RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用（通用7篇）

篇1：RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

RNAi技术在转基因动物中的应用

RNAi可以作为一种有效的工具用来产生转录后沉默的效果,从而抑制特定基因的.表达,已经在线虫、果蝇、小鼠、大鼠等模式生物中得到成功应用.RNAi转基因小鼠的出现,使得在哺乳动物整体水平研究靶基因的敲低成为可能.文章以RNAi转基因小鼠为代表,就转基因载体的设计策略、基因敲除与基因敲低的比较、RNAi转基因动物的优势以及目前存在的缺陷等作一总结,并展望了RNAi转基因动物对功能基因组研究的贡献以及应用前景.

作 者：尹秀山 张令强 贺福初 YIN Xiu-Shan ZHANG Ling-Qiang HE Fu-Chu 作者单位：军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850刊 名：遗传 ISTIC PKU英文刊名：HEREDITAS(BEIJING)年，卷(期)：200628(3)分类号：Q3-3关键词：RNAi 转基因小鼠 基因打靶 模式生物

篇2：RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

RNAi在基因治疗中的应用

小RNA的作用与应用研究是近年生物学领域的研究热点,其核心技术RNA干扰(RNAi)是动物和植物界普遍存在的.一种防御反应,RNAi被细胞内出现的双链RNA(dsRNA)所激活,可以高度特异地抑制同源基因的表达[1-2],已经迅速而广泛地应用到基因功能,基因表达调控机制研究等热门领域,并为基因治疗开辟了新的途径.

作 者：尹凤媛 作者单位：青岛市市立医院,山东,青岛,266000刊 名：临床血液学杂志(输血与检验版)英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL HEMATOLOGY(BLOOD TRANSFUSION AND LABORATORY MEDICINE EDITION)年，卷(期)：22(4)分类号：Q343.1关键词：miRNAs siRNAs RNA干扰 基因治疗

篇3：RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

1 RNAi的发展史

RNAi在自然界中普遍存在,但其发现源于Guo等[1]将反义RNA技术特异地阻断秀丽线虫(Caenorhabdities elegans)中par-1基因的表达来研究其功能表型,当他们试图用正义RNA去增强par-1基因的表达时得到了预期相反的结论,当时的理论水平无法解释这种现象。直到3年后,Fire等[2]将正义RNA、反义RNA及两者混合物进行基因干扰实验,发现混合物的基因抑制效应是单独正义、反义RNA效应的10倍以上,并且实验证实真正有效的是dsRNA成分。他们把这一现象命名为RNAi。回顾10余年前,Jorgensen等[3]在植物中发现的共抑制(Cosuppression)现象及真菌中基因压制(Quelling)现象一样,RNAi现象被科学家认为是生物体中的基因沉默现象在不同物种的表现,并可能具有共同的分子机制。随后,在锥体虫、果蝇、斑马鱼、拟菌芥、脊椎动物等都发现存在RNAi现象。最近,Elbashir等[4]用人胚肾细胞、Hela细胞进行哺乳动物RNAi研究取得突破性进展。他们发现,具有对称性3’突出2bp的约2lbp小RNAs双链复合物(Small interfering RNAs duplex,siRNAs)可以诱导RNAi,而较长(>30bp)的dsRNA由于诱发细胞内干扰素系统,表现出广泛的非特异性阻抑效应。

RNAi的策略也不断取得进展,从最早给秀丽线虫生殖腺注射实现RNAi到体腔注射、肠细胞内注射,从给线虫喂食、在dsRNA溶液中浸泡到目前的电穿孔法、基因枪法、转基因技术的成功,都为RNAi技术的应用展示出新的前景。

2 RNAi的分子生物学机制

RNAi过程至少包括两个阶段[5]:(1)起始阶段;(2)效应阶段。也有不少学者认为有大致3个阶段,即其中还包括有siRNA扩增阶段。如今RNAi过程的具体机制尚不完全明白,但这并不影响人们充分利用这种基因沉默技术进行相关研究。

RNAi机制的最初成果来源于Hammilton等[6]在果蝇S2培养细胞成功建立了可重复性的RNAi实验,发现了RNA介导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)并分离提取,它能使具有同源序列的mRNA降解,分析其成分发现,复合物中有25nt大小的dsRNA及许多蛋白质,推测RNAi模式为:dsRNA分解成小片段RNA并形成RISC来特异性降解具有同源序列的mRNA。其后,Zamore等[7]也证实RISC的生物学活性。

RnaseⅢ家族中的Dicer酶在揭示RNAi现象中功不可没。Bernstein等[8]详细分析了长链dsRNA被裂解成siRNA的过程,参与反应的RnaseⅢ家族中的Dicer酶含有1个解旋酶结构域、1个PAZ结构域、1个dsRNA结合结构域和2个RnaseⅢ结构域。其中PAZ结构域是Argonaut基因家族的保守结构域,且每个种族的Dicer分子都不一样。dsRNA切割为siRNA具有种族差异性,能引起RNAi的siRNA共同结构为5’端具有磷酸基因,3’端为羟基,其末端可具有2~4个突出的碱基。

2001年,Lipardi等[9]通过蝇胚胎提取物的研究提出了一种siRNA复制扩增机制,即将同位素标记的siRNA加入新鲜胚胎提取物,结果在胚胎提取物中分离到同位素标记的dsRNA,由此证实此循环主要依赖RNA依赖RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP)催化,它可作模板并利用mRNA剪切物合成产生大量dsRNA。

综上所述,我们可以认为RNAi发生的一般机制为:(1)内源性及外源性dsRNA在细胞内与Dicer酶(RnaseⅢ家族)结合并裂解成siRNA。(2)siRNA与一些不明成分的蛋白质结合成RISC,作用于具有同源序列的mRNA并使其裂解。其中siRNA在RDRP催化下生成大量dsRNA加入下一轮RNAi循环,如此反复。

目前制备siRNA的方法主要有:(1)化学合成siRNA;(2)体外转录制备siRNA;(3)长片断dsRNA后用Dicer或者RNAseⅢ降解为siRNA库; (4)siRNA表达载体在细胞体内生成siRNA;(5)PCR扩增siRNA表达框并直接用于转染。

3 RNAi的特征

3.1 RNAi现象具有种族特异性 Barstead等[10]在dsRNA转染实验中发现,未分化胚胎干细胞RNAi现象明显,而分化胚胎细胞中则不明显或仅能检测到微弱的效应。Miyagishi等[11]利用U6启动子合成3’末端4个尿苷酸突出的siRNA基因沉默,实验证实siRNA效应依赖于靶序列,并与其二级结构RNA结合蛋白质存在与否有关。用与同一转录的不同靶区为模板可能产生不同的抑制水平。RnaseⅢ家族具有保守的序列也决定被裂解成的siRNA同样具有种族特异性。

