血管治疗疾病护理论文提纲

2022-11-15

论文题目：MiR-508-3p在肺动脉高压中的功能性表达和调节机制研究

摘要：1研究背景肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）是一种严重的心肺相关慢病,由肺小动脉的细胞增殖和纤维化以及非肌型小动脉肌化引起,导致肺血管阻力（pulmonary vascular resistance,PVR）逐渐升高。对PAH明确诊断需在海平面条件下,右心漂浮导管检测平均肺动脉压≥25mmHg,肺动脉楔压≤15mmHg和PVR＞3wood单位。此外还必须排除如肺部疾病和慢性血栓栓塞性疾等其他病因导致的PAH。在过去20多年中,PAH流行病学特征和治疗观念发生很大变化。在老年患者中越来越多诊断出PAH,其中大部分患有合并症,增加医疗护理挑战性。尽管PAH发病机理始于肺循环,然而右心衰竭是死亡首要原因。当前,临床上PAH主要治疗策略是针对靶向肺血管系统中功能异常的信号通路以及传导途径,疗效有限,不能满意提高PAH患者生活质量。因此,迫切需要更深入地探讨PAH的复杂调控网络,开辟新的特异性治疗靶点。PAH主要病理学特征表现在肺动脉血管收缩（vasoconstriction）、血管重塑（vascularremodeling）以及血栓形成（thrombosis）。PAH分子机制涉及内皮细胞功能障碍、肺动脉血管平滑肌细胞增殖、血管炎症和免疫失调、能量代谢和线粒体异常、过度的生长因子刺激和离子通道缺陷等。体内一氧化氮（nitric oxide）,内皮素-1（endothelin-1）,前列环素（prostacyclin）和 5-羟色胺（serotonin）等血管活性介质的失衡和肺泡低氧（缺氧）（alveolarhypoxia）共同促进肺血管收缩。血管损伤和内皮细胞功能紊乱（endothelialcells,EC）可通过改变细胞因子/生长因子水平、提高凝血能力以及增加分泌细胞外基质（extracellular matrix,ECM）（主要是弹力蛋白和胶原蛋白）来改变血管稳态,进而促进肺血管重塑。炎性反应贯穿在PAH病理生理过程,并被认为是肺血管重塑主要致病因素。肺血管细胞（平滑肌细胞和内皮细胞）和炎性细胞是局部趋化因子和细胞因子的重要来源,可促进肺血管重塑。实际上,细胞因子和趋化因子表达增强导致肺血管细胞过度收缩和增殖。IL-1可以诱导成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）-2表达,FGF-2和IL-6又能刺激PAH中平滑肌样细胞和肺血管的成纤维细胞增殖。多种细胞因子可直接控制肺血管细胞细胞增殖、迁移和分化。其中IL-6在促炎性细胞因子中占据主导地位,并且与PAH发病机理有关。在PAH动物实验中,与对照组小鼠相比,重组IL-6蛋白显著促进模型小鼠肺血管重构,并增强模型小鼠对缺氧的高反应性。此外,IL-6还通过调控转录因子KLF-5促进FGF-2表达,进而导致肺动脉平滑肌细胞增殖。PAH中肺动脉血管丛周围浸润着由巨噬细胞,T淋巴细胞和B淋巴细胞组成的血管周细胞。在野百合碱（monocrotaline,MCT）诱导的 PAH 模型中,基质衍生因子-1（stromal-derived factor,SDF-1）是炎症细胞募集的关键趋化因子之一,具备阻断CD68+细胞、CD3+细胞和肥大细胞的肺血管浸润的作用。巨噬细胞和单核细胞的聚集和活化通常导致细胞因子、血管活性分子（如内皮素等）和活性氧释放（reactive oxygen species,ROS）。活化的巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）和丝氨酸蛋白酶（serineproteases）,有利于基底膜和细胞外基质降解,促进白细胞迁移、外膜纤维化以及细胞分化。肺血管周围CD8+T细胞的浸润与内皮细胞凋亡-抗凋亡信号转导受损有关。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）激活巨噬细胞表达,而巨噬细胞本身反馈并参与BMP信号调节。在PAH中,BMPR2突变以及BMPR2相关联的信号通路功能障碍都会导致血管细胞中生长因子异常表达和促炎反应。微小RNA（microRNA,miRNA）,是长度约为22个核苷酸的非编码RNA。研究表明,miRNA参与并调节正常细胞和肿瘤细胞中的多种细胞过程,异常表达的miRNA通过充当疾病抑制因子或激活因子调控疾病病理机理过程。迄今,已证实多种 miRNA,如 miR-17-92、miR-143/145、miR-204、miR-214、miR-21和miR-130/301等在调节PAH相关信号通路和病理发展中发挥重要调控作用,使得miRs逐渐成为临床上预测和治疗PAH的新思路。