多基因（精选9篇）
篇1：多基因
多基因离散性状QTL连锁分析方法
动物中有许多重要的`离散性状,与常规的数量性状类似,其遗传基础受多基因控制并受到环境因子的修饰.由于多基因离散性状的表型特殊性,利用常规的QTL连锁分析方法很难获得理想的统计效果,相应地发展了许多基于广义线性模型框架内的非线性方法.文章就目前离散性状的QTL连锁分析方法作简要综述,并对可预期的改进方法进行了展望.
作 者：殷宗俊 张勤 YIN Zong-Jun ZHANG Qin 作者单位：殷宗俊,YIN Zong-Jun(安徽农业大学动物科技学院,合肥,230036;中国农业大学动物科技学院,北京,100094)
张勤,ZHANG Qin(中国农业大学动物科技学院,北京,100094)
刊 名：遗传 ISTIC PKU英文刊名：HEREDITAS(BEIJING)年，卷(期)：200628(5)分类号：Q3关键词：离散性状 QTL 连锁分析 广义线性方法
篇2：多基因
Pareto基因算法多目标翼型优化设计
基于Pareto 最优解的定义,通过构造新型的联赛式选择复制等算子而发展了一种适合于求解多目标优化设计的Pareto基因算法.通过等级法来正确识别每一代中近Pareto波阵面的解,从而消除选择误差达到快速收敛的目的.为提高解的`分布性:采用小生境技术解决了基因材料多样性损失问题;采用常规实数编码方式配合平均交叉算子解决了编码端点效应问题.将所发展的方法应用于多目标翼型优化设计中,获得了理想的Pareto波阵面,为决策者提供了一个可选的有效解数据库.
作 者：隋洪涛 陈红全 黄明恪 作者单位：南京航空航天大学,601教研室,江苏,南京,210016刊 名：航空学报 ISTIC EI PKU英文刊名：ACTA AERONAUTICA ET ASTRONAUTICA SINICA年，卷(期)：23(2)分类号：V224关键词：基因算法 Pareto最优解 多目标优化设计 翼型
篇3：多基因
通过这样一次性的多基因转化,多个基因一般可整合在受体染色体的一个遗传位点上。转化后可根据与其连锁的选择标记基因进行简单方便的筛选。但目前所构建的多基因抗虫载体多以潮霉素抗性基因(hpt)作为筛选标记基因,其安全性受到一部分人的质疑。而抗除草剂基因不仅可以使作物获得除草剂抗性而方便除草,也方便在田间对其它目的基因的跟踪和选择,在水稻杂种优势中还具有特殊用途[9],如进行机械化制种、快速鉴定杂种纯度和克服两系法不育系育性不稳定的缺点,并且本身的安全性得到了广泛认同,已经应用于商业化生产,如转Epsps基因大豆[10]、转Bar基因水稻[11]等。本研究以抗除草剂基因Epsps为筛选标记,构建了含有3个抗虫基因(PinⅡ、Bt、GNA)的表达载体,同时在载体构建中对大分子的连接方法进行了全面的比较及优化。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
质粒pRSSGNA(含GNA基因)、pKC-3(含PinⅡ、Bt、GNA基因)由中山大学李宝建教授提供。pTSM(含除草剂基因Epsps)由中山大学徐培林教授提供。质粒pCAMBIA1300由澳大利亚国际分子生物学农业应用中心(CAMBIA)提供。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由本实验室保存。
1.1.2 试剂:
限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ、HindⅢ,T4 DNA连接酶、碱性磷酸酶(CIAP)、DNA凝胶回收试剂盒购自Takara公司;PCR反应所需要的Taq DNA聚合酶和dNTP等各种试剂,RNaseA酶等购自TIANGEN公司;抗生素卡那霉素(Kanamycin,Kan)、氨苄青霉素(Ampcillin, Amp)等其他试剂购自Sigma公司。
1.1.3 实验仪器:
恒温水浴槽,高压灭菌锅,WH-1微型旋涡混合仪,磁力搅拌器,PCR仪,低温高速离心机,小型台式离心机,控温摇床,小型低温恒温器,DYY-6B型电泳仪, DYCP-31D型琼脂糖水平电泳槽,紫外分析仪,超净工作台,电子天平,艾科浦纯化水机,低温冰箱,超低温冰箱等。
1.1.4 培养基:
LB液体培养基配制(1L):在800mL去离子水中加入胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g。完全溶解后用1mol/L NaOH调pH7.0, 再加入去离子水定容至总体积1L,20min高压灭菌即可。LB固体培养基则在高压灭菌前加入15g琼脂粉。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA的提取,限制性内切酶的酶切,琼脂糖凝胶电泳,DNA片段的回收、连接、转化、筛选和鉴定方法参考文献[12,13]。
1.2.2 连接反应中的各组试验对比方案设计:试验共设置一次连接(No.1)和二次连接(No.2)2组方案;每组方案根据载体片段的浓度大小设置2个处理:处理1(0.1μg)和处理2(0.5μg);每个处理下设置4个水平:①目的片段和载体片段摩尔比为3∶1;②目的片段和载体片段摩尔比为4∶1;③目的片段和载体片段摩尔比为8∶1;④目的片段和载体片段摩尔比为10∶1。每个水平重复2次。分析数据来源于DNA片段连接转化后在相应LB固体平板上鉴定成功的正确转化子数目的转化率。
