三氧化二砷对胃癌MGC803细胞增殖和凋亡作用的研究

对于晚期胃癌, 化疗是治疗的重要手段, 但是临床上有针对特异性靶点的化疗药物却很少, 尤其是很多胃癌细胞都会产生多耐药性 (MDR) , 导致化疗效果比较差, 目前比较肯定的是5-氟尿嘧啶对胃癌比较有效外[1], 其它很多化疗药物作用有待确认。三氧化二砷 (As2O3) 是我国传统中药砒霜的主要成分, 国人在上世纪70年代将其成功应用于治疗急性早幼粒细胞性白血病后, 大量研究表明, As2O3不仅对急性白血病有效, 同时对胃癌, 肺癌等实体癌等也有治疗效果[2,3], As2O3主要是通过抑制细胞生长, 诱导细胞分化和凋亡起到抗肿瘤的作用, 但其抗癌机制有待进一步深化探讨, 先前研究已经证实三氧化二砷能抑制体外培养的胃癌细胞的生长和集落形成, 该研究继续将三氧化二砷作用于胃癌细胞株MGC803, 研究时间从2011年6月—2013年5月, 观察有关凋亡相关基因和细胞周期变化, 对As2O3作用靶点和胃癌细胞多耐药性原因做进一步探讨, 为临床应用提供更科学的理论基础。

1 资料与方法

1.1 试剂仪器

三氧化二砷购自哈尔滨伊达药业有限公司, RPMI-1640和胎牛血清由Gibco/BRL美国公司提供, 人胃癌MGC803细胞由哈医大一院提供, 微量加样器上海医用精密仪器厂产, Bcl-2、caspase3抗体购于武汉博士德公司, PI试剂盒购宝赛公司, 其他为国产分析纯, 流式细胞仪 (FACS Calibur) 美国BD公司生产。

1.2 MGC803体外细胞培养

MGC803细胞接种于50 m L培养瓶中, 加入RPMI-1640培养液中, 置于37℃, 5%CO2浓度及饱和湿度恒温的细胞培养箱中培养, 细胞呈贴壁上皮样生长, 用0.15%胰蛋白酶消化传代, 用培养液吹打成单细胞悬液, 取对数生长期细胞进行实验。

1.3 实验分组及药物处理

将5×104个/m L单细胞悬液接种于96孔培养板中, 空白对照组加入10%的培养液, 实验组分别加入As2O3培养液:0.5μmol/L的低剂量组, 1.5μmol/L中剂量组, 2.5μmol/L高剂量组, 每隔3 d更换培养液, 在不同时间取出培养细胞用于实验。

1.4 流式细胞仪检测

收集分别经不同浓度的As2O3 (浓度同前) 混合培养液处理的细胞, 加药培养72 h (先前研究表明, 药物第三天作用最强) 后取出, 0.15%胰酶消化, 空白对照管加等量培养液, 离心 (1000 r/min, 10 min) , 弃上清液, 冷PBS漂洗后震荡, 使细胞悬浮以去除细胞碎片, 调整细胞数为5×105~10×105个/m L, 4℃离心10 min, 弃上清液, 加入预冷的70%乙醇固定, 碘化丙啶 (PI) 单染, 上机检测分析细胞周期。

1.5 West-blotting检测凋亡蛋白表达

取上述各组浓度As2O3处理过的培养细胞, 冷PBS漂洗后加裂解液裂解细胞, 转移至EP管中, 离心0.5 h后上清液为胞浆蛋白部分, 然后灌胶上样, 将蛋白样品加入到孔里 (50μg/孔) 电泳分离, 然后转至PVDF膜, 上摇床后用含脱脂奶粉的TBS封闭抗原1 h, 加入一抗 (Bcl-2, caspase3) , 4℃过夜, TBS洗膜后加入二抗稀释液室温孵育膜1 h, TBS再洗膜3次, 胶片曝光照相, 同时用β-actin作为参照。

1.6 统计方法

计量数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 用t检验, 采用SPSS12.0软件对所科数据进行分析。

2 结果

注:与空白对照组比较, *P<0.05。

2.1 流式细胞仪分析细胞周期。

由表1可知, 与对照组细胞相比, As2O3为0.5μmol/L时, S期细胞分布 (32.41±2.11) (对照组28.24±1.38) , G2/M期细胞分布 (31.28±0.19) (对照组30.05±0.18) 两者比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 说明药物浓度较低时, 对肿瘤细胞抑制反应较弱;当As2O3浓度为1.5μmol/L时, S期细胞分布 (33.55±2.37) , G2/M期细胞分布 (27.74±0.46) , 与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;药物提高到2.5μmol/L时, G0/G1期细胞分布 (39.82±2.01) , S期细胞分布 (41.03±2.37) , G2/M期细胞分布 (19.15±0.46) , 与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;说明1.5μmol/L以上的药物浓度才能达到有效的抑制肿瘤增长繁殖的效果, 随As2O3浓度的升高G0/G1期和G2/M期肿瘤细胞数下降, S期细胞数上升, 说明As2O3把肿瘤细胞阻滞在S期, 阻断了细胞增值过程的有丝分裂。

2.2 蛋白印记检测相关凋亡基因

2.2.1 Bcl-2蛋白表达

对照组, 0.5μmol/LAs2O3, 1.5μmol/LAs2O3, 2.5μmol/LAs2O3相比, Bcl-2蛋白表达逐渐减少, 说明随药物浓度的增加, 肿瘤细胞抗凋亡能力减弱, 延缓了耐药性的发生。见图1。