3.2 RNAi具有高效率性 RDRP等类似物的存在使RNAi效应呈级量增长,比单纯用正义或反义RNA效应增强达数十倍之多。在线虫、西红柿、真菌、拟菌芥等生物中都发现了RDRP的同源物,并证实它们都参与RNAi。虽然在人体内未发现类似果蝇同源物,但可能有其替代物存在。让许多科学家感到欢欣鼓舞的是,极少量的dsRNA便可封闭整个基因。RNAi效应可由注射部位传递到整个机体并进入生殖腺,传递给子代[12]。

3.3 RNAi技术具高成功率 线虫全基因组于1998年测序完毕,大部分基因的功能是通过RNAi的方式进行破译的。50%~80%序列RNAi技术有效[13]。与反义核苷酸技术及基因敲除相比具有更简易、方便的特点。以前研究一个基因需要几个月的时间,但现在则只需数天时间。利用媒介合成的siRNA可使CHD1蛋白减少超过90%。RNAi可以非常简单地代替基因敲除来制备特定基因缺失表型的个体,并研究该基因的功能。

4 RNAi在哺乳动物中的应用

哺乳动物中导入dsRNA将引起严重的细胞毒性反应。后来,Tuschl证实链长短于30nt的dsRNA不含有非特异性抑制RNA的现象。Elbashir等[14]用人工合成的21ntRNA双链在体外培养的人胚肾293细胞及Hela细胞取得成功。随后在许多培养的人源、猴源、鼠源细胞均证实存在siRNA的RNAi效应[15]。这一切让人们想到是否直接在细胞内生成或体外制备siRNA便会引起RNAi现象。著名的Ambion公司及Operon公司都开始提供siRNA化学合成服务,它非常方便、简单、不受碱基的限制,但合成费用相当昂贵。哺乳动物细胞中基因内含子多,基因结构复杂,不同的siRNA效率不一,因此一般一个靶基因至少需要设计3~4对不同的siRNA进行试验,造成RNAi成本较高。许多研究小组开发表达载体如质粒,利用不同的启动子如PolⅢ-U6、T7合成dsRNA[16,17]。质粒可以复制扩增,可以克服低转染及基因沉默的瞬时性。哈佛大学开发的载体psilence 1.0-U6已经成功地在Hela、H 1299、U-20s和C-33A细胞中敲除了Cdk-2和LaminA/C的表达。科学家们证实,使用哺乳动物细胞中U6启动子去生成siRNA媒介不相同于PolⅢ,U6启动子不含有内源性A盒、B盒子,它直接转录出小片断RNA,3’末端有4个突出尿苷酸,且U6启动下游有针对靶基因的19nt的正义和反义核苷酸序列,它能自动生成双链siRNA,并免受细胞内核酸酶的降解,持续稳定地抑制靶基因。如今越来越多的载体用于构建siRNA,将载体转移到细胞内合成出siRNA,不但能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表达载体的细胞株中,siRNA能够长期发挥阻断基因的作用,如pSuper载体,Bluescript载体[18]等。

RNAi不但应用于哺乳动物细胞基因功能分析,而且通过载体在体内合成或体外转录的siRNA来调节,干扰基因表达进行治疗。许多研究表明,siRNA可有效地抑制HIV病毒在原代T淋巴细胞中的复制[19]。Novina等[20]特异性沉默了HIV-1细胞受体CD4、病毒结构蛋白Gag和调节蛋白的Nef。有研究者用siRNA预处理的人和鼠细胞能够抵抗病毒感染。最新发现脆性X染色体综合征与RNAi相关,也为人类分子遗传学开出一个新的领域——RNAi相关机制缺陷引发的疾病研究。在小鼠的胚胎细胞中也存在RNAi,将727个6p的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞,诱发了细胞内的RNAi并抑制靶基因的表达。

最近有很多研究小组设计出各种不同、已携带好目的片段、能转录出发卡样结构的RNA(shRNA)质粒和高效病毒载体,它们能使得基因功能的沉默持续性地表达。以应用较多的Ambion公司生产的P-sliencer质粒为例,在质粒载体中,首先要设计和筛选好需要的siRNA序列,然后通过化学合成的方法合成正义和反义模板链,中间用一段环序列隔开。 每个质粒都包含一个RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子和一个4~5个连续的T 构成的转录终止位点以及选择标记,选择PolⅢ是因为此启动子总是在距其一定距离的位置起始转录, 而遇到4~5个连续的T就终止转录, 并且能十分精确地终止于转录终止位点第二个碱基处。最常用的驱动产生siRNA的启动子是Mouse U6 promoter和Human H1 promoter。但是,在使用不同的细胞中,不同的启动子具有检测它们表达有活性的siRNA的能力。启动子的正确有效对于siRNA诱导的RNAi的细胞能提供最大化的基因沉默。为了使siRNA最优化表达,应当正确选用启动子。把先前设计好的目的片段插入到选择好的PolⅢ启动子的下段,然后转入细胞。在细胞内,环序列的设计能使得新生成的小RNA具有shRNA,这些小RNA能被Dicer酶切去发卡结构,使之具有19 对互补碱基,3’端各有2个U突出,能使得特定基因沉默。质粒还具有特异性分别针对细菌和真核生物细胞抗生素的抗性基因表达,通过它能够成功筛选出感受态细菌是否成功转化和观察到细胞是否成功转染,以便在后续实验中提取质粒和进行更进一步的实验。

相对于质粒,通过脂质体转染细胞效率低下,对细胞毒性较大,体内运用效果不佳,病毒转染目前成为一种比较理想和可行的RNAi的方法。以Ambion公司的pSilence adneo 1.0CMV病毒系统为例,此种病毒系统以改良后的腺病毒为载体,带有已设计好序列的siRNA,由于病毒对哺乳动物细胞的高亲和力,带有该目的片段的腺病毒能高效地与细胞结合,在病毒载体上改良过的巨细胞病毒(CMV)巨细胞启动子能够使shRNA高效率地表达,转染后早于72小时就能出现沉默效应。

5 RNAi在基因治疗方面的应用

5.1 RNAi与肿瘤的基因治疗 血管生成在肿瘤生长及转移过程中扮演着十分重要的角色。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成过程中起着关键作用。研究表明,使siRNA靶向作用于VEGF的mRNA,可以显著减少人前列腺癌细胞系PC3中VEGF的表达,从而使PC3细胞失去血管再生的功能[21]。RNAi在肿瘤疾病方面的体内试验报道近来也不断增加。研究表明,当裸鼠被移植了通过siRNA预作用而抗β-catenin的结肠淋巴肿瘤细胞,其存活期可以大大延长。另外,通过RNAi使致癌基因H-Ras发生沉默,可以抑制人的卵巢癌细胞在小鼠体内的生长[22]。胸苷酸合成酶(TS)是合成胸苷酸的十分重要的酶,抑制TS的活性可以导致DNA复制的抑制及细胞的凋亡。研究表明, RNAi可以作为一种降低TS水平的替代治疗方法[23]。Aloy等[24]对热休克蛋白27进行RNAi后,能提高放射治疗对肿瘤的敏感性。

