比较分析痰涂片及荧光定量PCR在诊断肺结核中的作用

随着肺结核发病率的增高, 寻找快速准确的检测方法, 对于肺结核早期诊断和治疗将具有十分重要的意义。痰结核分枝杆菌检查是确诊肺结核病的主要方法, 痰涂片检查是简单快速、易行可靠的方法。荧光定量PCR (fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR) 是近年来逐渐发展的新技术, 具有高度的灵敏度和特异度, 主要应用于临床病原体测定、各种基因的定量表达分析、基因突变分析等领域。本研究采用痰涂片抗酸染色及荧光定量PCR2种方法检测肺结核, 分析比较二者在诊断肺结核中的作用, 评价其检测痰结核分枝杆菌的临床应用价值。

1 临床资料

1.1 一般资料

收治我院2009年8月至2010年5月的肺结核患者 (不包含单纯结核渗出性胸膜炎) 897例, 均经临床确诊为肺结核 (结核组) 。其中男536例, 女361例, 年龄9~83岁, 中位年龄36岁, 另选择同期收治的非结核呼吸系统疾病患者103例 (对照组) , 其中男64例, 女49例, 年龄10~79岁, 中位年龄34岁。2组的性别、年龄经分析无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 试剂与仪器

碱性复红染液、盐酸酒精脱色、亚甲兰复染液, 结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒 (中山大学达安基因股份有限公司) , ABI Prism 7300 Real time system (ABI公司) 。

2 方法

2.1 痰涂片萋-尼氏抗酸染色法

常规操作留取痰标本, 在生物安全柜中涂片, 待干后, 经染色, 镜检, 分级计数报告标准均按结核病诊断实验室检验规程。

2.2 荧光定量PCR法

痰液中加入4倍体积的4%Nao H, 摇匀, 置室温下放置30min液化, 取0.5~1.5m L离心管中, 再加入0.5m L4%Nao H, 室温放置10min后, 15000×g离心5min。弃上清, 沉淀加无菌生理盐水1m L混匀, 15000×g离心5min:沉淀物再重复洗涤1次。采用PCR荧光定量检测试剂盒, 按试剂盒操作说明提取和检测菌体基因。取阴、阳性质控品各40μL加等量DNA提取液混匀, 沸水浴10min后同上处理。取2μL处理后的各反应管加入PCR仪器的孔反应槽内, 按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品、并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件:93℃预变性2min, 然后93℃45sec→55℃60sec, 先做10个循环, 最后按93℃30sec→45℃45sec, 做30个循环。反应结束后保存检测数据文件, 根据分析后图像调节baseliner的start值 (2~4) , stop值 (7~9) 以及Threshould值, 最后到窗口下记录仪器自动分析计算出CT值。阴性结果判定:如果CT值=30, 实验结果为阴性;如果CT值<30, 则实验结果为阳性。

2.3 统计学方法

率的比较采用χ2检验。

3 结果

3.1 痰涂片萋-尼氏抗酸染色法检出情况

897例住院肺结核患者中, 痰涂片阳性患者389例, 阳性检出率为43.4%。其中, 抗酸杆菌AFB (Acid-Fast Bacilli) (1+) 126例、AFB (2+) 102例、AFB (3+) 98例、AFB (4+) 63例。103例对照组的结果均为阴性。

3.2 荧光定量PCR法

897例住院肺结核患者中, 结核分枝杆菌阳性571例, 阳性检出率为63.7%。103例对照组的结果均为阴性。

3.3 2组阳性检出率的比较差异有统计学意义 (P<0.01)

4 讨论

肺结核病是由结核分枝杆菌引起的一种严重影响人体健康的慢性呼吸道传染病, 而痰结核杆菌阳性是诊断传染性肺结核的重要依据。痰涂片抗酸染色法目前仍是诊断肺结核病以及判断肺结核病传染性强弱的最直接、最重要的检查。