1.2.3 大分子连接方法的优化:二次连接法按文献[4,14]方法进行。一次连接法优化为:50μl反应体系中只进行一次连接反应,加入载体DNA片段(经过CIAP完全处理)0.1μg(0.5μg),加入的外源DNA量与载体DNA片段的摩尔比在3:1到4:1之间,16℃连接过夜,取20μl连接产物直接用于大肠杆菌转化。
1.2.4 PCR扩增和鉴定基因的引物序列为:
TSP基因:Primer 1: 5'-CGCGGATCCATGGCACAGATTAG-CATG-3',
Primer 2: 5'-CATGCCATGGTCTGTGCAGTGACCACTGAT-3'。扩增片段长度为220bp。
aroAM12基因:Primer 1: 5'-CATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3',
Primer 2: 5'-CGCGGATCCTTAGCAGGCTACTCATTC-3'。扩增片段长度为1.3kb。
Bt基因: Primer 1: 5'-GAAGGATTGAGCAATCTCTA-3',
Primer 2: 5'-CAATCAGCCTAGTAAGGTCG-3'。扩增片段长度为300bp。
PCR反应体系为:DNA模板50ng;上下游引物各1μmol;10×PCR反应缓冲液2μl;dNTP(10mmol/L) 0.4μl;Taq酶(3U/μl) 0.2μl;双蒸水补齐至20μl。
2 结果与分析
2.1 中间载体pCTSM1300的构建
用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切pTSM,回收大小为2 320bp的CaMV35s-TSP-Epsps目的片断,与pCAMBIA1300用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后的载体大片段相连接得载体pCTSM1300。转化大肠杆菌培养后提取该质粒,用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切验证表明载体构建正确(图1第2和第3泳道)。
2.2 中间载体pCT-PinⅡ-1的构建
用KpnⅠ/HindⅢ双酶切pKC-3,回收大小为3 000bp完整的PinII片段(含PinⅡ启动子,Act1内含子和PinII终止子);与pCTSM1300用KpnⅠ/ HindⅢ双酶切后的载体大片段连接得中间载体pCT-PinⅡ-1。用KpnⅠ/HindⅢ酶切验证该质粒表明pCT-PinⅡ-1载体构建正确(图1第5泳道)。
2.3 中间载体pCT-Bt-2的构建
用HindⅢ酶切pKC-3,回收大小为4500bp完整的Bt CryI(A)结构基因片段(包含Act1启动子和NOS终止子);与pCT-PinⅡ-1用HindⅢ酶切后回收的载体大片断(CIAP处理完全)相连接得中间载体pCT-Bt-2。用HindⅢ酶切鉴定是否连接上(图1第7泳道);用KpnⅠ+XhoⅠ酶切鉴定方向,若切出大小为7 500bp、7 000bp及2 300bp的三条片断(图2第3泳道),则为正向连接;若切出大小为11 000bp、3 500bp及2 300bp的三条片断则为反向连接(图3第2泳道)。
2.4 载体pCTSK的构建
用KpnⅠ酶切pRSs1GNA,回收大小为8 200bp的完整片段(包含PRSs1启动子,IVS-1内含子和NOS终止子),与中间载体pCT-Bt-2用KpnⅠ酶切后的载体大片段(CIAP处理完全)相连接,得到新载体pCTSK。用KpnⅠ酶切鉴定是否连接上(图1 第10泳道); 用XhoⅠ+NruⅠ酶切鉴定方向,方法同2.3。用PCR法鉴定TSP、aroAM12和Bt基因的结果见图4和图5。载体构建流程见图7。
Lane 1:15kb DNA marker;Lane 2:pTSM EcoRⅠ+XhoⅠ;Lane 3:pCTSM1300 EcoRⅠ+XhoⅠ;Lane 4:pKC-3 KpnⅠ+HindⅢ;Lane 5:pCT-pinⅡ-1 KpnⅠ+HindⅢ;Lane 6:pCT-pinⅡ-1 HindⅢ;Lane7:pCT-Bt-2 HindⅢ;Lane 8:pCT-Bt-2 KpnⅠ;Lane 9:pRSs1GNAKpnⅠ;Lane 10:pCTSK KpnⅠ.
Lane 1:15kb DNAmarker;Lane 2:pCT-Bt-2 HindⅢ;Lane 3:pCT-Bt-2 KpnⅠ+XhoⅠ
Lane 1:pCT-Bt-2 HindⅢ;Lane 2:pCT-Bt-2 KpnⅠ+XhoⅠ;Lane 3:pCT-Bt-2 PstⅠ;Lane 4:15kb DNAmarker.
Lane 1:15kb DNAmarker;Lane 2 and Lane 3:Amplification fragment of TSPsequence(200bp);Lane 4 and Lane 5:Amplification fragment;of aroAM12gene(1.3kb).
Lane 1:DNAmarker;Lane 2:Amplification fragment in pKC-3(300bp);Lane 3:Amplification fragment in pCT-Bt-2(300bp);Lane 4:Amplification fragment in pCTSK(300bp).
