过敏性哮喘血清免疫学论文提纲

2022-11-15

论文题目：“脱敏定喘汤加减方”调体治疗小鼠过敏性哮喘的效果及对ILC2细胞的作用机制研究

摘要：目的:通过构建过敏性哮喘小鼠模型,探究基于“辨体论治”诊疗思路治疗过敏性哮喘的脱敏定喘汤加减方对过敏性哮喘小鼠的疗效与安全性及对ILC2细胞的影响,从而进一步探究过敏性哮喘小鼠的发病机制。以期为“辨体论治”诊疗方法的临床应用提供科学实验依据,丰富中医诊疗思想的科学内涵。方法:本实验研究主要分为两部分:一是“脱敏定喘汤加减方”对于过敏性哮喘小鼠治疗的药效与用药安全性研究（包涵实验一与实验二两部分实验）,二是“脱敏定喘汤加减方”对于过敏性哮喘小鼠作用的机制研究（包涵实验三与实验四两部分实验）。本实验所用的实验动物为BALB/c小鼠,该小鼠先天表现出Th1/Th2失衡且倾向于Th2型反应,由于其自身特点,BALB/c小鼠容易患过敏性疾病,被广泛运用于免疫学实验研究。第一部分研究方法如下:实验一方法如下:48只雌性BALB/c小鼠随机分为6组,每组8只,分别为正常组（N）、模型组（M）、地塞米松阳性药对照组（D）、脱敏定喘汤加减方高剂量浓度组（Y20）、脱敏定喘汤加减方中剂量浓度组（Y10）、脱敏定喘汤加减方低剂量浓度组（Y5）。采用卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）致敏加雾化吸入激发的方式建立小鼠过敏性哮喘模型,每天观察小鼠症状及记录小鼠体重。于第0天、14天给小鼠腹腔注射溶有OVA和氢氧化铝凝胶的混合液,第21天起,将小鼠置于有机玻璃箱内,用医用雾化器雾化吸入激发（30min/天）,每日1次,连续雾化7日。将中药脱敏定喘汤加减方制备成剂量浓度分别为20倍、10倍、5倍的药液。3个脱敏定喘汤加减方给药组于第14天进行灌胃给药,连续给药14天,每次0.2ml。西药地塞米松阳性药对照组,造模后第21天开始灌胃给药,连续给药7天,每次0.2ml。正常组于造模后第21天开始进行生理盐水灌胃,连续灌胃7天,每次0.2ml。造模结束后,将小鼠摘眼球取血,血液样本静置4小时后,离心分离出血清,采用ELISA测定小鼠血清中IL-5的含量。收集小鼠支气管肺泡灌洗液（Broncho Alveolar Lavage Fluid,BALF）,离心分离出细胞沉淀,采用Diff-Quick染色的方法对小鼠BALF中的炎性细胞进行计数分类。解剖剪取小鼠肺组织,对其大体形态拍照后,用10%的甲醛溶液固定,用于做各组织苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）和过碘酸雪夫染色（Periodic Acid-Schiff stain,PAS）。实验二方法如下:20只雌性BALB/c小鼠随机分为4组,分别为正常组（N）、模型组（M）、脱敏定喘汤加减方组（Y）,阳性药对照组（D）每组5只。造模方法同实验一。脱敏定喘汤加减方给药组于第14天进行灌胃给药,连续给药14天,每次0.2ml。西药地塞米松阳性药对照组,造模后第21天开始灌胃给药,连续给药7天,每次0.2ml。正常组于造模后第21天开始进行生理盐水灌胃,连续灌胃7天,每次0.2ml。造模结束后,解剖剪取小鼠肠、心、肝、肾组织,脏器大体形态拍照后,用10%的甲醛溶液固定,用于做各组织苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）。并量取大肠、小肠长度。第二部分研究方法如下:实验三方法如下:20只雌性BALB/c小鼠随机分为4组,分别为正常组（N）、模型组（M）、脱敏定喘汤加减方组（Y）,阳性药对照组（D）每组5只。造模方法同实验一。给药方法同实验二。造模结束后,将小鼠摘眼球取血处死后,解剖打开腹腔分别取出盲肠、结肠中的内容物,置于液氮中,将全部样本送至北京奥维森基因科技有限公司进行检测。实验四方法如下:9只雌性BALB/c小鼠随机分为3组,分别为正常组（N）、模型组（M）、脱敏定喘汤加减方组（Y）,每组3只。造模方法同实验一。