前期分析发现,在PAH病理组织测序miRNA表达芯片,与对照组相比,PAH组中miR-508-3p呈显著低表达。这提示miR-508-3p可能参与调节抑制PAH相关的信号通路和疾病发展。通过研究PAH病理组织测序mRNA微阵列,我们发现在PAH组中,NR4A3（nuclear receptor subfamily 4 A3）表达量与对照组中相比显著增高,表示NR4A3过表达可能促进PAH疾病进展。先前研究发现,miR-508-3p抑制卵巢癌、肾透明细胞癌的癌细胞增殖和迁移能力,可作为抗癌的生物标志物,生物信息学研究提示miR-508-3p与NR4A3的31-UTR有直接结合配对的碱基序列,这提示miR-508-3p可能直接调节NR4A3发挥功能。然而,miR-508-3p在PAH中的研究十分有限,miR-508-3p能否通过影响肺动脉血管平滑肌细胞（pulmonary arterial smoothmuscle cell,PASMC）增殖、迁移以及作用于NR4A3,从而调节PASMC的功能和影响PAH发展仍需探讨。本课题提出如下假说:在PASMC中过表达miR-508-3p并下调NR4A3表达致使PASMC增殖和迁移能力降低,从而起到抑制PAH发生。本研究将通过构建MCT-PAH大鼠模型,验证NR4A3表达变化。同时,通过miR-508-3p mimics/inhibitor分别模拟miR-508-3p过表达和敲低在人源肺动脉血管平滑肌细胞（human-derive PASMC,h-PASMC）上探讨 miR-508-3p-NR4A3 通路的调控机理,为寻找治疗PAH新分子提供在体和体外实验证据支持。2研究目的（1）研究miR-508-3p在h-PASMC表达和调节h-PASMC的作用及机制;（2）研究miR-508-3p-NR4A3在MCT-PAH大鼠和h-PASMC的作用及机制。3研究方法3.1 PAH组织样本基因表达微阵列和miRNA表达矩阵分析Gene Expression Omnibus（GEO）平台获取两个PAH相关病理组织基因测序表达谱和两个miRNA表达矩阵,通过生物信息学途径得出差异基因和差异miRNA。构建miRNA-mRNA关系互作网络,筛出关键miRNA及靶基因。对两个基因表达谱进行基因富集分析,找出PAH疾病发展过程中的主要信号调节通路。3.2构建MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型SpragueDawley（SD）大鼠（平均体重为180±20g）分为两组,每组5只。实验组大鼠每只每天单次左下腹皮下注射MCT（60 mg/kg;C2401,Sigma-Aldrich）,连续注射3周。对照组的大鼠每天每只单次左下腹注射等量的生理盐水,连续注射3周。确认建模成功:3周后,大鼠麻醉后接呼吸机,分别测定平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure,mPAP）、右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）和右心室肥厚指数（Right ventricular hypertrophy index,RVHI）（计算方法:右心室厚度与左心室和室间隔厚度之和的比值,RV/（LV+S））。3.3细胞实验（1）miR-508-3p功能表达测定:血小板源生长因子-BB（PDGF-BB,GF149,Sigma-Aldrich,USA）刺激细胞后（对照组不加）,分别于0、6、12和24h抽提细胞总RNA,实时荧光聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定miR-508-3p表达量。（2）miR-508-3p转染:过表达组和抑制组分别转染miR-508-3pmimics和inhibitor。对照组不做处理,载体组加入等量转染试剂。（3）CCK-8实验:细胞分别转染miR-508-3p mimics和inhibitor,对照组不做任何处理,分别于1、2、4、8、12、24和48h测定细胞活性。（4）创伤愈合实验:细胞分别转染miR-508-3p mimics和inhibitor,对照组不做任何处理,分别于0和48h观察并测量痕道面积。（5）细胞免疫荧光实验:细胞分别转染miR-508-3p mimics和inhibitor,对照组不做任何处理。计算ki67/DAPI核比率（计算方法:ki67/（ki67+DAPI））。（6）双荧光素酶基因报告实验:证明NR4A3是miR-508-3p下游直接作用靶基因。