2.5 大分子连接反应中的各组实验方案对比结果分析
在大分子DNA连接中,连接效率的高低受目的片段和载体片段的浓度和摩尔比的影响很大,过高和过低均不利于连接。本试验根据载体的量及其目的片段与载体片段的摩尔比设置两组试验处理,获得如下数据(表1)。
利用DPS数据处理系统,对表1数据进行单因素实验统计分析,结果显示每个处理下的不同水平(3∶1、4∶1、8∶1和10∶1)间存在显著性差异;进行二因素有重复试验统计分析,对每个连接方案(No.1或No.2)间2个处理(0.1μg或0.5μg)进行方差分析,以及对各个处理(0.1μg或0.5μg)间的2个连接方案(No.1或No.2)进行方差分析,两因素组成的各个组合的SSR检验结果显示:单个的处理(0.1μg或0.5μg)下的不同连接方案间或单独的连接方案(No.1或No.2)下的不同处理间均无显著性差异(表2)。
将上述两组方案数据获得的平均转化率绘制成柱形图(图6),从图中也直观的说明,无论用哪种连接方法,目的片段和载体片段的摩尔比在3∶1和4∶1时,得到目的转化子的转化效率均很高(平均转化率45%以上),且远高于摩尔比为8∶1和10∶1时,此时的载体浓度在2～10ng/μl之间,且均对实验结果无显著影响。以上数据表明,二次连接法的连接效率确实很高,这一点与谭德勇等[14]、范钦等[4]的实验结果也一致,但与文中优化的一次连接方案的连接效率相差无几。从试验试剂消耗、试验时间效率的出发点上来看,优化的一次连接方案显得更为高效、快捷。
注: No.1*、No.2*分别指一次连接方案和二次连接方案,C*表示重复。
3 讨论
草甘膦是一种高效、低毒的广谱除草剂,它通过竞争性抑制植物莽草酸代谢过程中磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶活性,阻断芳香族氨基酸的生物合成导致植株死亡[15]。aroAM12基因为来自鼠伤寒沙门氏杆菌中编码EPSP合成酶的突变基因,突变的EPSP合成酶对底物PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)的亲和力提高,对草甘膦亲和力下降,从而提高了对草甘膦的抗性[16]。2004年以来,全球种植的抗草甘膦转基因作物面积占全球转基因作物总种植面积的72%[17],主要以北美洲为主。虽然中国也已经开展了一系列有关研究,但目前为止还没有自主知识产权的商品化转基因抗草甘膦作物问世。研究证明,用aroAM12基因转化棉花、油菜和烟草,获得的转化植株的草甘膦抗性均有明显的提高[18,19,20];而且用来作为选择标记基因,可以减少使用潮霉素抗性基因所带来的安全性顾虑。这些均显示了该突变基因良好的应用前景。
目前将Epsps基因与多个抗虫基因连锁转入水稻的研究报道还未见报道。中山大学李宝健提出了应用多基因转化策略综合改良农作物的新思路,并将多基因载体通过基因枪或农杆菌转化法转入生产上具有实用意义的水稻受体中[21]。本文中构建的表达载体已经转入水稻光温敏核不育系中,以期在抗除草剂、抗虫水稻培育和杂交稻机械化制种中发挥重要作用,结果将另文报道。
在大分子DNA连接中,DNA连接的效率较低,连接效率的高低受目的片段和载体片段摩尔比的影响很大,过高和过低均不利于连接。为了克服这些矛盾,谭德勇等[14]采用二次连接法将两个质粒的大片段进行重组,使连接效率大大提高;范钦等[4]通过改良的二次连接法将多个载体大片段进行连接,成功的构建了多基因抗虫表达载体pKC-3。但是二次连接法存在程序烦琐、时间长、浓度不易控制等缺陷。为了避免二次连接法的繁琐,本试验通过优化连接片段间的摩尔比,将载体片段浓度控制在2～10ng/μl之间,摩尔比控制在3∶1～4∶1之间,通过一次连接同样提高了大分子连接的效率。
摘要：目的:为了获得水稻的广谱抗虫性,同时也避免由潮霉素抗性基因引起的安全性问题。构建以抗除草剂基因(Epsps基因)为筛选标记的多基因抗虫植物表达载体pCTSK。方法:以双元载体pCAMBIA1300为基础,将潮霉素抗性基因hpt替换成携带烟草叶绿体转运肽序列TSP的草甘膦抗性突变基因aroAM12(编码细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶Epsps)作为筛选标记基因,获得中间表达载体pCTSM1300。然后再连接上3个抗虫基因(马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryI(A)及雪花莲外源凝集素基因GNA)的完整表达片段(包含各自的启动子和终止子)。结果:通过PCR方法和酶切方法鉴定已成功地构建了该表达载体;通过不同实验方案的数据分析,得出在载体构建的大分子连接中优化的一次连接法连接效率高于二次连接法的结论。
篇4：多基因的复合体
从一只猴子说起将主角还给玄奘
很多人对玄奘的最初认识，都来自小说《西游记》和上世纪80年代同名电视剧，在小说和荧屏中，一只神通广大的猴子成了当仁不让的主角。《玄奘取经西游记》就从这个世人最耳熟能详、却让真实玄奘几乎被遗忘的角色说起，通过“一只猴子开始的传奇”、“圣僧是谁”、“僧人的生活”、“踏上西游的道路”、“佛陀的西天”、“皓首穷经的事业”等六个章节，生动形象地还原了一段比《西游记》更真实、更精彩、更稀奇的历史。
