乳链菌肽前体基因nisZ在乳酸乳球菌中的克隆和表达

乳链菌肽前体基因nisZ在乳酸乳球菌中的克隆和表达（通用2篇）

篇1：乳链菌肽前体基因nisZ在乳酸乳球菌中的克隆和表达

乳链菌肽前体基因(nisZ)在乳酸乳球菌中的克隆和表达

用PCR技术从克隆有完整乳链菌肽生物合成基因簇(来自于乳链菌肽高产菌株L.LactisAL2)的重组噬菌体λHJ-3中扩增了编码乳链菌肽的前体基因，与pMG36e连接得到重组质粒pHJ201，用电击转化法将pHJ201转化到L.Lactis NZ9800中，经活性测定和Tricine-SDS-AGE电泳证实乳链菌肽前体基因获得了功能表达。DNA序列分析表明乳链菌肽高产菌株L.lactis AL2产生的`是NisinZ。发现pHJ201在L.lactis NZ9800中有良好的稳定性。

作 者：陈秀珠 胡海菁 杨巍 还连栋 作者单位：中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室，北京 100080刊 名：遗传学报 ISTIC SCI PKU英文刊名：ACTA GENETICA SINICA年，卷(期)：28(3)分类号：Q933关键词：乳酸乳球菌 乳链菌肽前体基因 基因克隆 表达

篇2：乳链菌肽前体基因nisZ在乳酸乳球菌中的克隆和表达

关键词：九龙牦牛；葡萄糖转运蛋白；单羧酸转运蛋白；肌肉；低氧适应；基因表达

中图分类号：S823.8+52 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0029-03

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有的牛种，对高寒、低氧等恶劣生态环境有良好的适应性。低氧环境能导致细胞多种能量代谢通路的适应性变化，例如无氧酵解增加，单位葡萄糖产生的能量减少，进而导致细胞膜葡萄糖转运蛋白（GLUT）适应性增加。肌肉组织中最重要的GLUT家族成员包括GLUT1和GLUT4，其中GLUT4是肌肉和脂肪细胞中的主要葡萄糖转运蛋白^[1]，存在于细胞内，受胰岛素、运动和缺氧等因素影响^[2-3]。肌肉是产生乳酸的主要组织，氧化型肌纤维（红肌）和心肌能以乳酸为燃料分子为机体提供能量^[4]。在乳酸转运进入细胞的过程中，单羧酸转运蛋白（MCT）发挥重要作用。MCT有多个家族成员，其中，在肌肉中表达的主要有MCT1、MCT2和MCT4，在乳酸转运中发挥功能^[5-6]。MCT1在氧化型纤维中表达水平高，被认为在乳酸向细胞内转运中发挥重要的作用^[5]。Jurie等研究表明，低氧适应能使肌肉组织在能量代谢方面更依赖于葡萄糖^[7]。因此，分析GLUT、MCT基因序列及其组织表达规律，对认识动物低氧适应的分子机制是重要的切入点。目前，关于暂时性缺氧对GLUT、MCT基因表达影响的研究已有不少，但对于低氧驯化的牦牛组织中GLUT、MCT还未见报道。因此，试验假设长期的低氧适应可能导致牦牛GLUT、MCT基因序列或组织表达水平发生改变，重点分析九龙牦牛GLUT4、MCT1和MCT4的基因序列及其在肌肉中的表达特点，并与普通牛比较，以探索牦牛适应低氧环境的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

试验所用九龙牦牛（Bos grunniens）样品采自四川省甘孜州九龙县，其中，0.5岁犊牛6头，3.5～5.5岁牦牛10头，7～10岁牦牛8头。屠宰时，迅速采集背最长肌和股四头肌，用锡箔纸包好，置于液氮内带回实验室，-80 ℃保存备用。另外，从四川省青白江市某屠宰场采集6头成年黄牛背最长肌和股四头肌样本作为对照。

1.2 试剂及器材

主要仪器包括高速冷冻离心机（日立）、超声波破碎仪（Sonics）、分光光度计（Cary 50，Varian）、电动匀浆器（PT-1200E，Kinematica）、凝胶成像系统（Gel Doc 2000，Bio-Rad）。荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex TaqTM（2×）购自TaKaRa公司；反转录试剂盒购自MBI公司；2×LongTaq Mix、Trizol试剂均购自天根公司。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆测序

