荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用研究

2023-03-05

一、荧光定量PCR技术原理及特点

(一) 基本原理

荧光定量PCR技术对整个PCR反应过程进行实时的监测, 并可以对收集的荧光信号进行连续的分析, 随着反应时间的不断增加, 监测到的荧光信号变化可以绘制成一条连续的曲线, 有利于对环境中的微生物进行检测。在PCR反应的早期, 反应过程中的荧光水平与背景之间没有明确的区别, 导致荧光的产生处于指数期、线性期及最终的平台期。荧光定量PCR技术的基本原理首先需要设置一个定量的荧光信号域值, 通常这个荧光信号域值是作为PCR反应前15个循环的荧光本底信号, 并保证这15个循环内的荧光信号是标准偏差值的10倍左右[1]。在PCR过程中如果检测到荧光信号超过设置的域值, 那么这个就是真实的荧光信号, 可以用来对域值循环数进行定义。域值循环数 (Ct) 的含义是每个反应管内的荧光信号达到设置的域值时所经历的循环数, Ct值与模板量之间存在线性关系, 随着模板量的增加, Ct值会有所降低。因此, 在荧光定量PCR技术应用过程中, 如果可以得到检测样品的Ct值, 则可以根据标准曲线的变化对该检测样品的起始拷贝数进行分析并确定[2]。

(二) 特点

通常情况下PCR产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或者是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测, 在反应过程中需要用到多种仪器设备, 且需要耗费大量的时间和劳动力, 反应的原材料会对人体产生危害, 并在实验中产生假阳性的污染, 虽然荧光定量PCR技术在实践操作上存在很多的缺点, 但是它还是有很多的优点的, 这些显著的优点让它得以在环境微生物检测中的加以应用[3]。

首先是特异性能好, 在使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子进行识别的过程中具有很高的准确性, 可以快速、高效的完成任务, 而且可以加强对靶序列设计及特异性探针的双重控制, 增加其特异性能, 一定程度上降低假阳性。其次是灵敏度较高, 荧光定量PCR技术是一项综合了PCR技术、荧光标记技术、数码显像技术以及激光技术为一体的新型技术, 取其精华、弃其糟粕, 有效的提高了技术的检测灵敏度。然后是荧光定量PCR技术的线性关系好, 在线性范围宽度上具有较大的优势, 在环境微生物检测过程中, 荧光定量PCR技术由于荧光信号的产生可以和每次扩增的产物形成一一对应的关系, 这样就为产物的定量提供了极大的便利。最后是速度快、效率高, 荧光定量PCR技术是多项技术精华的综合, 通过在实践中的应用发展, 已经可以实现在短时间内完成多个样品的定量分析, 这大大减少了工作人员的劳动量, 提高了工作效率和工作质量。

二、荧光定量PCR技术应用存在的问题

荧光定量PCR技术在环境微生物检测的应用过程中容易受到许多因素的因素的影响, 其中包括寡核苷酸杂交特异性、Taqman探针比例、SYBR浓度大小以及PCR产物的尺寸长短等, 这些因素都有可能对定量结果造成直接影响。由于目前在这一方面没有统一的标准, 不同实验室都有着自定的一套生成标准曲线样品, 造成试验结果之间缺乏可比性, 降低了应用定量结果的准确性和可靠性。

荧光定量PCR技术所采用的是特异性DNA的体外扩增, 这种方式的检测从理论上可以对所有类型的样品进行PCR扩增, 不一定非要使用到活细胞进行检测, 但是这种方式的检测结果会将处于休眠状态且无法培养的细菌也检测到, 这表明荧光定量PCR技术不能对活细胞和死细胞进行区分, 进而无法对检测到的病原体是否具有感染力做出准确的判断。

三、加强应用的有效措施

第一, 要加大对荧光定量PCR技术应用的人力、物力和资金的投入力度, 重视荧光定量PCR技术的应用, 将其落实到实处, 认真做好每一项工作。还可以设立虚拟导线在平差中应用的专项资金, 促使各项研究可以顺利高效的完成任务。

第二, 培养技术型人才。在合适的时间、适当的阶段要做好人才的定期培训。加大对荧光定量PCR技术应用工作的资金支持, 积极鼓励相关人员进行培训, 派遣相关专家进行对员工进行讲座知识培训。同时要积极组织好大家对荧光定量PCR技术应用理论知识的学习, 除此之外, 也要结合实际和具体的案例进行分析, 开展实地演练, 只有在平时更多地练习, 做好技术总结和经验的把握才可以为以后工作的运行做好更多的铺垫, 为以后解决困难提供更多的帮助。

第三, 促进信息技术在荧光定量PCR技术应用方面的应用。实现荧光定量PCR技术应用的信息化是目前我国发展的一大趋势, 信息技术可以更好地促进荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用, 提高工作效率, 帮助平差测量技术的进一步提升, 从而实现研究事业的发展。

四、结语

荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用还有很大的发展空间和发展前景, 需要相关人员在实际操作过程中积极探索, 不断创新, 实现荧光定量PCR技术的进一步发展。

摘要：随着我国经济的快速发展和社会的不断变化, 我国的科学技术也取得了巨大的进步, 为各领域的科学研究提供了强大的技术支持。荧光定量PCR技术是在原有的PCR技术基础上发展起来的一种新兴核酸定量技术, 是时代发展的产物, 他可以进一步将荧光能量传递技术应用于常规的PCR仪器中, 在整个反应体系中增加荧光染料或者是荧光基团, 主要是利用荧光信号的积累来实现对整个PCR过程的实时监测, 并最终根据反应标准曲线对未知模板浓度进行预测。如今, 荧光定量PCR技术已经被应用于国内外的环境监测方面, 有利于加强对环境中微生物的检测和研究工作, 随着该项技术的不断完善和发展, 未来在环境微生物检测方面将会有着广阔的发展及应用前景。

关键词：荧光定量,PCR技术,环境微生物,检测,应用研究