陈华胜延续了写三国志随笔“论述有趣、下笔有神”的文风特点，试图通过对玄奘西行的真实记录来揭开一个个不为人知的秘密。比如解析孙悟空的真实血统是由印度神猴哈奴曼演变而来；又如出身官宦之家的玄奘为什么要剃度出家?他与唐太宗真的是结拜兄弟?他到印度到底取的是哪一部经?再如玄奘带回来的657部梵文经卷最终如何让中国僧人看懂……陈华胜在叙述中借助了《西游记》普及的力量，所以读起来一点不累，让人轻松愉悦地重新掌握这段本已几近失真的历史。
玄奘取的是经卷读者长的是见识
陈华胜的作品一般不属于说书、一条线讲到底讲到透的性质，如易中天的《品三国》、钱文忠的《玄奘西游记》。我想这是因为他的脑子转得太快，思绪带着好动的跳跃性，因为他也是属猴的。他常说做学问就是“旁征博引，心骛八极”，所以《玄奘取经西游记》写着写着就成了一个不单单记录玄奘取经的“多基因复合体”。这并不出乎我的意料，或许也正是这个“多基因复合体”，成就了《玄奘取经西游记》最有别于同类题材书籍的优势所在。
解析孙悟空身世时提及印度神猴哈奴曼并不让人觉得奇怪，但是从60年代中国第一部合拍的儿童电影《风筝》开始，又引出福建泉州开元寺大殿西侧的“猴行者”浮雕，以及《山海经》里的无支祁，就真有点旁征博引了。在随后的章节中，由点及面的“多基因”更是层出不穷，如讲到陈祎(玄奘出家前的名字)身世时，甚至分析起隋朝与秦朝这两个朝代的各自异同，讲到隋朝的崇佛与唐初的重道则让人大长知识；从玄奘立誓“我愿意为佛奉献我自己”开始，又引出中国佛教的导入以及一些佛教知识，如百丈清规、佛教宗派等；在记录玄奘西行前，又“比玄奘先行一步”地先介绍了印度这个佛教起源地的风土人情以及佛教发展的大概历程；当“玄奘踏上西游道路”时，又记载了玄奘之前的取经僧以及玄奘之后的文化交流等等……此外，以“中秋为什么要吃月饼、看花灯”为代表的习俗知识、以克孜儿石窟、历史上最早的唐人街、女儿国为代表的地理知识、以神行太保的原形、拜火教等为代表的宗教知识穿插其间，让读者更为受用。加上150余幅印刷精美的珍贵历史图片，说这本书集历史、地理、人文、宗教、收藏等多学科于一身毫不为过。读者读的是历史知识，长的是历史见识。
陈华胜在后记中写道：“至于说到要写好一本玄奘的书，实在没有多少信心。只是想到这件事恐怕也是一件功德，不宜推诿，便硬了头皮应承下来，从此抱回一大堆高深莫测的唯识宗经典，临时抱佛脚地啃了起来。”我相信，对于作者的他，这绝对是一件功德，而对于读者的你和我，我觉得同样也是一件功德。玄奘已经点燃了一炷心香，通过对这名圣僧西行取经的真实解读，你和我的心香也开始袅袅生烟……
篇5：《基因突变和基因重组》教案
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一、教学目标
（一）知识与技能
.举例说明基因突变的概念、原因、特点；
2.举例说出基因重组；
3.说出基因突变和基因重组的意义。
（二）过程与方法
.学会数据处理，类比推理等科学方法；
2.培养学生自学能力，发散思维及综合能力。
（三）情感态度与价值
.在基因突变的学习中懂得生物界在丰富多彩的本质，从而进行辩证唯物主义的思想教育；
2.在基因突变的学习中懂得如何确立健康的生活方式；
3．引导学生从生物学角度对基因突变和基因重组作科学的了解，形成正确的科学价值观，激发学生的责任感。
二、教材分析
《基因突变和基因重组》是人教版高中生物必修二《遗传与进化》第5章第1节的教学内容，主要学习基因突变的概念、特点和原因，基因突变和基因重组的意义。
三、教学重点难点
、重点：
（1）．基因突变的概念及特点；
（2）．基因突变的原因。
2、难点：
基因突变和基因重组的比较。
四、学情分析
生物的变异现象对于学生而言并不陌生，通过初中生物课的学习学生已经初步认识到生物的变异与遗传物质和环境有关。本节在此基础上进一步引导学生学习遗传物质究竟是如何引起生物的变异的。
五、课时安排：1课时
六、教学程序设计
依据新课改”自主、合作、探究”的精神，按“学生是主体，教师是主导”的原则，以探究式教学方法为主线，利用学案导学，开展自主探究学习，让学生在讨论、探究、交流中相互启迪，获得新知，形成良好的学习习惯和学习方法。同时，教师充分利用现代声像技术及多媒体工具，借助多媒体动画，把基因突变的原因及类型和基因重组的原理直观地展示给学生，有利于学生由感性认识上升到理性认识。教师适时进行点拨，以帮助学生建构正确的知识结构，把课堂的主动权交给学生。
七、教学过程
教师组织和引导
学生活动
设计意图
创设情境，激发欲望
（5分钟）、多媒体展示水毛茛和果蝇的图片，设疑：
1、水毛茛裸露在空气中的叶和浸在水中的叶为什么表现出两种不同的形态？这种变异能遗传吗？
2、果蝇的白眼性状能遗传给后代吗？
2、导出生物体变异的类型（不可遗传变异和可遗传变异），并指出本节课学习的内容为可遗传变异中的基因突变和基因重组。
3、多媒体展示学习目标，并进行学习目标和课程标准的解读。、学生回顾生物体的表现型与基因型和环境之间的关系并思考相关问题。
2、通过学习，知晓生物体变异的类型以及本节课所要学习的内容。
3、明确本节内容和学习目标。
步步导入，激发学生的好奇心，主动地参与获取新知识，明确学习的相关内容和学习目标。
自主学习，组内讨论
探究1：基因突变（10分钟）、组织学生组内探讨基因突变的原因、特点，并进行小组展示。