5.2 RNAi与感染性疾病的基因治疗 RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止自私基因序列过量增殖等作用,因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物,并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。借助RNAi技术治疗病毒感染性疾病仍然是其主要疾病应用研究领域,艾滋病是人类应用RNAi技术进行治疗研究最早的疾病。RNAi可以直接和有效地抑制人类疾病相关RNA病毒的复制,研究主要集中在HIV-1[25]和丙型肝炎病毒(HCV)。此外也见于乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、疱疹病毒等。Novina等[26]用RNAi技术实现了HIV-1病毒的阻抑。McCaffrey等[27]将合成的双链RNA和通过载体将双链DNA形成shRNA直接注入鼠的肝脏,均可明显抑制HCV基因的表达。Song等[28]通过静脉注射Fas的siRNA成功减轻了小鼠Fas诱导的暴发性肝炎的发生。

5.3 RNAi与其他疾病的基因治疗 显性遗传疾病发生通常是由于一个等位基因突变造成的。特异性地去除突变的等位基因而保留正常的另一个等位基因以维持正常细胞功能,已经成为该疾病的治疗目标之一。三核苷酸CAG重复子的大量出现引起的多聚谷氨酰胺过量表达与多种神经性遗传疾病(如亨廷顿病、Kennedy综合征等)发生有关。最近,有学者[29]在培养细胞中通过设计三核苷酸CAG重复子的siRNA成功抑制了多聚谷氨酰胺的表达,这无疑为这些疾病的治疗提供了新思路。此外,有关RNAi技术在自身免疫性疾病、血液疾病的研究报道也越来越多。

5.4 RNAi基因治疗的优势 与传统的基因抑制工具相比, RNAi具有更强大、更持久的抑制基因表达的能力,如其效能是反义寡核苷酸的100到10000倍[30];具有高度的序列特异性,若与目的mRNA的序列不完全匹配,将会大大削弱RNAi基因沉默的效应,从而大大提高了其作用的安全性;无免疫原性,因而不会引起机体的免疫反应;不易被核糖核酸酶(RNase)降解,因此具有更强的稳定性;由于其无需同基因组整合发挥作用,因而无需进入细胞核内,也就不需要复杂的转移系统;另外,由于其体积小,可以使用一个转移系统同时转移多个siRNA分子靶向于不同mRNA,这就为治疗诸如癌症这类由多基因表达失调导致的疾病提供了可能[31]。与传统的小分子药物相比,首先,siRNA研发周期短;其次,RNAi的作用具有高度特异性,这就减少了发生毒副作用的可能性;再者,RNAi可以成为对抗耐药性的更加有效的方法。由于耐药性通常是由靶蛋白的编码基因发生点突变引起的,在这种情况下,很难针对每一个突变点分别设计合成一种新药,而且相应新药上市也需要很长时间,然而,siRNA分子可以被很快设计出来,靶向于突变位点,使之发生沉默[32]。

5.5 RNAi基因治疗存在的问题 (1)非特异性问题:siRNA在细胞内的非特异性作用会直接影响其安全性,研究表明,siRNA作用的特异性与其序列及其作用于mRNA的位点有关[22],因此,对于同一mRNA,应该检验多个与之具有序列同源性的siRNA片段对其的作用[32],并且应该将合成的序列和相应的基因组数据库进行比较,排除与其他编码序列具有同源性的siRNA,从而减少其非特异性作用,提高其作用的安全性。(2)体内转移问题:尽管在向体内转移siRNA方面取得了一定的进展,然而现有的载体系统是否可以安全、高效地向人体内转移siRNA片段,使之发挥预期作用,如病毒载体是否会诱发癌变,以及临床治疗时,反复多次的使用,是否会使机体产生免疫反应等,对于诸如此类问题,还需要临床和实验室的进一步观察和验证。(3)稳定性问题:尽管siRNA分子对核酶具有更高的抗降解能力,然而一些血浆中的核酶仍可将其降解。因此,目前许多研究试图通过采用化学修饰的方法来改善其稳定性。有研究表明,通过使siRNA与聚乙烯氨或胆固醇形成复合物的方法能改善siRNA的稳定性及其在体内的转移能力[22]。

6 展望

因为RNAi技术是一项快速、高效和便于操作的使靶基因失活的新技术,据此设计出的siRNA可以使某些特定的基因沉默。这是研究疾病机制和鉴定候选药物的关键步骤,也可为将来可控地打开或关闭某一特定基因奠定了基础。RNAi为疾病的基因治疗开辟了新途径,有望在将来成为一种高度特异的以核苷酸为基础的基因治疗技术,治疗肿瘤及其他某些疾病。尽管RNAi技术的研究具有广泛的应用前景,但目前仍在不断探索中,利用RNAi的方法来实现疾病的基因治疗仍尚需时日。

摘要：RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象。RNAi现象在各种生物中的普遍性引起了人们浓厚的兴趣。RNAi可能将成为基因治疗的新途径。

篇4：RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

摘 要：随着科技的发展,产生了一系列严重的环境污染问题，尤其是对水的污染。越来越多的废水难以用传统方法进行处理，而基因工程技术作为一项新技术，逐渐应用到废水处理中。基因工程技术是在DNA分子水平上按照人们的意愿进行的定向改造生物的新技术。本文介绍了基因工程技术的发展历程、基本原理，对该技术的特点及研究内容进行了说明，重点介绍了基因工程技术在废水处理中的应用，并对其发展趋势作了展望。

关键词：基因工程；原理；特点；废水处理；应用

1引言

众所周知，环境污染现已远远超出了自然界微生物的净化能力，尤其是在废水处理方面。如今生物法是废水处理的主要方法，但生物法也有其局限性，并且有些特殊污水用自然界中自然进化的微生物难于降解，而基因工程的引进开辟了培育高降解能力新品菌种的方法，利用基因工程技术检测微生物性状、提高微生物净化环境的能力是用于废水治理的一项关键技术[1]。

20世纪50年代初, 由于分子生物学和生物化学的发展, 对生物细胞核中存在的脱氧核糖核酸(DNA)的结构和功能有了比较清晰的阐述。20世纪70年代，Berg等首次用限制性内切酶EcoRI切割病毒SV40 DNA和λ噬菌体DNA，经过连接，组成重组DNA分子，宣告了基因工程的诞生[2]。这一技术发展到今天, 正形成产业化并列为世界领先专业技术领域之一, 广泛应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许多部门,并日益显示出其巨大的潜力, 将为世界面临的环境保护等问题的解决提供广阔的应用前景。

