明显单一的蛋白条带,纯化结果可用于下一步实验。该蛋白质分子量与核酸序列推测所得的理论分子量(65 kDa)相符,表明重组质粒在大肠杆菌中转化表达成功。

M: Protein molecular weight marker; 1: Recombinant strain E.coli XL10-Gold containing pSE380; 2: Recombinant strain E.coli XL10-Gold containing pSE380-Srt-treS; 3: Recombinant enzyme purified on nickel column.

2.3 最适pH和温度

酶与麦芽糖底物在pH 5.5～9.5的缓冲条件下,37 ℃反应60 min后用HPLC测定酶活力,以酶活力最高者作为100 %,绘制pH-相对酶活力曲线(图3)。由图可知,Srt-TreS的最适pH为7.5。测定酶与底物在温度15 ℃～55 ℃范围,pH 7.5缓冲条件下酶活力,以酶活力最高者作为100 %,绘制温度-相对酶活力曲线(图4)。由图可知,该酶最适温度为30 ℃。

2.4 pH和温度对TreS稳定性的影响

pH稳定性:将酶于不同pH缓冲液中4℃放置过夜(12 h)后立即在最适反应条件下测定残留酶活力(图3)。Srt-TreS在pH 6.0～8.5还残留70 %以上的酶活力,其pH稳定性较好。

热稳定性:将酶于20～70 ℃保温1 h后,然后在最适反应条件下反应后测定残留酶活力(图4)。从图中可知,低于50 ℃,Srt-TreS保留了80 %以上的酶活力,热稳定性较好,而高于50 ℃,酶活力损失大,热稳定性明显降低,55 ℃后酶活完全损失。

2.5 化学试剂和金属离子对TreS酶活力的影响

在酶与底物反应体系中添加终浓度为5 mmol/L不同的金属离子以及10 mmol/L化学试剂,反应60 min测定酶活力,对照组不添加金属离子和化学试剂,结果见表1。从表1可知,Cu2+、Zn2+和Tris能够强烈抑制酶活力性;Ba2+、Ni2+较Mn2+、Ca2+抑制酶活力大;Fe3+和Fe2+对酶活力影响很小,然而K+ 、Mg2+、EDTA对酶活力几乎没有影响,未发现对酶活力有激活作用的试剂或金属离子。

2.6 不同反应时间对产物中各糖含量变化的影响

酶与底物在最适反应条件下反应不同的时间,HPLC分析反应的产物组分(图5)。由图可知,在一定反应时间内,随着时间的增加,海藻糖含量增加,反应3 h后,海藻糖含量逐渐降低,而葡萄糖含量随着反应时间的增加而增加。海藻糖合成酶可催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆反应,且产生副产物葡萄糖,葡萄糖会抑制正反应的进行,使得海藻糖含量降低。

2.7 重组酶转化麦芽糖产物的分析

重组酶转化麦芽糖的产物进行HPLC分析(图6)。从图中可知,该酶能将麦芽糖转化为海藻糖以及少量的葡萄糖, 说明该酶是分子内转糖基酶,且还有轻微的水解作用,与海藻糖合成酶的性质一致。

2.8 重组酶底物特异性研究

A: HPLC chromatogram of standard sample maltose; B: HPLC chromatogram of standard sample trehalose C: HPLC chromatogram of standard sample glucose; D: HPLC analysis of products from maltose by recombinant enzyme.