2、多媒体展示镰刀型细胞贫血症的发病机理。并引导学生思考：碱基对的替换是否一定会引起生物体性状的改变？
3、复习豌豆的皱粒以及囊性纤维病的产生原因，提出问题引导学生进行分析，引出基因突变的概念。
4、拓展：人类ABo血型，让学生了解复等位基因。
5、对基因突变的意义进行引导，让学生懂得如何确立健康的生活方式。、通过学案上的知识梳理，组内讨论，形成统一认知进行小组展示。
2、观看多媒体展示的镰刀型细胞贫血症的发病机理并思考相关问题，回顾密码子的简并性。
3、小组讨论，总结基因突变的概念。
4、通过人类ABo血型的学习，掌握基因突变的不定向性。
5、理解基因突变的意义，并在以后的生活中树立正确的健康观念。
培养学生自主学习的能力，并体现学生的主体地位。
多媒体直观地展示给学生，有利于学生由感性认识上升到理性认识。
通过以前所学知识的回顾，帮助学生理解基因突变的类型和实例。
完成情感态度与价值观的目标。
自主学习，组内讨论
探究2：基因重组（10分钟）、组织学生组内探讨基因重组的类型、特点、实例并进行小组展示。
2、多媒体展示基因重组的类型及机理。
3、分析基因重组的意义。、通过学案上的知识梳理，组内讨论，形成统一认知进行小组展示。
2、观看多媒体展示。
3、知晓基因重组的意义。
培养学生自主学习的能力，并体现学生的主体地位。
班内交流，确定难点
（10分钟）、多媒体展现合作探究内容，倡导学生合作式学习、交流。
2、对于基因突变和基因重组的区别进行适时点拨，帮助学生理解。、合作交流，确定难点。
2、尝试构建表格分析基因突变和基因重组之间的区别。
培养学生发散思维及综合分析的能力，完成课标中的能力要求。
随堂练习，当堂反馈
（5分钟）
多媒体展示相关习题，由简单到复杂。
读题，思考与讨论，并进行解答。
、帮助学生对知识点进行巩固。
2、通过对学生练习结果的评价，了解学生对知识的掌握情况，以便确定下一步的补偿性学习的安排。
归纳总结，科学评价
（5分钟）、构建思维导图，帮助学生构建知识框架；
2、对本节课的小组表现进行科学评价，并评出最佳小组。
通过思维导图，构建知识框架，掌握相关知识。
科学评价有利于小组内学生之间的相互团结，培养学生团队合作的意识。
八、板书设计
5.1基因突变和基因重组
一、基因突变
、实例：
2、概念：碱基对的增添、缺失或替换
3、原因：外因、内因
4、特点：普遍性、随机性、不定向性、低频性、多害少利性
5、意义：变异的根本
二、基因重组、概念：控制不同性状的基因的重新组合2、类型：自由组合、交叉互换
3、意义：变异的丰富
三、基因突变与基因重组的区别
九、布置作业
固学案P31-32相关习题
十、教学反思
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篇6：《基因突变与基因重组》教学反思
生物必修二《基因突变与基因重组》一节重点是基因突变的概念、特点以及基因突变的原因。难点是基因突变和基因重组的意义。
在整个教学过程中，概念枯燥，学生参与的时间少，如何化繁为简用具体的、形象的实例去剖析概念，就成为突破本节难点的关键。对基因突变概念的理解和把握，我采用分析联系遗传学上的典型病例——镰刀形细胞贫血症进行突破，然后让学生总结，概括出基因突变的定义。采用资料分析的方法突破“基因突变的特点”，学生通过具体的资料，直观的得出结论，归纳出特点。关于基因突变的意义，通过简单的数学计算，分析基因突变为生物进化提供了原始材料。利用图示引导学生回忆减数第一次分裂过程中，基因重组是在什么时期发生的，如何发生的，有什么样的意义。最后针对本节课进行课堂小结，比较基因突变与基因重组，加深学生的印象。
本节课的不足之处在于分析基因突变特点过程中，没有用实例将基因突变的不定向性与随机性进行分析比较，学生理解起来困难。在讲解基因突变的类型时，由于很多同学前面的减数分裂知识的遗忘，导致对减数分裂过程中染色体行为的不理解，进而对基因重组发生的时间和类型的不理解。
篇7：基因突变和基因重组教学反思
在教学过程中，借助表格形式，将三种可遗传变异的概念、类型、特点、意义等进行了比较复习，既区分清楚了三种可遗传变异，也节约了复习时间。
在复习基因突变时，向学生补充了真核生物基因结构、原核生物基因结构以及真核生物和原核生物转录翻译过程的区别，这些知识的补充有利于帮助学生全面理解“基因发生突变后，生物的性状不一定改变”的原因。从学生反馈来看，补充知识所起的作用是很明显的。
由于基因工程内容在选修3教材中是重点知识，所以在本节课中只是简单复习了基因工程的原理、操作工具和四步操作流程，主要是要让学生理解，基因工程实质上也是一种基因重组形式。
篇8：抗菌肽多基因表达技术与策略
1 多基因共表达系统
多基因共表达系统是将2个或2个以上的单个相同或不同抗菌肽基因通过特定连接点或结构连接构建到特定的表达载体中形成高效表达系统。这样的表达构建,已经发展出多种多样的技术,对分子质量较小的抗菌肽表达很有价值。首先,无论对相同抗菌肽基因还是不同抗菌肽基因完整地构建在同一载体上,在数量上都实现了重复,一经表达,蛋白质的长度和重量就会得到增加。如果设计了分离、纯化水解点,表达的抗菌肽理论上应该是完整的,会随着抗菌肽基因数量增加来直接增加表达量的数倍,这样的基因表达称为融合表达,也可称为基因串联,其表达产物为肽聚合体(multimer)。如果设计的是有独立启动子调控表达单个基因的多个顺式作用元件串联在一起的多基因表达系统,则为多拷贝表达系统,它是提高产量的一种表达方法,在外源基因表达方面应用较多。