2基因工程技术概述

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术或DNA重组技术，是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法,按照人类的需要, 用DNA重组技术对生物基因组的结构或组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或对人类有益的生物性状[3]。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

2.1 基因工程技术的原理

基因工程技术是一种按照人们的构思和设计,在体外将一种生物的个别基因插入质粒或其他载体分子, 构成遗传物质的重组, 然后导入到原先没有这类分子的受体细胞内进行无性繁殖, 使重组基因在受体细胞内表达, 产生出人类所需要的基因产品的操作技术。或者说, 基因工程技术是在生物体外, 通过对一种生物的DNA分子进行人工剪切和拼接, 对生物的基因进行改造和重新组合, 再把它导入另一种生物的细胞里, 定向地改造生物的遗传性状, 产生出具有新的遗传特性的生物[4]。

2.2 基因工程技术的特征

(1)跨物种性

外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。(2)无性扩增

外源DNA在宿主细胞内可大量扩增和高水平表达。

2.3 基因工程技术的研究内容

一个完整的基因工程技术流程一般包括目的基因的获得、载体的制备、基因的转移、基因的表达、基因工程产品的分离提纯等过程。详细步骤和内容如下：(1)从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA片段；

(2)在体外, 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子；

(3)将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞), 并与之一起增殖；(4)从大量的细胞增殖群体中, 筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆；(5)从这些筛选出来的受体细胞克隆, 提取出已经得到扩增的目的基因, 供进一步分析研究使用；

(6)将目的基因克隆到表达载体上, 导入受体细胞, 使之在新的遗传背景下实现功能表达, 产生出人类所需要的物质[5]。

3基因工程技术在废水处理中的应用

随着环境污染的加剧，出现了很多用传统方法难以解决的问题，于是基因工程技术逐渐被应用到环境保护中，尤其在废水的处理方面。

3.1基因工程技术在污水检测中的应用

3.1.1 聚合酶链反应(PCR)技术在污水检测中的应用

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数(通常为25~30个循环)，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。这种技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。PCR技术的基础是只有在微生物特定核酸存在的条件下，重复性酶促DNA合成和扩增才能够发生。PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳来检验和纯化，也可以被用来克隆、转化和测序.在具体应用中往往采用经过修正的或与其它技术联合应用的PCR衍生技术，如RT-PCR、竞争PCR、PCR-DGGE、PCR-SSCP和巢式PCR等[6]。

PCR通过对待测DNA片段的特异性扩增，一方面作为菌株定性鉴定的重要手段，同时也为定性和定量研究微生物的群落特征提供帮助。自PCR技术问世以来，通过其自身的不断完善以及同其它相关技术的联用，在污水生物处理微生物的检测和鉴定方面得到了长足的发展，为该领域的研究提供了一个高效、灵敏、简便的研究工具。应用PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrphoreses)方法对环境微生物进行研究可以不经过培养，直接从样品中提取细菌的DNA，再将编码有16SrDNA的基因进行扩增。通过这种方法能够直接了解样品中微生物分布结构，并能大致比较相同条件下单一菌群的生物量。王峰等[7]采用PCR-DGGE技术来分析活性污泥与生物膜中微生物种群的结构，可以不经过常规培养而直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA；Marsh等[8]利用PCR-DGGE分析并获得了活性污泥中真核微生物的种群变化情况。以上的事实均说明，PCR-DGGE结合测序技术是一种完全可行的适于环境样品微生物研究的快速分析方法。

3.1.2 荧光原位杂交技术(FISH)技术在污水检测中的应用

荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，能够在自然的微生物环境中检测和鉴定不同的微生物个体，并提供污水处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。FISH技术的基本原理是通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号从而对未知的核酸序列进行检测[9]。

近年来，对污水处理的研究已经从简单研究污水处理的表征现象转移到更深入地研究活性污泥内部微生物种类及其特性。荧光原位杂交技术是一种微生物生态的研究技术，在测定过程中不破坏细胞、保持细胞形态完整，能够真实反映在自然环境下微生物的形态结构及分布状态。FISH技术的优势在于可以了解微生物在污泥中的数量、形态及分布状态等。虽然FISH技术在应用过程中还存在着一些问题，如：检测的假阳性、假阴性等。但是，目前FISH技术在不断发展完善的同时，已与其他分子生物技术相结合，这样更能反映出污水中微生物种群的多样性以及定量分析微生物种群在空间的动态变化[10]。

3.1.3 DNA重组技术在污水检测中的应用

DNA重组技术的实质是，将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。其基本程序是:外源DNA的获得；选择载体并进行处理；将目的DNA片段和处理后的载体连接；将连接产物导入合适的宿主细胞内，使重组DNA分子在宿主细胞内复制扩增；将转化菌落在平板培养基上培养成单个菌落，筛选获得含有重组DNA的阳性克隆[11]。在废水的处理过程中仅靠分离和筛选的功能性微生物是不够的。在混合的微生物群体中筛选特定的微生物菌种时往往得不到预期的结果；特定的微生物可能难以培养，从而无法应用到实际的生物反应器中；人类排放到环境中的污染物越来越复杂且难以处理。因此，有必要通过基因工程技术并根据具体的需要构建有效的基因工程菌或培育出可高效降解复杂多样的有害污染物的细菌来解决以上的问题。

3.2基因工程技术在有机废水处理中的应用

生物处理法是废水中有机污染物降解的主要方法，但是部分难降解有机污染物需要不同降解菌之间的协同代谢或共代谢等复杂机制才能最终得以降解,这无疑降低了污染物的降解效率。首先,污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程,对细菌来说这是一种不经济的营养方式；其次,某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性，对代谢活性有抑制作用；此外,将不同种属、来源的细菌的降解基因进行重组,把分属于不同菌体中的污染物代谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌,可以有效地提高微生物的降解能力。

刘春等[12]以生活污水为共基质,考察了基因工程菌在MBR和活性污泥反应器中对阿特拉津的生物强化处理效果,以及生物强化处理对污泥性状的影响。结果表明,基因工程菌在MBR中对阿特拉津具有很好的生物强化处理效果,阿特拉津平均出水浓度为0.84 mg/L,平均去除率为95%,最大去除负荷可以达到70mg/(L·d)。生物强化的MBR对生活污水中COD的平均去除率为71%,COD平均出水浓度65mg/L。

吕萍萍等[13]研究发现，克隆有苯降解过程中的关键基因——甲苯加双氧酶的基因工程菌E.coli.JM109(pKST11)对苯具有较高的降解效率和降解速度,应用于固定化细胞反应器中效果突出。在较短的水力停留时间内,可以将1500mg/L苯降解70%,降解速度为1.11mg/(L·s),延长水力停留时间,可以使去除率达到95%以上。该反应器对高浓度的苯具有突出的处理效果。同时所得到的产物为环己二烯双醇,可以被野生非高效菌W3快速利用。