将重组酶与1 %的不同底物反应,HPLC检测产物,结果如表2。

注:+代表作用;-代表不作用。

从表中可知,Srt-TreS不仅可以催化麦芽糖和海藻糖之间的可逆反应,还可以催化蔗糖生成海藻酮糖,未发现对其他底物产生作用。

3 讨论

据目前文献报道,大部分的海藻糖合成酶均能转化麦芽糖生成海藻糖并伴有15%左右的副产物葡萄糖生成[4,14,15],由Lee JH等人从Pseudomonas stutzeri CJ38中克隆到的TreS基因,其表达的TreS是目前报道的唯一不会产生任何副产物(包括葡萄糖)的TreS,但是麦芽糖转化率只有72%左右,而且其最适反应温度较低[16]。Srt-TreS可以转化82 %以上的麦芽糖形成海藻糖,并伴有较低的葡萄糖副产物生成(约5 %),转化率相对同等大小的TreS转化率高,副产物较少[1,10,14]。Srt-TreS还可以催化蔗糖生成一种新型的适合糖尿病人食用的无龋齿糖类-海藻酮糖,目前主要是从微生物中提取产生海藻酮糖,酶法合成的研究很少[17],最新报道从Thermus thermophilus HB-8 ATCC 27634克隆表达的TreS同样可以催化蔗糖产生海藻酮糖,伴随葡萄糖和果糖副产物产生[18],其催化作用与Srt-TreS相似。这些独特的性质使得Srt-TreS更具工业应用潜能。由于葡萄糖会抑制海藻糖合成酶活力性,并且降低麦芽糖生成海藻糖的转化率[16]。寻求和改造具有高转化效率、没有副产物或者含量很低和高耐热性等优良特性的treS成为今后该酶研究的重点。

4 结论

篇5：牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

关键词：三色堇；DFR；基因克隆；表达分析；花色素合成

中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0034-04

收稿日期：2015-05-19

基金项目：国家自然科学基金（编号：31060265、31260488）；海南大学中西部计划学科建设（编号：ZXBJH-XK008）。

作者简介：孙海燕（1986—），女，重庆开县人，硕士，从事园林植物资源与遗传改良。E-mail：shy0228@sina.com。

通信作者：王健，男，湖北宜昌人，博士，教授，硕士生导师，从事园林植物分子生物学。Tel：0898-66267907；E-mail：wjhnau@163.com。花形态的多样性是大自然最美丽的礼物之一，总是令生物学家着迷。生物学家对产生花卉多样性的发育遗传机制进行了深入的研究，发现金鱼草和矮牵牛是探索花对称性[1]、花色[2-4]、花瓣纹理[5]的优秀模式植物。随着研究的深入，花斑的形成逐渐被学者关注。植物花斑是指在其花瓣大小、形态和位置上基本固定的色斑[6]，主要是由于花色素在特定区域积累形成的，如三色堇黄底紫斑品种Rhinegold和白底紫斑品种Mont Blanc的花斑部分的组成色素是飞燕草素和矢车菊素[7-8]。因而，花色素在花瓣上积累的分子机理是花斑形成原因的研究重点。

花青素又称花色素，属类黄酮化合物，是一类植物次生代谢产物，广泛存在于植物细胞液泡中。自然界中主要有6类花色素，即天竺葵色素（pelargonidin）、芍药花色素（peonidin）、矢车菊素（cyanidin）、牵牛花色素（petunidin）、飞燕草色素（delphinidin）和锦葵花色素（malvidin），其生物合成和调控已有较深入的研究。花青素生物合成途径的前体物质是 4-香豆酰CoA与3-丙二酰CoA，最后形成花的颜色涉及的一系列酶有：查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI），黄烷酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、花色素合成酶（ANS）和UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）等[9-10]。

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花青素生物合成中类黄酮途径的第一个酶，负责将3种二氢黄酮醇（DHK、DHQ和DHM）还原为无色花色素苷，缺失DFR活性的突变体会产生白色。在一些植物中，DFR有严格的底物特异性，不能利用二氢堪非醇（DHK）生产天竺葵素，因而缺乏橙/砖红色。Johnson等将兰属DFR基因转入矮牵牛后，不能有效合成天竺葵素，而将非洲菊中能有效还原DHK的DFR导入到白色矮牵牛中，得到了砖红色花朵[11]。可见，围绕DFR基因进行基因操作也可以改造花色。

三色堇（Viola×wittrockiana Gams）是堇菜科堇菜属的一种多年生常作二年生栽培的草本花卉。由于其花色丰富、明艳，花期长，是花坛、花境、盆花等常用早春花卉，有“花坛皇后”之美誉，在园林绿化方面有很高的应用价值。鉴于DFR基因对植物色彩的形成非常关键，分离三色堇花瓣中DFR基因并研究其表达调控特点，将有助于阐明DFR基因在三色堇花斑形成过程中的作用。本研究拟从三色堇花瓣中克隆DFR基因的cDNA全长序列，进一步对VwDFR进行生物信息学及系统进化分析，并采用实时荧光定量PCR技术研究VwDFR在三色堇不同组织中的表达情况。