其次,在对表达的抗菌肽分子进行分离和鉴别时,由于表达量增加,无论是质粒中转录子mRNA还是翻译后的产物分离、提取和分析都在一定程度上降低难度、节约成本。此外,将具有多种不同抗菌活性的抗菌肽基因共同表达,有可能扩大抗菌肽的抗菌谱,增加抗菌肽的稳定性,并且得到具有多重抗菌活性的抗菌肽,将几个具有协同调控作用的相关基因共同表达,还有助于对外源蛋白表达进行综合调节。J.R.Shin等[1]将一个抗菌活性强,细胞毒性小的抗菌肽Buf IIIb与Lpp-Omp A串联,可以改善抗菌肽基因工程菌的生理代谢水平,降低抗菌肽表达产物对其宿主菌的毒性作用,有助于提高抗菌肽基因工程菌目标代谢产物的产量。
当然,表达产物的活性是否能达到预期,还与具体设计的方案和采用技术的不同而不同。如牛抗菌肽Bac7-Bac5-βdefense基因的串联构建,表达的产物只抑制大肠杆菌活性[2]。利用口蹄疫病毒2A将荧光蛋白d Tomato的基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中,再置于p PIC9K载体AOXI启动子的下游,构建出分泌型重组酵母表达载体p PIC9K-d Tomato-2A-3M,得到具有抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌活性的抗菌肽[3];鸡Av BD5-Av BD10双分子蛋白的抗菌活性高于Av BD5的活性[4]。
2 多基因共表达系统的种类
多基因共表达策略主要依靠启动子启动机制实现提高表达量的目的,而构建共表达体系是实现高效表达的基础。质粒共表达体系的构建常采用两种方法:第一种是由一个或多个启动子同时表达多个目的基因,形成单个表达盒系统;第二种是构建多个表达盒系统,即让每个表达盒都含有完整的独立表达单元。
2.1 单一启动子驱动的抗菌肽多基因表达
单一启动子驱动的多基因表达系统是将多个顺反子基因置于同一个或多个相同启动子控制之下,构建出含有相同表达单元的共表达体系。这种共表达对于表达数量较少的几个基因表达效率较高,在不同表达体系的研究中效果不同。从方法上研究,单一启动子驱动的表达系统比较简便、灵活、常见。单一启动子控制的抗菌肽表达在大肠杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌、植物及动物等生物中都有应用,以大肠杆菌为宿主的融合表达应用较多。尽管存在着位置效应,但是由于多数载体中含有增强子,最大限度避免了基因沉默的现象,这样的启动子主要有CMV、SV40、T7、p MC1、PGK、PIC等。
表达盒是一种模块元件,它可以赋予多个同样的顺反子在同一质粒中独立同向连接,组装后每个基因都带有各自独立的启动子、核糖体结合位点、终止子等一整套表达调控元件构成独立的表达子顺式元件,并将多个表达盒置于同一个表达载体构成由同一种启动子介导的多基因高效表达体系。由多表达盒构建出单个载体转化宿主后,可产生多种不同mRNA转录,进而翻译出蛋白,基因的表达相对独立,可以表达多个相同的蛋白单元,实现多个基因的共表达。这种表达避免了由一个启动子驱动多个基因而造成的基因表达不均衡,也能提高表达效率,该种方法用毕赤酵母的p PIC系质粒构建抗菌肽高效表达的情况比较多[5]。
2.2 两个以上的多启动子驱动的多基因表达
多启动子驱动的表达是由多个不同功能的启动子共处一个表达质粒进行调控表达的系统。它不仅可以同时从两个方向同时启动,也可以根据启动子的表达类型先后启动、同向或不同向启动抗菌肽表达。其主要目标是启动精确表达,强调表达控制的多样性、表达效率的高效性[6]。如原核细胞表达系统的种类较多,但应用抗菌肽表达的系统主要有λPRPL-PT7、CpxR/Cpx A系统[7]。真核表达系统的CMV、p GAP质粒均具有这样功能。目前,能够应用于抗菌肽表达的主要是p GAP系毕赤酵母系载体,是双启动子表达系统[8,9,10,11]。CMV作为穿梭质粒可以将荧光蛋白GFP与抗菌肽epinecidin-1融合在斑马鱼中表达[12]。双启动子表达系统一方面能够独立地启动两个独立的基因表达,并达到表达量高于单个启动子驱动两个基因的表达;另一方面双启动子表达系统能够分离融合标签和目标蛋白,可能有利于分离和纯化[13]。多启动子驱动的表达系统在自然界生物细胞内普遍存在,其中对原核表达系统研究与开发较多,主要应用于非抗菌肽外源蛋白表达,尚处表达系统开发阶段。
2.3 双质粒共表达
将两个不同外源基因分别构建到两个含有不同抗性的表达载体上,同时将这两个重组的表达质粒同时转入同一个宿主中进行蛋白的表达是双质粒共表达体系的核心内容。此技术的关键在于:两个共表达的质粒要携带相同的启动子、不同的抗性、不同的复制系统。双质粒共表达系统可分为两种,第一种是复制子相同的不兼容性的双质粒,另一种是复制子不同的兼容性的双质粒。复制子相同的不兼容质粒在大肠杆菌中应用较多,而复制子不同的载体很难找到。由于在大肠杆菌中可以共存复制子不同的相容双质粒,能够保证在传代培养的过程中质粒不丢失;因此,第二种方法在以大肠杆菌为宿主的原核表达系统中,具有很大的优势。目前,此表达系统对抗菌肽外源蛋白表达的应用未见报道。
