CyclinD1和Ki67与涎腺多形性腺瘤发生及预后的相关性研究

涎腺多形性腺瘤 (pleomorphic adenomas, PA) 是口腔颌面部常见恶性肿瘤之一, 约占涎腺上皮性肿瘤的80%, PA常常浸润性生长, 术后易复发[1]。Cyclin D1是调控细胞周期G1/S期过渡的重要因子, 而Ki67是评价细胞增殖的重要指标, 研究结果显示Cyclin D1[2]和Ki67[3,4]的表达与细胞增殖活性密切相关。本研究采用免疫组织化学染色法, 联合检测Cyclin D1和Ki67在PA肿瘤组织及正常涎腺组织中的表达状况, 探讨二者在PA发生发展中的作用及其对患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集40例PA和15例非肿瘤性涎腺疾病手术病例的正常涎腺组织。病例选择标准如下: (1) 首次手术治疗或活检的病例; (2) 病理学诊断明确, 临床及随诊资料充足真实; (3) 取材前无其他头颈部肿瘤史; (4) 无放化疗史。其中男性16例, 女性24例;年龄45～76岁, 平均年龄为57岁, ≤57岁24例, >57岁16例;30例发生于腮腺, 10例发生于腭部。标本均经常规福尔马林固定, 石蜡包埋, 4μm切片制作。取连续切片, 分别用于HE染色和免疫组化染色。每批实验设阳性和阴性对照。

1.2 试剂

(1) 抗体:兔抗人单克隆CyclinD1抗体, 购于美国Zymed生物试剂公司;单克隆小鼠抗人Ki67抗体, 购于美国DAKO生物试剂公司。 (2) 免疫组化染色抗兔和抗小鼠试剂盒, 购于北京中杉生物公司。 (3) DAB试剂盒, 购于北京中山生物技术公司。主要仪器:组织切片机、Olympus光学显微镜、高压锅、冰箱。

1.3 免疫组化染色

常规免疫组织化学染色, 一抗选用Cyclin D1或Ki67, PBS作为阴性对照。

1.4 结果判定

将细胞核出现棕黄色颗粒的细胞视为CyclinD1或Ki67阳性表达。每个标本在高倍镜 (400倍) 下随机选取10个视野, 至少记数1000个细胞。阳性细胞表达率= (阳性细胞数/记数细胞总数) ×100%, 阳性细胞表达率<5%的Cyclin D1和Ki67表达水平为 (-) , 阳性细胞表达率5%～25%的Cyclin D1和Ki67表达水平记为 (+) , 阳性细胞表达率25%～50%的Cyclin D1和Ki67表达水平记为 (++) , 阳性细胞表达率50%以上的Cyclin D1和Ki67表达水平记为 (+++) 。

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行等级资料的秩和检验法和Spearman相关分析, 检验水准P<0.05判断为有显著性差异。

2 结果

免疫组织化学染色结果显示Cyclin D1和Ki67在PA和NSG组织中有不同程度的表达, 统计结果见表1。Cyclin D1在15例NSG组中基本无表达, 而在40例PA组中35例呈现阳性表达 (阳性率为87.5%) , 两者有显著性差异 (P<0.05) ;Ki67的表达在NSG组和PA组中分别为2例 (阳性率为13.3%) 和33例 (阳性率为82.5%) , 两者有显著性差异 (P<0.05) 。

如表2所示, Cyclin D1及Ki67的表达与PA的预后相关。Cyclin D1阳性表达例数在36例无复发组中为31例 (阳性率为86%) , 在4例复发组中为4例 (阳性率为100%) , 复发组的Cyclin D1阳性率显著高于无复发组 (P<0.05) 。Ki67阳性表达例数在无复发组中为29例 (阳性率为81%) , 在复发组中为4例 (阳性率为100%) , 复发组的Ki67阳性率显著高于无复发组 (P<0.05) 。

3 讨论

PA是最常见的涎腺上皮性肿瘤, 目前对于其发生的分子生物学发生机制尚无统一认识。因此, 探讨其发生机制, 将分子生物学改变与组织病理学表现相对应, 以生物学标记物指示肿瘤的恶性程度, 预测肿瘤预后以及指导临床治疗方案的选择均具有重要意义。

Cyclin D1是最早发现的原癌基因[5], 其表达与许多肿瘤的发生密切相关[6]。Zhou等人的研究结果表明Cyclin D1在ACC中的阳性表达率约为63%[7];陈玲等人的研究表明Cyclin D1在27例ACC中6例过表达 (22.2%) , 且显示较高的肿瘤细胞增殖活性, 其预后差, 但在与患者年龄、性别、部位等方面未做研究[8];Etges等人的研究结果显示Cyclin D1在ACC等多种涎腺肿瘤中表达增强[9]。

本研究检测了40例PA和10例NSG中Cyclin D1的表达情况。结果发现, PA组的表达明显高于NSG组, 两者有显著性差异, 提示了Cyclin D1的过表达是PA发生的重要机制之一。本研究未发现Cyclin D1的表达与患者性别、年龄及发生部位相关。