笔者认为虽然痰涂片检查阳性只能说明痰中含有抗酸杆菌, 不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌, 但是由于非结核分枝杆菌少, 故在痰中检出抗酸杆菌仍是极重要意义的。本次实验痰涂片阳性检出率为43.4% (389/897) , 敏感度仍欠缺, 与van[1]的报道中所述相符合。分析其敏感度低的原因, 有以下几方面: (1) 标本留取不当:患者送检的痰液标本85%左右不是来自有病灶的肺部, 而是口、咽、鼻等处的唾液及分泌物。如果在送检标本痰中伴有气泡, 此类标本检出率很低, 属于不合格标本, 应及时指导并要求重新送检。 (2) 标本取材不当:正常情况下, 结核分枝杆菌只存在于痰中的一少部分, 检验人员取标本时就应取痰中带血的、浓稠的、性状可疑部分涂片。 (3) 肺结核病人是间断性排菌, 很可能造成假阴性。 (4) 抗酸染色法敏感度不高, 可能因为抗酸染色受痰中细菌数量限制, 一般至少每毫升痰液至少含5000~10000个细菌时可阳性结果。总之, 在痰涂片检查工作过程中, 涂片、染色、镜检都要求严格按照操作规程, 每一份痰涂片至少必须仔细搜索100~300个视野来提高阳性检出率。也有文献报道清晨痰标本能发现大部分涂阳患者, 大部分都能在第1次的3份痰标本中发现, 第3次送检仅能发现痰标本阳性的8.4%[2]。同样在Gopi[3]等学者的调查研究中发现不论研究设计、研究人群和镜检方法如何, 第3次痰检的价值较低, 实际上只要通过提高前2份痰涂片及镜检的质量就可以提高病例检出率。所以, 优化涂片镜检技术以提高敏感性和发展新的诊断技术都是我们需要积极研究的领域[4]。

本次实验荧光定量PCR法就是用PCR体外扩增法来检测结核分枝杆菌的, PCR扩增时在加入一对结核分枝杆菌特异性引物的同时加入一条结核分枝杆菌特异性的荧光探针, 再配以PCR反应液、Taq酶、四种核苷酸单体等, 就可以对痰标本中结核分枝杆菌的DNA量进行定量分析。此方法具有较高的特异性, 对照组的痰标本检测结果均是阴性, 另外其敏感度为63.7% (571/897) , 明显高于涂片抗酸染色法, 这与国内学者[5]报道的结果基本相同。笔者认为荧光定量PCR检测结核抗酸杆菌DNA每毫升痰中只需少量细菌即可获得阳性结果, 并且在本实验建立过程中, 抗酸染色阳性的标本, 荧光定量PCR法均为阳性。整个荧光定量PCR检测过程包括样本的制备、样本的扩增和检测报告的发出, 仅需要5~6h, 大大缩短了结核分枝杆菌的检出时间, 而且, 荧光定量PCR技术其在密闭体系中完成扩增并进行实时测定, 降低了污染可能性, 并可精确地进行定量检测, 为肺结核监测提供参考, 尤其是特别对一些含菌量低的标本 (如尿液、胸腹水) 的检测具有非常实用的价值, 大大提高了结核分枝杆菌的检出率。尽管可能会有少数假阳性的结果, 但荧光定量PCR技术已经从分子水平确定肺结核, 为结核病的快速诊断提供了有力参考, 仍是灵敏度高、特异性强的肺病结核病辅助诊断的有效方法之一。

综上所述, 痰涂片是检测结核分枝杆菌的基础, 荧光定量PCR则是检测结核分枝杆菌的关键, 两者的联合运用再与结核菌培养法互补使用可明显提高结核分枝杆菌的阳性检出率, 这些方法都已是临床结核分枝杆菌实验诊断的常规技术, 为肺结核患者早期诊断和鉴别诊断提供了重要依据。

摘要：目的 探讨建立更快速、准确的痰结核分枝杆菌检测方法。方法 采用痰涂片抗酸染色法和荧光定量PCR技术对痰结核分枝杆菌进行检。结果 荧光定量PCR技术的阳性检出率是63.7% (571/897) , 明显高于抗酸染色法的43.4% (389/897) 。2种方法检测对照组的结果均为阴性, 特异度为100% (103/103) 。结论 荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法, 具有重要的应用价值。

关键词：结核分枝杆菌,抗酸染色,荧光定量PCR

参考文献

[1] Van Leth F, Van der Werf MJ, Borgdorff MW.Prevalence of tuber-culosis infection and i ncidence of tuberculosis:a re-assessment of the Styblo rule[J].Bull World Health Organ, 2008, 86 (1) :20～26.

[2] S.R.Mase, A.Ramsay, V.Ng, et al.Yield of serial sputum specimen examinations in the diagnosis of pulmonary tuberculosis:a system-atic review[J].INT J TUBERC LUNG DIS The Union, 2007, 11 (5) :485～495.

[3] Gopi P G, Subramani R, Selvakumar N, et a1.Smear examination of two specimens for diagnosis of pulmonary tuberculosis in Tiruvallur District, South India[J].Int J Tuberc Lung Dis, 2004, 8:824～828.

[4] Pai M, Kalant S P, Dheda K.New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis:PartⅡ.Active tuberculosis and drug resistance[J].Expert Rev Mol Diagn, 2006, 6:423～432.

[5] 张翊, 卢建平, 叶淼.4种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价[J].中国防痨杂志, 2006, 28 (1) :14～17.