1材料与方法

1.1植物材料

本试验材料为花色黄底黑斑的三色堇（Viola × wittrockiana Gams）品种，种植于海南大学园艺园林学院基地。

1.2菌株与试剂

大肠杆菌Escherichia coli JM109菌株购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒（K1642）购自Fementas公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Sigma公司；LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体和实时荧光定量PCR试剂SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ购自大连宝生物公司；引物合成和测序由上海英俊生物技术有限公司完成。其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.3方法

1.3.1总RNA的提取与cDNA第一链合成三色堇花瓣总RNA的提取采用改良Trizol法[12]，其他组织的RNA提取方法按照常规方法进行。cDNA第一链合成使用Fementas公司逆转录试剂盒，操作步骤参照产品说明书。

1.3.2三色堇ANS、DFR基因全长cDNA克隆比对 GenBank 上登录的不同物种的DFR基因，依据其保守区域序列设计特异性引物，扩增得到其保守区片段，然后根据扩增得到的序列分别设计3′-RACE和5′-RACE引物（表1）扩增3′和5′端片段，具体方法参照文献[13]。根据测序所得DFR基因的3′和5′端序列，利用DNAMAN软件进行序列拼接，获得其全长cDNA拼接序列。根据所得的全长拼接序列设计特异性引物（表1），使用Taq plus DNA polymerase进行全长cDNA扩增，引物终浓度为0.5 μmol/L，扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共32个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带，克隆至pMD8-T载体上，测序确认。

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1.3.3生物信息学分析利用NCBI在线Blast工具和DNAMAN软件对全长cDNA序列进行比对分析和开放阅读框预测；利用在线软件Expasy进行氨基酸组成、稳定系数、亲水系数等分析；利用MEGA 5.10软件，以邻近法构建系统进化树。

1.3.4实时荧光定量PCR分析（qRT-PCR）采用罗氏公司的LightCycler 2.0系统进行荧光定量PCR，分析VwDFR基因在初花期根、茎、叶、花不同组织中的表达情况。以actin基因作为内参基因同时进行定量分析，对样品进行均一化。反应总体系为20 μL，包括2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和上下游混合引物0.6 μL及ddH2O 7.4 μL；反应程序95 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共45个循环。靶基因和内参基因的引物设计见表1，数据处理采用系统自带软件。

2结果与分析

2.1VwDFR的克隆

搜索比对其他植物DFR基因序列并找出保守区域，利用PCR扩增得到这个基因片段的特异性条带，长度为241 bp（图1-A）。经分析发现它们均缺失5′和3′端，利用5′和3′RACE技术分别经过2轮扩增，得到DFR的3′末端片段约793 bp（图1-B）及5′末端序列约246 bp（图1-C）。上述片段进行Blast分析，确认与其他植物DFR同源。根据测序结果拼接后，设计引物扩增得到1 340 bp全长cDNA片段（图1-D）。

2.2序列分析

序列分析发现，三色堇VwDFR基因含有1个完整的开放阅读框，起始密码子在85位，终止密码子在1 128位。其开放阅读框为1 044 bp，编码347个氨基酸（图2）。经氨基酸序列保守结构域分析发现该基因蛋白属于SDR蛋白家族，是SDR superfamily超基因家族中的一个，该基因家族有2个高度保守功能结构域，NADP 的结合功能域和底物特异结合功能域。如图3所示，VwDFR基因在这2个功能域上是高度保守的。利用在线软件Expasy分析该基因所编码蛋白的理化性质，结果表明，VwDFR蛋白的分子量为8.61 ku，等电点为5.08，不稳定系数为40.29，平均亲水系数为0.731，属于不稳定型的疏水蛋白。此外，跨膜结构区预测结果表明，VwDFR是跨膜蛋白。