取RNA 8 μL，用Random hexamer引物按Fermentas反转录试剂盒说明书进行反转录。根据GenBank中普通牛GLUT4、MCT1和MCT4基因mRNA序列（序列号依次为AY458600、BC104598和NM_001109980），用Primer premier 5.0软件设计引物。GLUT4-F：5′-CTAAGACAAGATGCCGTCG-3′，GLUT4-R：5′-TCAGTCATGCTCATCTGG C-3′；MCT1-F：5′-CGAGCCGCGTATAACGAT-3′；MCT1-R：5′-CCACAGGTTCAAACTGGACTCT-3′，MCT4-F：5′-CTTGGAACAGCCTCTGTCA-3′，MCT4-R：5′-GAGCGTTGACGGTCTCTG-3′。预期片段长度：GLUT4为1 540 bp，MCT1为 1 574 bp，MCT4为1 483 bp。PCR反应体系：2×Long Taq Mix 12.5 μL，灭菌水 8.5 μL，正、反引物各1 μL，cDNA 2 μL。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃（GLUT4）/55 ℃（MCT1）/56 ℃（MCT4）1 min，72 ℃ 2 min，共40個循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经胶回收试剂盒纯化，按常规基因克隆技术进行克隆，每个基因的阳性克隆取3～5个菌液送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序。

1.4 定量PCR分析牦牛肌肉中GLUT4、MCT1和MCT4 mRNA 水平

根据获得的九龙牦牛3个基因的cDNA序列，用Primer Premier 5.0软件跨内含子设计引物。GLUT4-F1：5′-TGGGGACACTCAATCAACT-3′；GLUT4-R1：5′-TCAGCCAACACCTCAGACA-3′，MCT1-F1：5′-AAACGCTGATGGACCTTG-3′；MCT1-R2：5′-TATGCCACATGCCCAGTA-3′；MCT4-F1：5′-GTCCACTGCCAGCAACTAC-3′，MCT4-R1：5′-AGCACCAGCACAAGGGA-3′。内参基因的引物根据GenBank中普通牛GAPDH序列（NM_001034034）设计，GAPDH-F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，GAPDH-R：5′-TCATAAGTCCCTCCACGAT-3′。根据荧光定量PCR试剂盒说明配制20 μL的反应体系，其中，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃（GLUT4、GAPDH）/62 ℃（MCT1、MCT4）10 s，72 ℃ 30 s，共45个循环。采用目的基因、内参基因的质粒作为标准品，制作标准曲线，目的基因的表达水平用内参基因校正。

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1.5 肌肉组织LDH总活力及其同工酶谱分析

准确称取0.2 g肌肉组织，加匀浆液（含10 mmol/L Tris、pH值为8.0，0.25 mol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA）2.8 mL，用电动匀浆器在冰上匀浆30 s，取1 mL以转速10 000 g于4 ℃离心10 min，参照Marchat等方法^[8]测定上清液LDH活力。酶活力的定义为：在25 ℃条件下，1 g新鲜组织1 min催化 1 μmol 底物转化为1个单位。LDH同工酶采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，酶活性染色^[9]。

2 结果与分析

2.1 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆测序

采用RT-PCR方法扩增九龙牦牛背最长肌的GLUT4、MCT1和MCT4基因，均得到1条特异的扩增条带，并分别均与预期分子量大小相符（图略）。测序结果证实得到了GLUT4、MCT1和MCT4等3个基因的编码序列（CDS序列），并提交GenBank。

由表1可见，牦牛GLUT4基因（HM055486）CDS全长 1 530 bp，编码509个氨基酸，与普通牛相比有5个碱基差异和1个氨基酸差异，牦牛第293位为Val（缬氨酸），而普通牛为Met（甲硫氨酸），核苷酸和氨基酸相似性分别为99.67%和99.8%；牦牛MCT1基因（HM061149）CDS全长1 506 bp，编码501个氨基酸，与普通牛相比有6个碱基差异和2个氨基酸差异，牦牛第325位、354位分别为Iso（异亮氨酸）、Val（缬氨酸），而普通牛分别为Val、Iso，核苷酸和氨基酸相似性均为99.6%；牦牛MCT4基因（HM583655）CDS全长 1 386 bp，编码460个氨基酸，与普通牛相比有6个碱基差异，核苷酸相似性为99.56%，但氨基酸序列完全相同。牦牛3个基因与普通牛的碱基差异类型主要是转换。