3.3基因工程技术在重金属废水处理中的应用

处理重金属废水的传统方法有:中和沉淀法、化学沉淀法、氧化还原法、气浮法、电解法、蒸发和凝固法、离子交换法、吸附法、溶剂萃取法、液膜法、反渗透和电渗析法等。目前最常用的就是基因工程技术，它与传统的处理方法相比,具有以下优点[14]:(1)在低浓度下,金属可以被选择性地去除；(2)节能,处理效率高；(3)操作时的pH值和温度条件范围宽；(4)易于分离回收重金属；(5)吸附剂易再生利用；(6)对钙、镁离子吸附量少；

(7)投资小,运行费用低,无二次污染。

3.3.1基因工程菌强化生物化学法处理重金属废水

生物化学法指通过微生物处理含重金属废水,将可溶性离子转化为不溶性化合物而去除。硫酸盐生物还原法是一种典型生物化学法,该法是在厌氧条件下硫酸盐还原菌通过异化的硫酸盐还原作用,将硫酸盐还原成H2S,重金属离子和H2S反应生成溶解度很低的金属硫化物沉淀而被去除,同时H2SO4的还原作用可将SO42-转化为S2-而使废水的pH值升高,从而形成重金属的氢氧化物而沉淀。中国科学院成都生物研究所从电镀污泥、废水及下水道铁管内分离筛选出35株菌株,从中获得高效净化Cr(VI)复合功能菌。

袁建军等[15]利用构建的高选择型基因工程菌生物富集模拟电解废水中的汞离子,发现电解废水中其他组分的存在可以增大重组菌富集汞离子的作用速率,且该基因工程菌能在很宽的pH范围内有效地富集汞。但高浓度的重金属废水对微生物毒性大,故此法有一定的局限性,不过,可以通过遗传工程、驯化或构造出具有特殊功能的菌株,微生物处理重金属废水一定具有十分良好的应用前景。

3.3.2 基因工程强化生物絮凝法处理重金属废水

生物絮凝法是利用微生物或微生物产生的具有絮凝能力的代谢物进行絮凝沉淀的一种除污方法。生物絮凝剂又称第三代絮凝剂，是带电荷的生物大分子，主要有蛋白质、黏多糖、纤维素和核糖等。目前普遍接受的絮凝机理是离子键、氢键结合学说。前述硅酸盐细菌处理重金属废水可能的机理之一就是生物絮凝作用。目前对于硅酸盐细菌絮凝法的应用研究已有很多，有些已取得显著成果。运用基因工程技术，在菌体中表达金属结合蛋白分离后，再固定到某些惰性载体表面，可获得高富集容量絮凝剂[16]。

3.4基因工程菌在制药废水处理中的应用

化学合成制药废水中有机污染物浓度高、可生化性差且组分复杂, 属于难处理废水。利用基因工程技术构建高选择性基因工程菌可以提高微生物生物强化处理技术。因此，采用跨界融合技术，构建基因工程菌Xhhh处理制药废水，其出水水质可以达到《污水综合排放标准》GB 8978—1996 一级标准。运行结果表明，该工艺处理效果稳定高效[17]。

4结语 自2000年，国际上提出基于系统生物学原理的基因工程概念后，基因工程被应用于社会各个领域，并且手段日新月异。在环境领域当中，基因工程正迅速应用到废水检测和废水治理当中，培养出新的特效物种并进一步提高其应用效率、降低应用成本。随着分子生物学技术、环境工程检测技术的发展，并结合我们已经掌握的微生物群落结构和功能方面的知识,我们逐渐了解到污水生物处理系统中微生物群体的多样性、实际生存状态、功能特点,并更有效地对其加以开发和利用。此外，基因工程菌的出现，使以往的一些难降解有机废水、制药废水、石油废水、重金属污染废水以及其他有毒有害废水等都得到了有效地治理，还会实现废水资源化。当前，引入DNA扩增和其它生物技术的环境监测方法等将是基因工程技术研究的侧重方向。

基因工程技术作为一种新兴技术以极快的速度发展着。以下两方面的研究将对水资源的保护有重要意义。一是对基因工程菌的深入研究，如基因工程菌对污染物的代谢途径、控制目的基因表达的启动子基因序列、降解基因表达的调控条件的优化等方面的研究。二是对环境中微生物的习性及基因工程菌与环境中微生物和污染物之间的相互作用进行研究。从而使基因工程菌在治理有机物污染方面的实际应用成为可能。目前的研究主要是利用单一的基因工程菌对污染物进行处理,随着研究的不断深入,利用多种基因工程菌相结合对污染物进行处理,将对水资源保护起到更为重要的作用。

参考文献

篇5：RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

关键词：基因工程,基因芯片,植物胁迫应答

基因芯片是伴随人类基因组计划而发展起来的一种高新生物技术, 具有快速、高效、大规模、高容量、高度并行性等特点, 已成为目前国际上生命科学研究的热点之一。随着植物基因序列数据库迅速增长, 基因芯片已成为植物基因组学的主要手段之一。近几年, 采用基因芯片技术进行转基因植物表达谱分析的研究越来越广泛, 通过对差异基因生物信息学分析, 筛选与植物胁迫应答相关基因, 从而深入研究其在植物胁迫应答过程中调控机理。

1基因芯片的概念及分类

基因芯片是利用核酸杂交测序 (sequencing by hybridization, SBH) 原理, 在载体表面建立可寻址的高密度DNA分子微阵列, 通过与标记过的样品核酸序列互补匹配, 进行测序与大规模平行检测生物未知基因分子的有关信息。通过基因芯片技术可大规模、高通量地对成千上万条基因同时进行研究, 从而大大加快了基因研究的效率。基因芯片的种类较多, 根据DNA微阵列上的核酸序列长度, 基因芯片可分为两类:一类是cDNA 微阵列;另一类是寡聚核苷酸微阵列。根据基因芯片所用的载体材料不同, 可分为玻璃芯片、硅芯片、膜芯片、陶瓷芯片等;根据基因芯片制备方式不同, 可分为原位合成芯片、直接点样芯片、电定位芯片和三维芯片等。

2基因芯片实验设计

实验设计是基因芯片实验研究中重要的部分, 是芯片数据可靠的前提。由于基因芯片实验成本昂贵, 在进行实验时需严格设计和认真操作。实验设计中探针筛选、芯片选择、生物学重复次数对试验数据质量都有影响。基因芯片中荧光实验是利用标记了红色荧光Cy5和绿色荧光Cy3的两个样品同时与基因芯片进行杂交, 基因芯片上每一个点包括了这两种样品中相应mRNA的荧光信息, 通过比较两者的荧光信号强度计算相对表达量。因此, 其实验设计和常规比较试验思路是一致的。要得到可靠的生物学结论, 基因芯片实验在实际操作中至少应有三个重复。不必对同一个样品进行重复杂交分析, 但是必须要进行试验重复。