脱敏定喘汤加减方给药组于第14天进行灌胃给药,连续给药14天,每次0.2ml。正常组于造模后第21天开始进行生理盐水灌胃,连续灌胃7天,每次0.2ml。造模结束后,将小鼠摘眼球取血处死后,解剖打开胸腔取出肺脏、脾脏、大肠组织置于完全1640培养基中,采用流式细胞分析技术对以上组织中的ILC2细胞进行定量分析。结果:第一部分研究结果实验一结果如下:1.与模型组相比,经地塞米松和脱敏定喘汤加减方干预后,过敏性哮喘小鼠血清中的IL-5水平明显下降,其中阳性药对照组下降最为显著（P＜0.01）,脱敏定喘汤加减方高剂量浓度组次之。2.与模型组相比,经地塞米松和脱敏定喘汤加减方干预后,过敏性哮喘小鼠的肺指数和脾指数均有明显下降,其中阳性药对照组下降最为显著（P＜0.01）,脱敏定喘汤加减方高剂量浓度组次之。3.与模型组相比,经地塞米松和脱敏定喘汤加减方干预后,过敏性哮喘小鼠肺部病理HE染色与PAS染色评分明显下降,其中阳性药对照组下降最为显著（P＜0.01）,脱敏定喘汤加减方高剂量浓度组次之。与模型组相比,经地塞米松和脱敏定喘汤加减方高剂量浓度干预后,过敏性哮喘小鼠肺部支气管和血管周围炎性病变有明显改善,肺泡膈清晰可见,肺泡形状较为完整,支气管中粘液分泌明显减少。4.与模型组相比,经地塞米松和脱敏定喘汤加减方干预后,过敏性哮喘小鼠BALF中炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数明显下降,其中阳性药对照组下降最为显著（P＜0.01）,脱敏定喘汤加减方高剂量浓度组次之。实验二结果如下:1.各组小鼠心脏、肝脏、肾脏组织病理HE染色结果显示各组间没有差异。2.与模型组相比,经地塞米松和脱敏定喘汤加减方干预后,过敏性哮喘小鼠小肠、大肠长度有所增加,其中阳性药对照组增加最为显著（P＜0.01）,脱敏定喘汤加减方高剂量浓度组次之。第二部分研究结果实验三结果如下:1.小鼠盲肠Chao1指数各组间差异不明显,无统计学意义P＞0.05。而小鼠盲肠Shannon指数显示,与其他组比较,脱敏定喘汤加减方组小鼠盲肠Shannon指数有所降低。小鼠结肠Chaol指数显示,与阳性药对照组比较,正常组与脱敏定喘汤加减方组的小鼠结肠Chao1指数明显升高。其他各组间的差异并不具有统计学意义。小鼠结肠Shannon指数显示,与阳性药对照组比较,其他三组的小鼠结肠Shannon指数明显降低。2.各组小鼠盲肠菌群丰度排名前3位相同,依次为厚壁菌门,拟杆菌门,变形菌门。各组小鼠盲肠菌群丰度排名前3位相同,依次为拟杆菌门,厚壁菌门,变形菌门。3.与正常组比较,其他三组小鼠排名前五位的盲肠优势菌属均发生了变化。而经过脱敏定喘汤加减方和地塞米松治疗后,小鼠排名前五位的盲肠优势菌属相同。各组小鼠排名前五位的结肠优势菌属未发生变化。4.与模型组相比,经脱敏定喘汤加减方与地塞米松治疗后,过敏性哮喘小鼠盲肠乳酸杆菌有明显升高,脱敏定喘汤加减方组升高最为显著（P＜0.01）。与模型组相比,经脱敏定喘汤加减方与地塞米松治疗后,过敏性哮喘小鼠结肠乳酸杆菌有明显升高,阳性药对照组升高最为显著（P＜0.01）。实验四结果如下:1.与模型组相比,经脱敏定喘汤加减方干预后,过敏性哮喘小鼠肺中ILC2细胞占比与ILC2细胞个数明显降低。与模型组相比,经脱敏定喘汤加减方干预后,过敏性哮喘小鼠大肠中ILC2细胞占比略有升高,但ILC2细胞个数明显降低。结论:体现“辨体论治”思想的脱敏定喘汤加减方可能通过影响肠道菌群的组成,抑制肠粘膜固有层ILC2细胞活化,而该ILC2细胞可能通过迁移到肺部,从而在肺部影响过敏性哮喘发病过程中细胞因子的产生,最终影响嗜酸性粒细胞往肺部的趋化,发挥其对过敏性哮喘小鼠的治疗作用。

关键词：ILC2细胞;过敏性哮喘;脱敏定喘汤加减方;辨体论治

学科专业：中医外科学

摘要

ABSTRACT

符号说明

第一部分文献综述

综述一中医药治疗过敏性哮喘的研究进展

1 中医对过敏性哮喘的认识

2 过敏性哮喘的中医药治疗思路及方法

3 基于中医“治未病”思想对过敏性哮喘的预防

参考文献

综述二过敏性哮喘发生机制研究进展