2.3系统进化分析

利用DNAman软件，根据VwDFR基因编码的氨基酸序列，在NCBI蛋白序列库中进行同源检索和比较得知，该蛋白与胡杨（Populus euphratica）、可可（Theobroma cacao）、甜橙（Citrus sinensis）、苹果（Malus domestica）等15种其他植物DFR蛋白有73%～83%的同源性，其中与胡杨DFR蛋白同源性最高，为83%。将VwDFR与这15条DFR蛋白序列进行多重比对并利用Mega 5.10构建系统进化树（图4），发现VwDFR 与杨柳科胡杨的 DFR 亲缘关系最近。从进化树还可

以看出，16条DFR蛋白序列明显地聚为2个类簇，其中 VwDFR 与甜橙、可可、胡杨等双子叶植物的DFR聚为一支，而其他单子叶植物的DFR聚为一支。总的来看，同为双子叶的三色堇DFR基因，与双子叶植物的亲缘关系更近一些，因此DFR蛋白序列的进化基本符合植物分类学的进化规律。

2.4三色堇VwDFR基因荧光定量表达分析

在三色堇开花期进行取样，从同一株植株的根、茎、叶、花中分别提取总RNA，反转录为cDNA。利用实时荧光定量PCR分析三色堇DFR基因在根、茎、叶、花中的表达情况。结果（图5）表明，VwDFR在三色堇的根、茎、叶和花中均有表达，但表达水平具有明显差异。其中，在花色素大量积累的初花期花瓣中表达量最高，在茎中的表达量最低，说明VwDFR主要在花瓣中表达，且色斑区的表达水平高于非色斑区。

3讨论与结论

本研究中利用RT-PCR同源克隆和RACE技术相结合的方法，从三色堇的花瓣中克隆得到花青素合成结构基因VwDFR全长cDNA序列。通过对其编码的氨基酸序列保守结构域分析表明，三色堇VwDFR编码蛋白N端存在2个高度保守功能结构域-NADP 的结合功能域和底物特异结合功能域，是植物SDR superfamily超基因家族蛋白的典型特征。本研究得到的VwDFR基因与其他植物DFR氨基酸序列的一致性较高，其中与杨柳科的胡杨DFR氨基酸序列一致性最高，为83%。且系统进化分析表明，VwDFR和胡杨的DFR亲缘关系较近，而与单子叶植物的鸢尾、百合和小麦等的亲缘关系较远，表明VwDFR基因的进化基本符合植物分类学的进化规律。

本研究中对三色堇不同组织器官的VwDFR荧光定量检测发现，在初花期的花瓣中表达量最高，这与李琴等的研究结果[14]一致，说明VwDFR是三色堇花色素合成的关键基因。此外，VwDFR在根中的表达量也较高，这可能与DFR基因的表达存在组织特异性有关[15]。

花色素结构基因是花色素生物合成的基础，现有的研究表明，植物花瓣上的花斑是由于花色素基因的差异性表达而形成的[16]。DFR基因首次从玉米（Zea mays）和金鱼草（Antirrhinum majus）中分离得到，后来相继从其他多种植物（如拟南芥、三叶草、玫瑰、兰花、非洲菊等）中克隆出DFR[17-19]。研究发现一些植物花瓣上花斑的形成与DFR基因的差异性表达相关，如蝴蝶兰小丑型品种中其花瓣上大块的紫色色斑，主要由于是DFR基因在色斑区特异性表达导致[20]；在文心兰的花瓣和萼片中，其色斑形成的基础是因为OgCHI 和OgDFR基因表达被遏制[21]；而在百合品种Sorbonne中，LhDFR在无色斑的边缘区域表达水平很低，但在花被片的色点部位以及有色斑的中心部位高度表达[22]。

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综上所述，笔者初步推测本试验所克隆得到的VwDFR基因可能在三色堇花瓣中存在差异性表达，三色堇花瓣花色及色斑的形成可能与VwDFR的表达有关。本研究结果为深入揭示三色堇花色及色斑形成奠定了基础，进而为创新花色奠定基础。

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