3基因芯片数据分析

基因芯片分析产生大量的数据, 需要专业统计学软件对整体表达情况进行分析。由于芯片实验中涉及许多不确定因素, 因此原始数据首先需经过归一化, 以消除由于系统变异引起的误差, 使得基因表达数据能够真实地反映测量样品的生物学差异。聚类分析是通过建立各种不同的数学模型, 把基于相似数据特征的变量或样本组合在一起。根据芯片中反映的转录因子基因的变化, 与其调节的下游响应基因进行联系分析, 对推测的关联性进行验证将有助于研究这些调控体系。

4基因芯片在植物胁迫应答基因功能研究中的应用

采用基因芯片技术分析干旱胁迫条件下, 小麦根中差异表达的基因。研究发现大部分脱水应答相关基因表达, 这与在其它物种和渗透胁迫研究中得到的结果相一致。通过芯片数据分析, 得到一个新的干旱胁迫诱导的AP2/ERF转录因子, 并且鉴定出一个干旱胁迫诱导的小分子蛋白LitP脂质转移酶。这些干旱胁迫相关基因的深入研究, 对提高小麦品种的抗旱性具有重要的意义[1]。Chujo等 (2007) 对超表达OsWRKY53水稻细胞进行基因组学分析, 发现明显上调防卫反应相关基因表达, 如PBZ1, PR14, Chitinase1, PR5, Chitinase2和Peroxidase。通过实时荧光定量RT-PCR验证这些基因表达量, 与基因芯片结果一致[2]。为了进一步阐明OsWRKY53在防卫反应中作用, 采用真菌病原M.grisea race 007分别侵染野生型和超表达OsWRKY53水稻, 转基因植株明显减轻病害症状, 提高了其对真菌的抗病性。拟南芥中DREB2C基因过表达, 提高了转基因植株耐热性, 进一步采用基因芯片和RT-PCR分析, DERB2C调控了热胁迫相关基因的表达, 且基因启动子区含有DRE/CRT元件[3]。组成型表达ZmEREB2A提高拟南芥植物抗旱性, 对超表达ZmEREB2A植株进行基因组学分析, 表明ZmEREB2A上调了LEA proteins和热胁迫相关基因的表达, 并且超表达ZmEREB2A提高转基因植物耐热性。因此, 可能ZmEREB2A在干旱胁迫和热胁迫过程中起到双重调节作用[4]。小麦HvCBF4基因在水稻植株中过表达, 提高其抗旱性、抗盐性和低温胁迫抗性。采用基因芯片分析转基因植株, 表明HvCBF4调控非生物胁迫相关基因, 如Lip5, Dip1, BBT1 和Jac2[5]。

5结论

基因芯片作为生物技术平台之一, 已成为植物基因功能研究中重要手段。然而, 基因芯片在植物基因功能分析中存在几个重要的问题。 (1) 基因芯片杂交的均一性, 完善同一方法操作的标准化。 (2) 增强基因芯片杂交的灵敏度。 (3) 基因芯片数据的生物信息学分析, 保证快速处理和分析杂交数据。在植物功能组学研究中, 通过基因芯片技术可以深入研究植物胁迫应答调节机理及代谢作用机理等。相信随着研究不断深入和技术的完善, 基因芯片在生命科学研究领域将发挥更加重要作用。

参考文献

[1]Mohammadi M, Kav NNV, Deyholos MK, Transcriptional profiling of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) roots identifies novel, degydration-responsive genes.Plant Cell Environ.2007 (30) :630-645.

[2]Chujo T, Takai R, Chiharu A, et al., Involvement of the elicitor-in-duced gene OsWRKY53 in the expression of defense-related genes in rice.Biochimica et Biophysica Acta.2007 (1769) :497-505.

[3]Lim CJ, Hwang JE, Chen H, et al., Overexpression of the Arabidopsis DRE/CRT-binding transcription factor DREB2C enhances thermotolerance.Biochem.Bioph.Res.Co.2007 (362) :431-436.

[4]Qin F, Kakimoto M, Sakuma Y, et al., Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L.Plant J.2007 (50) :54-69.

篇6：RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

1 RNAi技术的作用原理

RNAi是生物体的一种古老的防御机制, 广泛存在于线虫、真菌、植物体内。早在1990年, Jorgensen等[1]在通过转基因来增加矮牵牛花颜色时, 就发现导入的花色基因不仅不表达, 反而抑制了植物本身的部分基因表达, 即部分花色变成了白色, 当时称之为植物的共抑制现象。1995年, Guo[2]在以秀丽线虫胚胎的第一次卵裂来研究par-1基因功能时发现, 正义RNA具有与反义RNA同样阻断基因表达的作用。直到1998年, Fire[3]将反义链与正义链的混合物注入线虫发现能够有效地抑制特异基因的表达。由此开始了对dsRNA引发基因沉默的研究。此后, 许多实验证实, 当外源基因入侵宿主细胞, 并在宿主细胞内复制时, 所形成的dsRNA就会被特定酶降解为特定大小的作用因子, 后来称为小干涉RNA (small interference RNA, siRNA) , siRNA作为效应物反作用于与之互补的靶mRNA, 从而致使特定mRNA片段降解, 基因沉默。

RNAi作用机制研究表明, dsRNA引发的基因沉默可在转录水平、转录后水平、翻译水平以及染色质水平上实现。目前对于其机制研究得比较清楚且运用于抗病毒研究中的多为转录后水平抑制。RNAi的有效诱导是由dsRNA分子引发的。一般认为, dsRNA主要有3个来源:①为了特定的目的, 人工合成互补的RNA单链, 导入生物体内, 在体内互补成dsRNA, 或先在体外合成互补的dsRNA, 再导入生物体内;②病毒复制过程的中间体以及转座子反向重复序列形成;③细胞内单链RNA (single strands RNA, ssRNA) 在RNA依赖的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerases, RdRps) 作用下形成。对dsRNA降解中起关键作用的是Dicer酶, 它属于RNaseⅢ家族, 具有4个开放的阅读框, 即:一个螺旋酶区, 属于解旋酶超家族成员Ⅱ;一个PAZ结构域, 该结构域在Dicer酶中非常保守, 同时存在于与之有关的辅助因子中;两个RNaseⅢ催化区;一个dsRNA结合区。Dicer酶作用于dsRNA时, 以二聚体的形式存在。其催化结构域在dsRNA上反平行排列, 形成四个活性中心。作用过程中, 其中只有两侧两个位点具有核酸内切酶的活性, 在此处切断dsRNA, 形成siRNA。在Dicer酶及一些辅助因子的作用下, dsRNA被降解为21-25NT的siRNA。siRNA在3′端有2个突出的碱基, 增强了siRNA与靶序列的特异识别。5′端被磷酸化, 使其活性得以增强[5]。随后, siRNA被降解为正义链和反义链, 由反义链参与形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC) 作为RNAi的效应物。在RISC中含有反义siRNA核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶。RISC在siRNA的指导下与靶mRNA互补配对, 并使其降解, 从而导致特异基因沉默。同时, RNAi效应存在着一种信号放大机制, RISC中的反义RNA识别并结合于靶mRNA, 并以靶mRNA为模板在RdRPs催化下新合成dsRNA, 该dsRNA又可诱发下一轮的RNAi效应, 如此循环, 使沉默信号不断放大。