3 多基因共表达策略
3.1 目标蛋白伴侣的基因设计
大多数生物细胞合成活性蛋白质时,是以前体蛋白质形式合成,其组成是目标肽基因片段前加上一段伴侣性的基因片段,后者亦称之为分子伴侣,即前导肽类片段。其作用是:可以有效增加小分子多肽的肽链长度,降低被蛋白酶降解的可能性;利用前导肽的折叠功能,降低小分子多肽对宿主菌毒性作用,形成的聚体空间结构可能会有效屏蔽单体产物毒性,如将一小段聚肽基因与抗菌肽基因串联,可以表达出包涵体的抗菌肽聚合体,融合蛋白产量占总蛋白产量的30%[14,15]。而将一段酸性肽基因与阳性抗菌肽连接成2基因串联融合子,共表达肽可以减轻抗菌肽毒性[16,17]。
目前商业化的表达载体多含有标签基因序列,或含有便于识别表达的多聚体,加上标签蛋白基因片段,更便于分离,如GSTtag、HIS tag、SUMO等,已经得到广泛使用[18]。此外,研究者在抗菌肽伴侣式基因设计时充分利用不同基因片段的功能。在以酵母为宿主的真核系统中,将猪β防御素2和猪γ干扰素(PBD-2和Po IFNγ)串联融合在一起,置于表达载体p PICZαA的控制下顺利表达,因表达产物活性受融合表达和重组基因肽链折叠的限制,未能表现出高抗菌活性[19]。而h Bmp4的前导肽与成熟肽在毕赤酵母中融合表达,表达后可直接获得成熟肽。
最近几年研究者们更趋向于自身抗菌肽片段融合表达形成聚肽的方法,来提高抗菌肽产量,同时达到降低对细胞毒性的设计。如Aloferon-1抗菌肽基因串联式表达,融合了14个Aloferon-1基因在p ET42a上[20],抗菌肽CM4在p ET32中构建最好是3个串联[21]。抗菌肽Buf IIIb与Lpp-Omp A串联时是以Buf IIIb重复基因与Lpp-Omp A形式串联,Lpp是一个脂蛋白,Omp A是一膜蛋白,当该基因串联表达后,由于属于分泌型的表达,Lpp-Omp A蛋白最后分泌出嵌在胞膜上,与膜蛋白Omp A相连的抗菌肽聚体Buf IIIb,且露出宿主菌胞膜表面,该蛋白聚体随着宿主菌进入可以裂解的环境条件下就会释放单体肽,发挥抗菌肽作用,而且这样的构建,能表达的菌株不需要进行蛋白质的分离纯化而释放出单体,就可以发挥抗菌功能,省去了分离纯化生产工序。
3.2 多基因融合表达的连接点设计
多基因表达产物无论是聚体形式存在,还是存在于活的细胞里,最终都是以单体形式发挥作用。尽管在抗菌肽的设计过程中使用融合技术实现了高通量表达,去除标签和前导肽再分离出单体肽的技术操作还是比较难[22]。单体抗菌肽能够释放一方面取决于其作用的靶标环境,另一方面能否释放还受制于自身单体间的连接点的结构与特性。若将多个相同或不同的目标基因序列直接首尾顺次连接,基因序列之间可能存在着空间位阻的排斥效应,容易造成串联基因的不稳定。因此,将多个目标基因序列中间彼此用一个仅起连接作用的柔性序列连接起来,构成串联基因序列是实现多聚体表达的前提。
为了便于串联成更多的蛋白质聚合体,又便于识别分离,一些研究者利用各种裂解特性的基因序列或氨基酸序列,如buforinⅡ基因与酸性肽基因连接点采用修饰magainin的干扰序列(MMIS)cys密码子,也可以在基因间设置甲酸识别序列以便在具体蛋白间有裂解蛋白序列[22,23]。Buf IIIb串联序列的裂解点是胃蛋白酶裂解点Leu编码序列,连接到每个单体的C端。胰蛋白酶能识别AAK序列,构建胰岛素A链和B链的裂解点采用了该片段,获得有活性的胰岛素[24]。用肠激酶作为抗菌肽裂解识别点的设计也收到一定效果,在抗菌肽PR-39和Protegrin-1(PG-1)串联融合表达时,构成的GST-PR-39-PG-1聚体肽就是使用肠激酶识别片段(NG)[25]。此外,抗菌肽多聚体的单体间也有用凝血因子Xa作为切割位点的识别序列[26],如抗菌肽Perinerin采用了凝血因子Xa作为切割位点的识别序列,通过切割获得活性肽[27]。王秀青等[27]通过Kex2(AAAAG)酶切位点将3个天蚕素抗菌肽的基因串联在一起并克隆入p PICZαA之上,通过SacⅠ线性化后电转入SMD1168中,经检测,串联体的表达量与单倍体比较明显增多,但是抑菌活性未呈现明显的倍数关系,分析可能与Kex2的酶切效率有关,或与载体表达条件、多聚体的串联数有关。研究表明,并非是串联单元数越多,蛋白的表达量就越高,抑菌活性增加,蛋白的表达量可能与基因的结构、宿主分泌蛋白的能力、串联数与表达载体的包含能力以及串联体数对基因结构的影响等因素有关,不同的抗菌肽最多能串联的数量和蛋白的表达量之间的关系尚没有相关数据说明。
3.3 构建多拷贝表达盒
构建多拷贝表达载体发挥作用的关键基因片段通常是同尾酶和互补非对称性黏性末端设计。表达盒构建的基本方法分为体内构建和体外多拷贝构建两种方法。