Ki67是Gerdes等发现在增殖细胞中表达的一种核抗原, 其基因位于第10号染色体, 目前Ki67被认为是人类所有增生细胞核中普遍存在的标志性抗原, 而且Ki67的高表达与肿瘤的侵袭行为相关[10]。目前国内外关于Ki67在涎腺肿瘤中表达情况的研究主要集中在肿瘤的良恶性鉴别诊断和预后评估等方面。Murakami等人以正常腮腺组织做对照, 分别检测了9例多形性腺瘤、4例ACC、1例黏液表皮样癌和1例腺泡细胞癌中Ki67的表达情况, 发现恶性肿瘤组的Ki67标记指数明显高于正常对照组和良性肿瘤组, 认为Ki67对鉴别肿瘤良恶性及判断预后具有指导意义[11]。Zhu.等人也认为Ki67是区分涎腺肿瘤良恶性可靠的标记物[12]。Kiyoshima等人报道Ki67表达与涎腺恶性肿瘤的组织学分级和临床过程相关[13]。Skalova等人研究显示, Ki67增殖数<5%者有良好的生物学行为, 而Ki67增殖数大于10%者有高的侵袭性生物学行为, 预示肿瘤易复发和转移[14]。因此, Ki67阳性表达率越高, 提示肿瘤的恶性程度越高, 同时也预示生物学行为不良。

本研究结果表明Ki67在PA组的表达水平明显高于NSG组, 说明PA肿瘤细胞具有较强的增殖能力, 特别是实体型组较腺管型组和筛孔型组细胞增殖活性显著增高, 复发组显著高于无复发组, 淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组, 提示了Ki67可作为生物学标志物来预测患者预后。本研究未发现Ki67的表达与患者性别、年龄及发生部位相关。经实验结果的统计学分析我们发现在PA中Cyclin D1与Ki67的表达呈正相关, 因此表明两者均可以作为评价PA肿瘤细胞增殖活性的指标。

综上所述, Cyclin D1在PA中高表达, 提示其表达异常是PA发生的重要机制之一。2种蛋白的过度表达与PA的复发转移显著相关, 故联合检测Cyclin D1和Ki67将有助于预测肿瘤患者的预后。

摘要：目的 检测Cyclin D1和Ki67在涎腺多形性腺瘤 (pleomorphic adenomas, PA) 中的表达状况, 探讨其与PA发生及预后的相关性。方法 采用免疫组织化学染色方法, 分别检测Cyclin D1和Ki67在15例正常涎腺组织 (normal salivary gland, NSG) 及40例PA组织中的表达。实验数据采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。结果 Cyclin D1和Ki67在NSG中基本无表达, 而在PA中阳性表达率明显增高, 并且与PA的复发相关, 但与患者性别、年龄及发生部位无相关性。结论 Cyclin D1和Ki67在PA中高表达, 提示其表达异常是PA发生的重要机制之一;故检测Cyclin D1将有助于预测肿瘤患者的预后。

关键词：多形性腺瘤,Cyclin D1,Ki67

参考文献

[1] 于世凤.口腔组织病理学[M].第6版.北京:人民卫生出版社, 2007.

[2] Chen CH, Shen J, Lee WJ, et al.Overexpression of cyclin D1 and c～Myc gene products in human primary epithelial ovarian cancer[J].IntJ Gynecol Cancer, 2005, 15 (5) :878～883.

[3] Buchynska LG, Nesina IP, Yurchenko NP, et al.Expression of p53, p21WAF1/CIP1, p16INK4A and Ki67 proteins in serous ovariantumors[J].Exp Oncol, 2007, 29 (1) :49～53.

[4] Vital-Reyes V, Rodríguez-Burford C, Chhieng DC, et al.Celecoxibinhibits cellular growth, decreases Ki67 expression and modifiesapoptosis in ovarian cancer cell lines-[J].Arch Med Res, 2006, 37 (6) :689～695.

[5] Bartkova J, Lukas J, Stranss M, et al.Cell cycle-related variationand tissue-restrieted expression of human cyclin Dl protein[J].JPathol, 1994, 172:237～245.

[6] Toyoshima F, Moriguchi T, Wada H, et al.Nuclear export of CyclinD1 and its possible role in DNA damage～induced check point[J].J EMBO, 1998, 17:2728～2735.

[7] Zhou CX, Gao Y.Aberrant expression of beta～catenin, Pin1 andCyclin D1 in salivary adenoid cystic carcinoma:relation to tumorproliferation and metastasis[J].Oncol Rep, 2006, 16:505～511.

[8] 陈玲, 万飞.涎腺腺样囊性癌p16-pRB-cyclin D1通路的研究[J].实用老年医学, 2006, 20:166～168.

[9] Etges A, Nunes FD, Ribeiro KCB, et al.Immuohistochemical expres-sion of retinoblastoma pathway proteins in normal salivary glandsand in salivary gland tumors[J].Oral Oncol, 2004, 40:326～331.

[10] Samuel S, Brain PR, Marcia LL, et al.Prognostic Value of KIT mu-tation type, mitotic activity, and histologic subtype in gastrointes-tinal stromal[J].J Glin Oncol, 2002, 20:3898～3905.

[11] Murakami M, Ohtani I, Hojo H, et al.Immunohistochemical evalu-ation with Ki67 and application to salivary gland tumors[J].Laryngol Otol, 1992, 106 (1) :35～38.

[12] Zhu Q, Tipoe GL, White FH.Proliferative activity as detected byimmunostaining with Ki67 and proliferating cell nuclear antigenin benign and malignant epithelial lesions of the human parotidgland[J].Anal Quant Cytol Histol, 1999, 21 (4) :336.

[13] Kiyoshima T, Shima K, Kobayashi I, et al.Expression of p53 tumorsuppressor gene in adenoid cystic and mucoepidermoid carcinomasof the salivary glands[J].OralOncol, 2001, 37 (3) :315～322.

[14] Skalova A, Lehtonen H, von Boguslawsky K, et al.Prognostic sig-nificance of cell proliferation in mucoepidermoid carcinomas ofthe salivary gland:clinicopathologic study using MIBI antibody inparaffin sections[J].Hum Pathol, 1994, 25:92.