2.2.2 Caspase3蛋白的表达

对照组, 以及各浓度As2O3相比, Caspase3蛋白表达逐渐增加, 说明随As2O3浓度的增加, 肿瘤细胞的凋亡加速。见图2。

3 讨论

胃癌的多耐药性 (MDR) 是胃癌化疗过程中的一大难题, MDR的产生与多种基因如Bcl-2, Bax, MRP, P-gn, Caspase家族的表达失衡有关, 三氧化二砷是中药砒霜的主要成分, 应用砷化物治疗肿瘤, 我国学者开创了先河, As2O3抗肿瘤作用机制主要涉及诱导肿瘤细胞凋亡、调控细胞周期、抑制癌细胞生长及诱导分化等[4,5,6], 但其具体分子靶点有待于继续确认研究, 该研究将不同浓度的三氧化二砷作用于MGC803细胞, 应用流式细胞仪检测细胞周期分布, 发现随着As2O3浓度的提高, G0/G1期的转变逐渐减少, 说明原始肿瘤细胞G0减少, 该期细胞是肿瘤复发和增值的阵地, G0的减少这在一定程度减轻了肿瘤复发的机会, 同时处于S期细胞逐渐增多, G2/M期细胞数减少, 从而阻滞有丝分裂的继续, 从而抑制细胞转录和蛋白表达, 这与肖冬梅[7]等的研究较为一致, 以上提示As2O3主要是使肿瘤细胞阻滞在DNA合成期, 而达到抗肿瘤的目的的;另外应用免疫蛋白印记发现:随着As2O3浓度的提高, 对细胞抑制作用的加强, Bcl-2表达逐渐减少, Bcl基因族位于线粒体、内质网及核膜上, 编码两类功能相反的蛋白质, 即抑制凋亡的bcl-2、bcl-x以及促进凋亡的Bax、bak等。Bcl-2本身无促进细胞生长增殖和细胞恶性转移的作用[8], 但它可以在其它刺激因子存在的条件下通过抑制凋亡延长细胞存活时间, 增加细胞染色体突变和病毒转染的机会, 导致细胞恶变和促进肿瘤的发生与发展, 如果细胞在致癌因素的作用下导致Bcl-2表达的增加, 致使肿瘤细的抗凋亡能力增强, 而延长细胞的生存时间, 显然增加了肿瘤细胞对化疗药物的耐受性, 这在一定程度上决定了化疗药物的选择和预后复发的可能性, 而大约75%的胃癌组织中Bcl-2表达阳性[9,10], 所以Bcl-2表达的异常可能是肿瘤产生耐药性 (MDR) 的重要原因之一。在该研究中, As2O3能下调Bcl-2的表达, 且随浓度的增加对其抑制作用增强, 提示As2O3可以在一定程度上逆转胃癌细胞的耐药性。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶, Caspase的激活是多种肿瘤凋亡的途径之一, 尤其是Caspase3、Caspase8、9。Caspase3是多种细胞凋亡级联反应中的最后通路的关键性成分, 它能使DNA片段裂解而引起细胞凋亡的发生。该研究显示:随着As2O3浓度的提高, Caspase3表达逐渐增加, 之前研究表明, 电镜下As2O3能使胃癌细胞线粒体损伤, 由此推断可能是As2O3使细胞线粒体膜受损后, 细胞色素C释放, 激活Caspase酶家族, 导致细胞凋亡反应的发生, 可见Caspase的激活是As2O3的一个重要作用靶点, 该基因对药物的高表达在一定程度反应了化疗药物的疗效。

该研究证实了三氧化二砷作用于胃癌细胞MGC803后, 当As2O3浓度>1.5μmol/L时, 使S期细胞逐渐增多, G2/M期细胞减少, 从而抑制细胞增殖, 提示应用As2O3化疗时要注意药物的有效浓度以及严格掌握好化疗周期, 以尽可能提高疗效的同时减轻不良反应;同时As2O3能减少胃癌细胞Bcl-2和增加Caspase3的表达, 而促进肿瘤细胞的凋亡和延缓耐药性的发生, 然而上述基因只是肿瘤细胞增殖和凋亡等众多调控基因网络中的一员, 其间的更详细的因果关系以及机制有待进一步研究。

摘要：目的 研究三氧化二砷 (As2O3) 对人体外胃癌细胞株MGC803细胞生长周期和相关凋亡基因表达的影响, 进一步探讨As2O3作用机制和多耐药性原因。方法 将不同浓度三氧化二砷作用于MGC803细胞株后体外培养, 应用流式细胞仪 (FCM) 分析各组细胞周期变化, Westblotting观察相关凋亡基因Bcl-2和Caspase3增殖变化。结果 As2O3为0.5μmol/L时, S期细胞分布 (32.41±2.11) (对照组28.24±1.38) , G2/M期细胞分布 (31.28±0.19) (对照组30.05±0.18) 两者比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 当As2O3浓度为1.5μmol/L时, S期细胞分布 (33.55±2.37) , G2/M期细胞分布 (27.74±0.46) , 与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 药物提高到2.5μmol/L时, S期细胞分布 (41.03±2.37) , G2/M期细胞分布 (19.15±0.46) , 与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;westblotting显示As2O3能同时下调Bcl-2, 上调Caspase3蛋白的表达而诱导细胞凋亡。结论 三氧化二砷能够使胃癌MGC803细胞的S期细胞逐渐增多, G2/M期减少, 从而抑制细胞增殖, 同时能减少Bcl-2和增加Caspase3蛋白的表达, 促进肿瘤细胞的凋亡和延缓耐药性的发生, 所以在临床应用As2O3化疗时要注意药物的有效浓度以及掌握好化疗周期, 以尽可能提高疗效的同时减轻不良反应, 延缓耐药性的发生。

关键词：三氧化二砷,细胞周期,Bcl-2,Caspase3

参考文献

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