体外构建即是定向地体外构建多拷贝表达载体后,用抗性平板筛选多拷贝转化子的过程。即采用具有相同黏性末端的互为同尾酶的限制性内切酶来实现串联体的连接,可以随意增加基因的拷贝数。技术的关键在于:在目的基因的N端和C端分别设计并添加同尾酶,然后将目的基因整合入表达载体形成重组质粒,用此二酶与载体相应位置上的酶分别配对并酶切重组质粒,分别回收含有单拷贝基因的大片段和小片段进行连接,即可获得两拷贝的基因串联体,采用同样的方式可获得各种拷贝数的基因串联体。该方法具有低浓度抗性筛选和高定向性的双重优势。常使用的同尾酶有XbaⅠ和NheⅠ、Bam HⅠ和Bg IⅡ、AvrⅢ和PstⅠ、XbaⅠ和Nhe等。王婷婷等[28]通过PCR方法扩增家蝇Defensin的基因片段,将此目的片段整合入克隆载体,然后用一对同尾酶XbaⅠ和NheⅠ进行反复的酶切和连接产生多拷贝串联体,再将此串联体置甲醇酵母分泌表达载体p PIC9K中,最终获得了高达8拷贝数的串联体,实现了多个基因在一个质粒中的共表达,每个基因的表达都是独立的,这种表达方式可以回避基因中存在的常用限制性内切酶所带来的限制。
体内构建既是将表达载体一次性线性电转化后转入宿主菌,然后用抗性平板直接筛选不同拷贝数的转化子,是利用可自然产生多拷贝自融合串联体扩增系统的过程。如酵母系统中将携带的Zeocin或卡那霉素抗性的表达载体以及整个表达盒一起整合入毕赤酵母基因组中,然后通过高浓度的抗性筛选,筛选出的菌株高拷贝的可能性最大,毕赤酵母表达系统的载体多具有这样的功能。原核表达系统中进行基因多拷贝时采用T4连接酶和同尾酶,如合成P113基因时使用高保真Taq酶进行PCR扩增,由于模板为重复片段,在变性后退火时存在多种选择,经30~35轮循环后,产物为2至数百拷贝串联体的化合物,然后连接平端载体,可以筛选出含有10个拷贝数的串联重组体[29]。
表达盒串联是目前比较前沿的方法,由于共表达的基因含有独立的表达元件,会使表达单元串联的体积过大,影响表达效果。而且各个表达单元与载体携带的启动子不同,不同启动子之间可能会有不同程度的相互干扰。但对于不同启动子、靶细胞甚至是细胞克隆来说,干扰作用和程度也不是绝对的[30]。并非质粒中表达单元的数量越多表达量越高,有资料表明,多拷贝质粒构建少至两个多至上百个表达单元的情况均存在,表达量和表达单元数目之间不存在明确的倍数关系,其中表达单元能否表达可能与表达单元的数目和基因结构的稳定性有关[14],也可能与表达机制有关。如Z.Zhong等[31]构建了2,4,8拷贝的h BD2表达载体,发现2拷贝的表达量最高,可达760 mg/L。
4 小结
篇9：耳聋多遗传，基因可诊断
什么是耳聋基因？
我们每个人之所以生来不一样，都是由遗传决定的，而决定遗传的物质，就是基因。每个人拥有3万个左右的基因，这些基因控制着我们长多高、长什么样。同时，这些基因在家族中一代代传递，并且在传递的过程中可能发生变异，而变异的基因也可以传递，一些不好的基因传递下去就可能导致疾病。遗传性耳聋，就是由控制听力的基因出现问题导致的。先天性耳聋，除一半与围产期感染、新生儿黄疸、缺血缺氧性脑病等疾病因素有关外，另一半则主要与遗传有关，即耳聋基因出了问题。
什么是耳聋基因诊断？
耳聋基因诊断，就是利用一些实验技术，检测耳聋基因的分子结构是否出了问题，是多了还是少了，找出导致耳聋的变异基因，从而对耳聋的病因做出判断。此外，在耳聋基因诊断的基础上，通过抽羊水等方法提取胚胎或胎儿的基因，进行耳聋基因检测，根据检测结果可间接判断胎儿出生后是否患有耳聋，这就是耳聋的产前诊断。
哪些人要做耳聋基因诊断？
1.耳聋患者及其主要家庭成员
对耳聋患者进行基因诊断有助于明确耳聋病因，对患者家属进行耳聋基因检测有助于明确家庭成员耳聋基因突变的携带状态，便于在其婚育前提供科学的遗传咨询和指导。
2.育有耳聋孩子的正常听力父母
有些已经生育过耳聋孩子的正常听力父母，希望生育听力健康的下一代。此时，通过基因诊断，为其耳聋的孩子明确病因后，进一步对母亲腹中的胎儿进行产前诊断，根据诊断结果对其进行生育前指导等，可以避免此类家庭再次生育耳聋孩子。
3.拟应用氨基糖苷类药物治疗者
氨基糖苷类药物抗生素尽管有明确的耳毒性，但因具有价格低廉、临床起效快、不易产生耐药性等优点，临床应用仍较广泛。拟应用氨基糖苷类药物治疗者，可进行药物敏感线粒体突变的检测，筛查出敏感个体，并向患者及其母系成员发放用药卡片、给予用药指导，避免用药后耳聋的发生。
4.孕妇
在我国听力正常人群中，至少有6%的人携带耳聋突变基因。两个听力正常但同时携带同一突变基因的个体结合，有25%的可能生育聋儿。因此，对孕妇进行耳聋基因筛查，发现耳聋基因异常后，进一步对其配偶进行耳聋基因检测，可避免生育耳聋下一代。
5.新生儿
新生儿出生后，联合进行听力筛查与耳聋基因检测，对耳聋的早发现、早治疗具有重要意义。
听力自查小技能
我们在日常生活中听到的声音，都可以在这张听力图上找到对应的频率和强度范围。如鸟叫声，频率为3000～8000赫兹，强度为0～40分贝，属于高频率低强度的声音，所以有高频率听力损伤的人，就很难听到小鸟的叫声。电话铃声，频率为750～3000赫兹，强度为60～85分贝，属于中频率中等强度的声音，所以重度听力损伤的人，就听不到电话铃声。同理，人类的言语声也能在听力图上找到对应的频率和强度范围，其正常范围即听力图中的阴影部分（常见拼音发音），常被称作“言语香蕉图”。将自己的听力曲线与听力图相对应，就可以知道自己能听到哪些声音，而哪些声音则听不到或听不清。
专家简介
孔维佳华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科主任、耳鼻咽喉科学研究所所长、二级教授、博士生导师，中华医学会耳鼻咽喉科学会副主委，湖北省耳鼻咽喉科学会主委。擅长神经耳科和鼻颅底外科等疾病的诊断和手术治疗。名医门诊：周三上午（电话预约）