2 RNAi在抗病毒研究中的进展

2.1 RNAi在抗SARS中的应用

SARS病原体是一种新的冠状病毒, 是正链RNA病毒, 至今尚无针对此类病毒的特效药。而作为一种RNA病毒, SARS-cov是RNAi研究的理想材料。从理论上来说, 外源的SARS-cov RNA分子可在胞内形成dsRNA, 在Dicer酶的作用下, 诱发相应的mRNA降解。针对SARS病毒基因组M区、E区、N区、S区等, 应用计算机软件可设计出相应的siRNA, 采用载体体外转录合成相应的siRNA。目前的工作主要集中于siRNA的设计。郭骁才等[5]用自己编写的siRNA查找设计程序, 对来自Genbank的7个冠状病毒全基因序列进行了siRNA查找, 找到了449个侯选siRNA, 对这些侯选的siRNA的进一步筛选工作正在进行。Zhang Yong等[6]对编码SARS-cov的5个关键蛋白的基因进行了分析, 获得了348个侯选的siRNA。通过筛选的siRNA构建正确的重组载体, 转染能表达SARS-cov的细胞, 检测细胞中靶mRNA的蛋白表达抑制情况, 为抗SARS新药的研制提供了理论基础。

2.2 RNAi在抗HIV的研究中的应用

在抗HIV的研究中, RNAi是基于两条思路:一是抑制HIV相关基因和蛋白, 直接针对于HIV病毒mRNA, 设计siRNA使特异序列mRNA降解。Coburn[7]将与HIV末端重复序列同源的siRNA转入到感染HIV病毒的细胞中, 发现HIV表达降低30%～50%;二是针对HIV侵入细胞的受体CD4分子。Novina CD[8]用RNAi技术将编码CD4分子的mRNA降解, 以阻断HIV对CD4+细胞的感染。流式细胞仪结果表明, 75%的细胞CD4分子的表达减少;用Northen杂交表明, CD4分子的mRNA下降了8倍, HIV感染明显下降。由于CD4分子是一个重要的免疫分子, CD4分子的不表达将引起机体免疫功能的紊乱。因此作为HIV入侵的辅助受体CXCR4 (T细胞亲嗜性HIV受体) 和CCR5 (巨噬细胞亲嗜性HIV受体) 成了RNAi技术的理想靶点。Martinez等实验表明, 以CXCR4 siRNA转染CXCR4阳性的U87-CD4细胞, 48h后可观察到siRNA抑制CXCR4和CCR5的表达率分别为63%和48%。而这种抑制不影响CD4的正常功能。转染后的U87-CD4细胞再以HIV-1株多次攻击, 病毒的复制仍能被有效地抑制。

2.3 RNAi在抗HBV研究中的应用

HBV是一个DNA病毒, 其复制时, 在从前基因组RNA逆转录到DNA的环节上, 可用RNAi来阻断HBV mRNA的表达。通过构建能在真核细胞中表达siRNA的抑制性质粒, 能产生分别针对HBV的C基因和X基因区域的siRNA, 导入细胞后能取得明显的抑制效果。最近, 唐霓等[9]构建了HBV核心区的siRNA表达载体PSIHBV/C, 观察其对HBV复制和表达的影响。发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌。转染两天后, 抑制率达高峰, 分别为92%、85%。在体内, McCaffrey等用缺陷小鼠构建了HBV病毒血症模型, 然后设计相应的siRNA进行了治疗。与对照组相比, 其HBsAg的水平下降达84.5%, 而HBeAg的抑制达99%。这更进一步说明了RNAi在体内、体外均发挥着高效、特异的作用。

2.4 RNAi在抗HCV中的研究进展

HCV为单正链RNA病毒, 是RNAi研究的理想病毒模型。Kapadla等在对经过筛选的HCV的两个siRNA (NS3-1948和NS5B-6133) 和表达HCV的质粒共转染s1179I细胞。经检测, 转染两天后, RNAi的作用达到最强 (NS3-1948为5.7倍, NS5B-6133为8.3倍) 。此外, Mccaffref等在成年转基因小鼠体内导入针对HCV的非结构蛋白NSB5基因的siRNA, 观察到NSB5蛋白的融合蛋白表达被明显抑制。Randall等做了进一步的实验, 发现化学合成的NS4B siRNA对HCV蛋白及RNA也具有明显的抑制作用。转染4天后, 检测HCV RNA水平和NS5B蛋白表达下降了80倍, 且抑制效果能维持8天以上。进一步用NS5B免疫荧光染色和G418抗性集落形成实验分析发现, 超过98%的细胞没有持续存在的HCV复制子。表明绝大多数细胞已“清除”了HCV复制子, 提示RNAi不仅可抑制HCV, 还可能成为彻底清除慢性HCV感染的有力工具。

3 RNAi技术

针对病毒治疗中, 关键点是siRNA的设计、合成及有效地导入细胞。研究发现, 小于30bp的dsRNA才可以引起基因沉默, 而抑制作用最强的是长21bp, 3′端有2个碱基突出的siRNA[10]。由于RNA干扰的特异性, 所设计的siRNA, 必须与靶序列有高度的同源性。一般来说, 所选择的目的序列应在翻译区的起始密码子下游。近来发现, 不仅翻译区序列 (外显子) 可以产生RNAi, 而且RNAi也作用于5′非翻译区或3′非翻译区[11]。对于选定的每个基因序列, 选择4～5个siRNA序列, 通过同源性比较, 选出特异性最强的siRNA进行合成。siRNA的合成有体外合成和体内合成。体外化学合成及酶合成的dsRNA可用脂质体导入细胞中, 但效果较差, 转移到细胞内的dsRNA的半衰期短[12]。现有许多公司提供的RNAi试剂盒可自行设计合成多个siRNA, 通过专用的RNA转染试剂, 瞬时转染可将这些siRNA转入细胞进行实验。目前广泛应用的是体内合成法, 通过一种载体合成并将dsRNA转染入细胞, 大大削减了实验成本, 增加了实验的可操作性。所用载体可以是包含RNA聚合酶Ⅲ启动子[13]或U6启动子或T7启动子及一个终止位点的质粒载体, 将编码的一小段对应目的基因特异序列的、其RNA能形成回文结构的DNA序列插入启动子下游, 转入哺乳动物细胞, 载体就能表达出发夹结构shRNA (small hairpin RNAs) , 其很快在细胞中加工成类似siRNA分子, 引发RNA干扰。由于质粒介导的RNAi多以瞬时表达为主, 且转染率不稳定。因此, 逆转录病毒和腺相关病毒也被用作载体, 所介导的siRNA的合成更快、一致、稳定且转染率高。