2.2 牦牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因的发育谱

3个目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR标准曲线扩增效率为94.5%～102.9%，符合分析要求。在牦牛背最长肌和股四头肌中，GLUT4、MCT1、MCT4 mRNA水平在各年龄段（0.5、3.5～5.5、7～10岁）均无显著差异。

2.3 牦牛与黄牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因表达比较

实时荧光定量PCR分析显示，成年九龙牦牛（n=10）与黄牛（n=8）背最长肌中，GLUT4、MCT4 mRNA水平无差别，MCT1 mRNA水平黄牛显著高于牦牛（P<0.05，图1）；而在股四头肌中，GLUT4、MCT1、MCT4的mRNA水平均未见显著差异。

2.4 肌肉組织LDH活力和酶谱

试验结果表明，牦牛背最长肌中LDH总活力显著高于黄牛[牦牛（510±30） U/mg，黄牛（407±35） U/mg]，而腿肌中LDH总活力接近[牦牛（305±31） U/mg，黄牛（282±47） U/mg]。由图2可见，牦牛背最长肌中LDH5的比例显著高于黄牛，而LDH2比例极显著低于黄牛。股四头肌中LDH同工酶比例无显著差异。

3 结论与讨论

酸序列及推导的氨基酸序列与普通牛相似性很高，均在99.5%以上，与其他很多功能基因研究结果^[10-11]一致，这也说明牦牛与普通牛的亲缘关系很近。牦牛和普通牛存在氨基酸差异的有2个基因GlUT4和MCT1，存在差异的氨基酸性质相似（Val、Iso、Met），推测这些氨基酸的变化对相应载体蛋白功能影响很小，GlUT4、MCT1和MCT4基因序列具有保守性。

年龄增长的变化趋势，发现在骨骼肌中MCT1和MCT4 mRNA水平随年龄增加而发生不同程度的改变^[12]；Kirat等研究发现MCT1在成年牛肝脏的表达量极显著高于犊牛^[13]。本试验结果与Hatta等研究结论存在差异，原因尚不清楚。

有关低氧刺激对GLUT、MCT基因表达影响的研究已有很多报道。Wood等研究发现，低氧能提高人的脂肪细胞GLUT1水平，但不会改变GLUT4水平^[14]。Ullah等研究了体外培养的细胞（HeLa、COS、HL-1）中MCT1、 MCT2、MCT4对缺氧刺激的反应，结果表明，MCT4 mRNA和蛋白质表达水平均增加，MCT1和MCT2水平未见变化^[15]。本研究中由于牦牛对低氧的长期驯化，相关能量代谢机制可能与暂时性缺氧有所不同。

MCT1在氧化型纤维中表达水平高，帮助乳酸向细胞内转运，参与乳酸的氧化利用^[5]。McCullagh等研究了MCT1的表达，证实MCT1在红肌的表达与肌肉中乳酸吸收相关，与柠檬酸合成酶活性呈相关（肌肉氧化能力的标志），这说明MCT1能促进肌纤维细胞对乳酸的吸收，与LDH（心型）及氧化代谢相关酶协同表达^[16]。由于LDH参与无氧酵解，而且LDH5倾向于将丙酮酸还原成乳酸^[17]。九龙牦牛背最长肌中MCT1 mRNA表达量显著低于黄牛，背最长肌中LDH总活力、LDH5比例显著高于黄牛，这说明牦牛背最长肌糖代谢中乳酸的氧化低于黄牛，更倾向于无氧酵解，与牦牛生活环境中的氧含量是相适应的。然而，由于肌肉组织中可表达多种MCT^[18]，因此，牦牛和黄牛对乳酸的利用及其转运的分子基础比较，需要更加精细和全面的分析。

本试验结果初步表明，牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因序列与普通牛相似性高；与普通牛比较，牦牛背最长肌中较低的MCT1 mRNA水平与其较强的无氧代谢能力相吻合，可能是牦牛从分子水平上适应低氧环境的表现之一。

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