3.4 Western blot在蛋白水平上检测NR4A3、GAPDH、Erk、p-Erk、Slug表达。3.5 qRT-PCR在 mRNA 水平上检测 miR-508-3p、miR-508-3p mimics、miR-508-3p inhibitor、NR4A3、GAPDH 表达。4实验结果4.1生物信息学方法筛出参与并调节PAH的关键miRNA及其靶基因从GEO中筛选得到了两个PAH相关基因表达芯片（GSE70456和GSE117261）和两个miRNA表达矩阵（GSE55427和GSE67597）。经过分析和筛选,我们得到185个差异表达基因（dysregulated expression genes,DEG）和172 个差异表达 miRNA（dysregulated expression miRNA,DEM）,通过蛋白互作关系（protein-protein interaction,PPI）和 miRNA-mRNA 调控网络,我们最终选定深入探究miR-508-3p和它下游的靶基因NR4A3在PAH疾病发展和信号调节中的角色。基因集富集分析的结果,主要围绕在MAPK/ERK（MEK）、mTOR 和 Toll-like receptor 信号通路（NES 分别为 1.81、1.62、1.59,P＜0.05）,表明了这些通路在PAH发生发展过程中起重要调控作用。4.2成功建立MCT-PAH大鼠模型PAH组5只大鼠,连续3周注射MCT。对照组5只大鼠,连续3周注射生理盐水。根据判定指标测量结果,PAH组大鼠的mPAP、RVSP和RVHI数值明显高于对照组大鼠的值,并且具有统计学差异（p＜0.01）。说明MCT诱导PAH大鼠模型建立成功。4.3细胞实验（1）PDGF-BB 刺激 h-PASMC 后,我们发现 miR-508-3p 表达量在 0、6、12和24h依次递减。（2）在转染miR-508-3p mimics条件下,与对照组相比,miR-508-3p表达量明显升高（p＜0.05）。转染 miR-508-3p inhibitor 明显抑制 miR-508-3p 表达（p＜0.05）。（3）CCK-8实验中,与对照组相比,转染miR-508-3p mimics抑制h-PASMC增殖,转染miR-508-3p inhibitor促进h-PASMC增殖（p＜0.05）。划痕结果表明,与对照组相比,细胞在转染miR-508-3p inhibitor情况下,迁移能力变强（p＜0.05）。（4）与对照组相比,h-PASMC转染miR-508-3p mimics后降低ki67的荧光强度和核比率,而细胞在miR-508-3p inhibitor处理后ki67荧光强度增强,ki67核比率上升（p＜0.05）。（5）在PAH组大鼠肺动脉血管组织中,NR4A3在蛋白和mRNA水平上都表现出高表达。双荧光素酶基因报告实验表明,细胞在转染miR-508-3p mimics时,与野生型NR4A3结合时荧光强度明显弱于与突变型NR4A3结合时荧光强度。在Western blot和mRNA水平上,我们发现细胞转染miR-508-3p mimics抑制NR4A3表达,细胞转染miR-508-3pinhibitor促进NR4A3表达,这些都证明miR-508-3p 直接作用于NR4A3（p＜0.05）。（6）PASMC 转染 miR-508-3p mimics 导致 p-Erk、slug 和 NR4A3 表达量降低,而 PASMC 转染 miR-508-3p inhibitor 升高 p-Erk、slug 和 NR4A3 表达量。补救实验（rescue experiment）证明,当NR4A3表达被选择性siRNA敲低,PASMC 转染 miR-508-3p mimics/inhibitor 得到相反结果。5结论（1）在PASMC中miR-508-3p低表达,而NR4A3表现出高表达,这与我们的生物信息学研究结果一致;（2）NR4A3是miR-508-3p下游直接作用靶点,miR-508-3p-NR4A3可能在人类PAH疾病发展和信号调节通路发挥作用;（3）miR-508-3p过表达抑制h-PASMC增殖和迁移以及直接调控NR4A3表达并激活MEK通路在PAH中发挥生物功能,可作为临床治疗PAH的新思路。

关键词：肺动脉高压;PASMC;miR-508-3p;NR4A3

学科专业：麻醉学

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ABSTRACT

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结论