4 RNAi技术展望

RNAi研究虽然只有短短几年, 其进展速度却是惊人的。在抗病毒研究中为人们开辟了一个全新的领域。作为功能基因组学研究的强有力的工具, 显示了巨大的应用潜力。作为一个抗病毒研究的新平台, RNAi给人们最终占胜所谓“不治之症”带来了新的希望。

摘要：RNAi是一种广泛存在于生物体内的由dsRNA所诱导的特定序列基因沉默机制。dsRNA的效应产物siRNA与靶序列之间通过严格的碱基配对, 特异性结合于靶序列mRNA并使之降解, 从而快速阻断特异基因的表达。RNAi技术在抗病毒领域的快速兴起, 为抗病毒研究带来了新的变革。

篇7：RNAi技术在动物功能基因组研究中的应用

1 基因芯片技术概述

基因芯片主要应用于基因诊断, 还用于基因表达的研究, 多态性分析、核酸测序后基因组研究等。目前, 包括细菌、酵母菌等许多微生物的基因组序列已基本完成, 为基因组功能分析提供了一个切入点, 核苷酸芯片为平行研究大量基因组信息与功能提供了有利的工具。高密度寡核苷酸芯片与DNA杂交只用单一杂交步骤实现了大量序列的鉴定, 迅速敏感地监测基因表达, 完成染色体DNA序列的多态性与单核苷酸多态性定位检测, 并对小片段缺失和插入进行分析。该技术的出现使得同时分析数以千计的DNA序列成为可能, 对于基因与基因组研究和诊断而言, 具有重要的划时代意义[2]。

2 基因芯片的基本原理

基因芯片的制作技术主要包括四个步骤, 即芯片制备, 样品制备, 杂交反应, 信号检测和结果分析。是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面, 微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针, 然后再与芯片上寡核苷酸点杂交, 最后通过扫描仪定量好分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物[3]。该技术可检测各种介质中的微生物, 研究复杂微生物群体的基因表达。与传统的细菌培养、生化鉴定、血清分型等检测方法相比, 基因芯片可以实现微生物的高通量和并行检测;一次实验即可得出全部结果;操作简便快速, 整个检测只需9h基本可以出结果;特异性强, 敏感性高。

3 基因芯片技术在微生物检测中的应用

3.1 在食源性致病微生物检测中的应用

细菌、病毒和真菌等微生物是引起食品安全问题的重要危害因素, 严重威胁人类的健康。目前传统食源性微生物的检测方法主要包括前增菌培养、分离、生化鉴定和血清型鉴定等程序, 但过程繁琐, 而且操作相对独立, 很难及时、高通量的对食品进行检测。基因芯片技术可以对食品中的致病菌实行高通量和并行检测, 一次实验即可得出全部的检测结果, 且操作简单快捷、特异性强并且敏感性高, 整个检测在几个小时内即可得到检测结果。预计基因芯片检测食源性致病微生物技术将广泛应用于出人境检验检疫、食品质量控制、突发食品安全事件检测, 将为食品安全提供更有力的技术保障。

3.2 在传染性致病微生物检测中的应用

SARS冠状病毒在2003年曾在世界范围内流行, 当时由其引起的严重急性呼吸综合征病死率高, 虽然现在具有多种血清学和分子生物学技术用于病原体检测, 如:ELISA、IFA等, 但是没有任何方法能够在感染早期确认好排除SARS—Co V的感染。清华大学联合中国军事医学科学研究所研制的70—mer基因芯片对SARS—Co V进行早期检测, 他们试验证实了基于基因芯片的分子生物学检测方法对于SARS—Co V的检测是具有高度特异性而且可用于早期的检测。他们的结果证实基于基因芯片的分子检测技术对SARS—Co V的检测是具有特异性的, 而且对SARS病人的血清的检测率比单独PCR检测高8%。

3.3 在环境微生物群落分析中的应用

微生物的生态多样性在各种生态系统的功能和持续都起着综合的、独特的作用, 因而关系到地球在物质平衡、大气构成、地质形成等方面的变化, 如微生物所进行的反硝化作用使土壤、海洋的氮预算失去平衡, 所形成的中间产物NO和N:O的积累则是全球气候变暖和臭氧层的破坏的主要原因之一。另外, 微生物在环境的生物治理中有着极为重要的作用。所以弄清楚微生物群落的组成、结构和功能, 它们对毒素污染、气候变化、农业和工业活动等环境变化的反应和适应, 对于持续和恢复理想的尘态功能是非常必要的。然而, 仅有小于1%的微生物能人为培养, 微生物群落的定性和对其在自然环境中的种群的检测是长期困扰着微生物学家和生态学家的一大难题。现已表明基因芯片技术是研究环境微生物群落的一种强有力的研究工具, 同时也是研究原核和真核生物基因多态性的极好方法。与传统的以膜为基础的杂交方法比较, 以载玻片为支撑物的基因芯片技术具有高密度、快速检测、基于多荧光素标记的平行检测等多种优势, 并且还有相对成本低、自动化、低背景噪音等特点。可以预计, 基因芯片将是研究微生物群落的一种潜在有力的方法。

3.4 在微生物菌种鉴定中的应用

利用基因芯片杂交图像进行细菌基因分型与菌种鉴定, 筛选监测细菌抗药性基因。应用分枝杆菌基因芯片进行基因分型与菌种鉴定, 筛选监测结核分枝杆菌利福平抗药性基因突变。Gingeras等利用rpob寡核苷酸芯片技术与常规双脱氧核苷酸测序方法分析了10种分枝杆菌种间与种内的序列多样性, 并确证了几种特异性单碱基多态性。利用基因芯片技术可以对细菌基因组多个基因表达同时进行定量分析, 为了解细菌调节网络, 研究细菌对环境信号或药物的反应, 研究细菌侵袭力的发生提供了一种直接、高效的检测方法。

基因芯片技术作为一种新技术, 具有高通量、快速、灵敏的优点, 可以同时平行检测大量样本。人类基因计划的完成和各种病原微生物基因组测序分析使得在分子水平对病原体进行检测和致病机理的研究成为可能, 因此基因芯片的研发会更加实用广泛, 将为为本世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命。

参考文献

[1]徐炳森, 邵建忠.几种新型生物芯片的研究进展[J].生物化学与生物物理进展, 2000, 27 (3) :251-254.

[2]王志存, 葛长荣.基因芯片技术在病原性食品微生物检测中的应用[J].肉类工业, 2006 (12) :56.